Статус Проект

Статус Проект Порядок розслідування, обліку і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. Інструкція

ЗАТВЕРДЖЕНО Наказ МОЗ України від 2004 р. № 4. Гігієна харчування 4.9. Стан здоров`я населення пов`язаного з харчуванням ПОРЯДОК РОЗСЛІДУВАННЯ ОБЛІКУ І ПРОВЕДЕННЯ ЛАБОРАТОРНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ У ВИПАДКАХ ХАРЧОВИХ ОТРУЄНЬ ІНСТРУКЦІЯ І 4.4.9. - 2004 Галузь застосування Ця Інструкція призначена для закладів підприємств установ організацій та посадових осіб державної санітарно-епідеміологічної служби у їх діяльності що спрямована на встановлення причин і прийняття необхідних заходів щодо ліквідації харчових отруєнь та їх профілактики а також для закладів та установ охорони здоров’я незалежно від форм власності та підпорядкування. Може використовуватись суб’єктами підприємницької діяльності що займаються медичною практикою юридичними і фізичними особами незалежно від форм власності Контроль за виконанням вимог цієї Інструкції здійснюють компетентні органи. Видання офіційне © Міністерство охорони здоров’я України Державна санепідслужба Ця Інструкція не може бути повністю або частково відтворена тиражована і поширена без дозволу Головного державного санітарного лікаря України ЗАТВЕРДЖЕНО Наказ МОЗ України від 2004 р. № 1. Загальні положення 1.1. В даній Інструкції подана характеристика та робоча класифікація харчових отруєнь додаток 15 і встановлені єдині вимоги щодо розслідування обліку реєстрації і проведення лабораторних досліджень у випадках харчових отруєнь. 1.2. Вимоги цієї Інструкції повинні враховуватись при складанні функціональних обов’язків та посадових інструкцій для фахівців установ і закладів державної санепідслужби лікувально-профілактичних та інших медичних закладів. 1.3. Інструкція призначена для закладів підприємств установ організацій та посадових осіб державної санітарно-епідеміологічної служби у їх діяльності що спрямована на встановлення причин і прийняття необхідних заходів з метою ліквідації харчових отруєнь та їх профілактики а також для фахівців лікувально-профілактичних та інших медичних закладів юридичних і фізичних осіб незалежно від форм власності. 2. Загальні вимоги до організації розслідування 2.1. 3 метою встановлення причин виникнення і прийняття необхідних заходів для ліквідації харчових отруєнь та їх профілактики кожний випадок харчового отруєння підлягає обов’язковому розслідуванню і обліку органами та установами санітарно-епідеміологічної служби. За необхідності головний державний санітарний лікар видає наказ де визначає фахівців що проводять розслідування здійснення відповідних заходів терміні подання узагальнених матеріалів тощо. 2.2. Кожен лікар або середній медичний працівник які запідозрили або встановили харчове отруєння і надали медичну допомогу потерпілим повинні: 2.2.1. Негайно повідомити про харчове отруєння територіальну установу державної санітарно-епідеміологічної служби екстреним повідомленням за формою №058/0 затвердженого наказом МОЗ України від 29.12.2000 року №369 телефоном факсом електронною поштою нарочним тощо. Примітка. При заповненні п. 8 екстреного повідомлення “Місце госпіталізації” вказувати адресу лікувально-профілактичного закладу. 2.2.2. При можливості у межах своїх повноважень вилучити залишки підозрюваних продуктів харчування у вогнищі негайно прийняти заходи щодо заборони її вживання і забезпечити збереження зразків підозрюваних продуктів у відповідних умовах до направлення в територіальну СЕС додаток 11 . Примітка. На даному етапі коли ще не встановлена етіологічна причина захворювання дії медичного працівника обумовлюються не визначеною епідемічною ситуацією тому слід негайно як і у випадку гострої кишкової інфекції впроваджувати заходи спрямовані на попередження подальшого розповсюдження захворювання. 2.2.3. Обов'язково зібрати блювотні маси промивні води випорожнення і сечу потерпілих а за наявності показань див. далі – відібрати кров і направити їх на дослідження в лабораторію санітарно-епідеміологічної станції або зберігати їх на холоді до прибуття санітарного лікаря додаток 11 . 2.2.4. В лікувально-профілактичних та оздоровчих закладах в першу чергу на станціях швидкої медичної допомоги а також здоровпунктах тощо необхідно мати запас стерильного та іншого спеціального посуду. За відсутності стерильного посуду використовують ретельно вимитий скляний посуд який перед використанням слід прокип'ятити. 2.3. Лікувально-профілактичні заклади в яких надається допомога хворим з харчовими отруєннями повинні відповідати спеціальним вимогам в залежності від виду харчового отруєння та його клінічних проявів Додаток № 10 . 2.4. Харчові отруєння що виникли на підприємствах системи водного залізничного транспорту цивільної авіації МВС тощо розслідуються за належністю фахівцями санітарно-епідеміологічної служби водного залізничного повітряного транспорту об’єктів з особливим режимом роботи центральних органів виконавчої влади в галузі оборони внутрішніх справ у справах охорони державного кордону з питань виконання покарань Державного лікувально-оздоровчого управління Служби безпеки України і підлягають відповідному обліку. 3. Проведення санітарно-епідеміологічного розслідування 3.1. Розслідування харчових отруєнь необхідно проводити негайно після отримання екстреного повідомлення. Загальна схема розслідування спалаху харчового отруєння надана у додатку 7. 3.2. За дорученням головного державного санітарного лікаря розслідування проводить в першу чергу санітарний лікар з гігієни харчування чи інші профільні спеціалісти державної санепідслужби у залежності від об’єкту на якому виникло або з яким пов’язане захворювання та/або специфіки захворювання. 3.3. Обстеження осередку з причини виникнення поодиноких випадків захворювання у побуті з діагнозом "харчове отруєння" "харчова токсикоінфекція" "харчова інтоксикація" який поставлений лікарем тільки за клінічними симптомами не пов'язаних з підозрою на ботулізм або з летальним кінцем проводяться лікарями-епідеміологами нарівні з випадками гострих кишкових інфекційних захворювань. За необхідності що з'явилась у процесі епідеміологічного обстеження вогнища до розслідування залучається санітарний лікар з гігієни харчування або інший профільний фахівець. Якщо при цьому діагноз харчового отруєння підтверджується і кількість потерпілих складає 3 і більше осіб за виключенням ботулізму і отруєння грибами випадок належить розслідуванню та обліку як харчове отруєння. 3.4. В необхідних випадках до участі у розслідуванні і ліквідації харчових отруєнь залучаються спеціалісти: епідеміологи мікробіологи хіміки токсикологи санітарні лікарі інших установ державної санепідслужби відомчі санітарні лікарі фахівці науково-дослідних інститутів і кафедр клініцисти працівники ветеринарної медицини технологи та інші в залежності від специфіки та масовості захворювання. Санітарний лікар під час розслідування харчового отруєння зобов'язаний: 3.5. Встановити загальну картину виникнення захворювання і уточнити клінічні симптоми для чого: * встановити зв'язок з медичним працівником і закладом що надав першу медичну допомогу і з’ясувати кількість вік потерпілих місце час і обставини виникнення захворювання його клінічні симптоми а також з’ясувати які заходи вжиті для попередження його подальшого поширення; * ознайомитись з медичною документацією заведеною на потерпілих і записами у реєстраційних журналах як в установах що надали першу медичну допомогу так і в місцях госпіталізації потерпілих; * опитати потерпілих в лікувально-профілактичному закладі за місцем роботи чи вдома з метою уточнення симптомів захворювання див. схему опитування у додатках 1 2 . До опитування потерпілих можуть залучатись фахівці установи державної санепідслужби які мають відповідну підготовку. * спільно з лікарями-кураторами ретельно проаналізувати усі деталі клінічної картини захворювання з урахуванням первинних симптомів перебігу та кінця хвороби. Під час аналізу слід виключити захворювання іншої етіології які за окремими ознаками нудота блювання біль у животі пронос неврологічні та судинні прояви тощо схожі на харчові отруєння мікробної або немікробної природи див. орієнтовні дані для диференційного аналізу у додатках 3 та 4 . 3.6. Виявити продукт загальний для усіх потерпілих для чого провести опитування захворілих та не захворілих і з'ясувати: * де і яку їжу вживали потерпілі протягом двох – трьох діб до початку захворювання крім підозри на ботулізм де анамнез потрібно зібрати не менше як за 7 діб а в деяких випадках і більше * чи є аналогічні захворювання серед членів їх сімей і де вони харчувались; * скільки часу пройшло з моменту вживання підозрюваної їжі до появи перших ознак захворювання див. схему опитування у додатках 1 5 6 . 3.6.1. Шляхом зіставлення отриманих за схемами опитування додатки 1 2 3 4 5 6 даних встановлюють загальні для потерпілих: інкубаційний латентний період клінічні симптоми захворювання харчовий продукт. 3.7. Організувати проведення лабораторних досліджень для чого: * перевірити які матеріали вже були відібрані і направлені в лабораторію для досліджень; чи правильно необхідні матеріали були відібрані медичним працівником який надав першу медичну допомогу потерпілим. У випадку якщо ці заходи не були проведені – відібрати і направити в лабораторію підозрювані продукти кал блювотні маси промивні води сечу захворілих. За наявності показань організувати через медичну установу де надається перша медична допомога потерпілим забір та направлення в лабораторію крові потерпілих для посіву на гемокультуру і серологічні або токсикологічні дослідження; * відбір проб для лабораторного дослідження санітарний лікар може здійснювати сам або з працівниками лабораторії бактеріологами вірусологами хіміками токсикологами в залежності від конкретної ситуації; * забраний матеріал направляють нарочним до лабораторії санепідустанови району міста області або України; * за необхідністю до проведення лабораторних досліджень залучають відповідні за профілем науково-дослідні інститути а також спеціальні лабораторії. Наприклад при необхідності визначення алкалоїдів дослідження доцільно доручити лабораторії судово-медичної експертизи для визначення виду грибів – мікологічній лабораторії тощо; * у летальному випадку приймають до уваги результати патолого-анатомічного розтину і проводять лабораторні дослідження бактеріологічні вірусологічні хімічні токсикологічні секційного матеріалу; * під час відбору проб і визначення мети їх дослідження в лабораторії санітарний лікар повинен виходити з конкретних даних розслідування. Недоцільно наприклад доставляти в бактеріологічну лабораторію продукти які за своєю природою є несприятливими для розвитку мікроорганізмів сіль цукор тощо навіть якщо підозрюється харчове отруєння мікробного походження. У цьому випадку недоцільно також направляти проби для визначення вмісту пестицидів токсичних елементів тощо. Проте визначення таких фізико-хімічних показників які безпосередньо впливають на можливість розвитку мікроорганізмів у харчових продуктах вологість консистенція рН вміст солі цукру консервантів фосфатази тощо надасть можливість більш чітко усвідомити причини виникнення такого захворювання; * у разі наявності очевидного свідчення про отруєння токсичними речовинами немікробного походження немає потреби направляти матеріали в бактеріологічну лабораторію якщо не підозрюється виникнення отруєння змішаної природи. 3.7.1. На підставі результатів аналізу клінічних симптомів захворювання і визначення продукту загального для всіх потерплих санітарний лікар спільно з фахівцями лабораторії визначають обсяг напрямок і мету лабораторних досліджень. Примітка. Оперативно і правильно відібраний у достатньому обсязі первинний матеріал для досліджень є запорукою своєчасного і об'єктивного підтвердження причини виникнення захворювання. 3.7.2. Відбір проб з об’єктів довкілля оформлюється актами за формами №323/0 “Акт відбору проб води” №342/0 “Акт відбору проб харчових продуктів” №344/0 “Акт відбору кулінарних виробів” №337/0 “Акт відбору виробів посуду іграшок будівельних матеріалів одягу тощо із полімерних та інших матеріалів для проведення досліджень” затв. Наказом МОЗ України від 11.07.2000 №160. Направлення до лабораторії оформлюються за формою №205/0 “Направлення на санітарно-мікробіологічне дослідження” затв. Наказом МОЗ України від 04.01.01 №1. 3.7.3. При проведенні оцінки результатів мікробіологічних досліджень приймають до уваги допустимі нормативи щодо наявності БГКП МАФАМ та інших мікроорганізмів у харчових продуктах що визначені у відповідній нормативній документації. 3.7.4. Аналізуючи результати хімічних і токсикологічних досліджень слід враховувати: а природний вміст токсичних речовин у харчових продуктах додаток 8 ; б гранично-допустимі рівні токсичних речовин у харчових продуктах; в допустимі сторонні домішки у харчових продуктах; г максимально допустимі рівні харчових добавок у харчових продуктах. 3.8. Провести обстеження об'єкту з яким пов'язано харчове отруєння і скласти акт перевірки дотримання санітарного законодавства ф. № 393/о затв. наказом МОЗ України від 14.04.95 № 64 . При цьому необхідно: * звернути особливу увагу на рецептури технологічні інструкції асортимент меню і розкладки до них тощо як правило за 3 дні до початку захворювання супровідні документи на сировину і готову продукцію записи у технологічних бракеражних облікових та інших журналах ведення яких передбачено на даному об’єкті тощо . Дані що отримані зіставляються з результатами особистого опитування потерпілих та працівників об’єкту з яких за їх згодою доцільно отримати пояснювальні записки. Отримані відомості співвідносяться з даними про підозрюваний спільно вживаний для всіх потерпілих харчовий продукт; * вилучити залишки підозрюваного харчового продукту страви і заборонити його реалізацію відповідно до Порядку вилучення з обігу неякісних та небезпечних для здоров’я продуктів харчування продовольчої сировини та супутніх матеріалів продовольчої продукції . * організувати обстеження об'єктів на усіх етапах руху підозрюваної продукції від виготовлювача до споживача . Приклад : * затримати подальший рух виробництво транспортування реалізацію чи вживання підозрюваного продукту і направити зразки в лабораторію установи державної санепідслужби; * фахівець що проводить розслідування негайно повинен встановити всі місця об’єкти куди постачалася продукція яким видом транспорту за якої температури у якому вигляді яким маршрутом тощо. При складанні списку об’єктів в які постачалася продукція необхідно зазначати адресу об’єкта та кількість продукції що поставлена а також кількість продукції що вже реалізована. Якщо продукція реалізовувалася централізовано дитячий заклад підприємство для обслуговування банкетів тощо вказати адресу поставок. Тобто визначити маршрути пересування продукції від виробника до споживача вказуючи адреси об’єктів та кількість продукції що отримана і реалізована. Залишки підозрюваної продукції що не реалізована повинні бути вилучені з реалізації у встановленому порядку; * з‘ясувати які санітарні умови та технологічний режим супроводжували виготовлення та реалізацію підозрюваного продукту. Під час обстеження об’єкту обов’язково враховуються три основні позиції: а наявність умов для дотримання санітарного протиепідемічного та технологічного режимів під час виготовлення зберігання та реалізації продукції; б володіння персоналом відповідними знаннями щодо виконання санітарно-протиепідемічних і технологічних правил; в реальний рівень виконання санітарно-протиепідемічних і технологічних вимог персоналом об'єкту. Примітка: Не завжди вдається відразу з’ясувати конкретні умови що сприяли контамінації та накопиченню мікроорганізмів чи токсинів у харчовому продукті проте санітарний лікар мусить виходити з того що сам факт виникнення отруєння є доказом того що певні порушення санітарно-протиепідемічного або технологічного режимів що призвели до проникнення і розмноження збудників у їжі мали місце. Якщо підозрюваний продукт виготовлено в іншому районі місті області то територіальна установа держсанепідслужби негайно повідомляє про захворювання у встановленому порядку вищу інстанцію державної санітарно-епідеміологічної служби для організації на місцях необхідних заходів. Надалі територіальна установа державної санепідслужби що веде розслідування сповіщає відповідні установи держсанепідслужби про хід розслідування і прийняті заходи на місці виникнення захворювань. Інформована сторона також повинна повідомити про вжиті заходи та їх результати. Повідомлення про зв'язок захворювання з продукцією що завезена з інших країн негайно у встановленому порядку направляється до Міністерства охорони здоров'я України Подальше розслідування проводиться у такій послідовності: 3.9. Виявлення умов що сприяли розмноженню і накопиченню мікробів і токсинів у харчовому продукті для чого: а в першу чергу з'ясувати термін зберігання і або реалізації підозрюваного продукту з часу його виготовлення: тобто вивчити та проаналізувати відповідну документацію якісні посвідчення накладні забірні листи меню-розкладки тощо ; перевірити та оглянути залишки сировини і готової продукції; опитати працівників харчового об'єкту які отримували сировину виробляли з неї харчові продукти чи готували страви і реалізували їх взяти з них пояснювальні записки; опитати потерпілих. Зіставити між собою отриману інформацію; б встановити температурні режими за яких реально виготовлялася зберігалася і реалізувалася продукція до моменту її вживання потерпілими. Для цього необхідно перевірити наявність необхідного холодильного та технологічного обладнання оцінити його відповідність виробничій потужності об’єкту та асортименту що виробляється а також його справність та ефективність роботи. Якщо підозрюваним продуктом є гаряча страва приділити особливу увагу тепловому обладнанню наявність жарочних шаф котлів тощо а також дотриманню технологічного процесу виготовлення страви . Також необхідно з’ясувати чи не виникали перебої у постачанні енергоносіїв відключення джерел енергопостачання аварії або перевантаження холодильних ємностей і використання їх не за призначенням. Перевірити журнали реєстрації аварійних ситуацій та необхідну технічно-експлуатаційну документацію. Під час перевірки об’єкту доцільно використовувати методи інструментального дослідження для визначення температури повітряного середовища в холодильних камерах шафах вітринах температури готових страв на протязі їх реалізації тощо. Зібрати свідчення потерпілих про якість та температуру підозрюваної їжі. При цьому другі страви наприклад слід оцінювати окремо за їх складовими частинами: м'ясний компонент гарнір соус тощо так як вони можуть бути виготовлені у різні терміни і мати різну температуру на роздачі. Примітка: Необхідно враховувати що харчові продукти що спричинили отруєння практично не відрізняються за органолептичними властивостями від доброякісних і тому вживалися в їжу без усякого сумніву. Думка потерпілих про те що вони отруїлись певним продуктом який мав якісь органолептичні вади наприклад неприємний запах колір смак на практиці частіше усього не підтверджується лабораторно; в перевірити дотримання затверджених рецептур технологічних схем та ін. у процесі виготовлення підозрюваного продукту вміст води цукру солі консервантів кислот тощо . На перших етапах розслідування відповідні розрахунки проводяться за наявною документацією а надалі підтверджуються лабораторними дослідженнями. 3.10. Визначення ефективності теплової обробки продукту для чого: а перевірити наявність умов для стабільного дотримання температурних режимів під час приготування продукту у відповідності з технологічними інструкціями та санітарними правилами і реальне виконання цих режимів; б перевірити якість теплової обробки продукту за допомогою інструментальних і лабораторних методів термометрія реакція на пероксидазу фосфатазу мікробіологічні дослідження ; при наявності терморегулюючих і термореєструючих приладів оцінити їх справність та показання на термограмах; в якщо страва в об'єкті громадського харчування торгівлі або в домашніх умовах не була повністю реалізована у день виготовлення – з’ясувати умови її зберігання та режим теплової обробки при повторній реалізації. Примітка: на харчоблоках що обслуговують організовані колективи дитячі установи учбові лікувально-профілактичні та оздоровчі заклади підприємства тощо де залишки страв не дозволяється використовувати наступного дня саме порушення цього правила є основною причиною виникнення харчових отруєнь через те що свіжопроварена чи свіжопросмажена страва як правило харчові отруєння мікробної природи не викликає. 3.11. Виявлення факторів що сприяли контамінації продукції мікроорганізмами чи іншими чужорідними речовинами для чого: а з'ясувати шляхи надходження сировини на харчовий об'єкт і ознайомитись з супровідними документами якісні посвідчення сертифікати ветеринарні свідоцтва тощо на сировину; б з'ясувати умови транспортування приймання зберігання і видачі до виробництва сировини напівфабрикатів та інших компонентів їжі стан транспортної і споживчої тари упаковок складських приміщень холодильних камер а також дотримання принципу допустимого товарного сусідства на усіх етапах їх надходження і зберігання; в перевірити санітарно-технічний стан підприємства: розташування кількість достатність і розміри складських і виробничих приміщень розташування та стан технологічного обладнання його необхідний набір і кількість дотримання принципу поточності технологічних процесів і принципу маркування технологічного обладнання інвентарю скупченість персоналу стан водопостачання каналізування освітлення вентиляції тощо ; г оцінити повноту та ретельність виконання технологічних інструкцій щодо виготовлення харчових продуктів; д перевірити дотримання правил санітарної обробки миття та дезинфекції усього обладнання інвентарю тари – з цією метою відібрати змиви за ходом технологічного процесу для мікробіологічної оцінки якості санітарної обробки на окремих етапах виробництва відмітити наявність миючих та дезінфікуючих засобів умови їх зберігання та застосування; е оцінити рівень санітарної грамотності та дотримання правил особистої гігієни працівниками об'єкту; ж дати оцінку відповідності виробленої кількості та асортименту харчових продуктів проектній потужності та реальним можливостям даного об'єкту визначивши чи можливе було таке виготовлення без загрози порушень санітарних норм і правил протиепідемічного режиму та технологічних вимог; з за необхідності у відповідних працівників виробництва взяти пояснювальні записки. 3.12. Встановити джерело та причини контамінації підозрюваного продукту збудниками харчових отруєнь для чого: а ознайомитись із станом захворюваності персоналу об'єкта на інфекційні хвороби а також результатами обов'язкових профілактичних медичних оглядів даними лабораторних функціональних та інших досліджень персоналу результатами огляду шкірних покровів на наявність гнійничкових захворювань; з'ясувати причини неявки працівників на роботу якщо це було зафіксовано наявність у родинах персоналу хворих на гострі кишкові та інші інфекції перевірити наявність особистих медичних книжок та дотримання правил проходження медичних оглядів тощо; б організувати клінічне та лабораторне обстеження персоналу об'єкту з метою виявлення хворих та носіїв збудників захворювань; в перевірити умови доставки і дотримання правил приймання сировини напівфабрикатів та супутніх матеріалів; наявність клейма на м'ясі ветеринарних свідоцтв сертифікатів довідок про стан захворюваності тварин у господарствах про строки та умови застосування пестицидів та інших документів що підтверджують безпечність прийнятих продовольчих товарів; г оцінити систему водопостачання та якість води на об’єкті; д звернути увагу на присутність домашніх тварин котів собак гризунів і комах на об‘єкті і оцінити стан дератизаційних та дезінсекційних заходів; за необхідності організувати бактеріологічне дослідження матеріалу від тварин і гризунів; е з метою встановлення причин контамінації підозрюваного продукту організувати забір змивів зшкребків мазків з сировини овочі м'ясо тощо з обладнання інвентарю і тари за ходом технологічного процесу одягу рук шкіри слизових оболонок персоналу а також проб повітря виробничих цехів і води для проведення лабораторних досліджень мікробіологічних фізико-хімічних токсикологічних спеціальних тощо . Після отримання всієї необхідної інформації стосовно об”єкта вона зіставляється з об”ємно-планувальними особливостями підприємства станом мереж водо- електро- паро- тепло- постачання каналізації вентиляції ланцюгом технологічного процесу тощо з метою отримання загальної картини виникнення захворювання окреслення конкретного етапу контамінації продукції і причин що її викликали. 3.13. Після закінчення обстеження об’єкту та вивчення відповідних матеріалів складається акт перевірки дотримання санітарного законодавства за ф. № 393/о. Під час обстеження об'єкту санітарний лікар приймає оперативні рішення і впроваджує заходи відповідно до санітарного та адміністративно-правового законодавства: а застосовує на об’єкті адміністративно-запобіжні заходи обмеження тимчасова заборона заборона припинення зупинення ; б негайно відсторонює від роботи або іншої діяльності осіб які могли бути джерелом обсіменіння харчових продуктів; в вилучає з обігу небезпечні для здоров’я продукти харчування продовольчу сировину супутні матеріали; в пропонує і контролює проведення необхідних санітарно-протиепідемічних заходів; г складає протокол для накладання штрафу за порушення санітарного законодавства і готує відповідну постанову; д за необхідності готує матеріали розслідування спалаху для передачі їх в слідчі органи; е застосовує фінансові санкції за порушення санітарного законодавства. ж за необхідності застосовує заходи щодо зупинення або припинення інвестиційної діяльності. 3.14. Після закінчення санітарно-епідеміологічного розслідування отримання усіх результатів лабораторних досліджень і аналізу матеріалів робиться висновок про характер та причини захворювання і складається акт розслідування харчового отруєння додаток 9 . 4. Сповіщення і подання матеріалів розслідування 4.1. Санітарно-епідеміологічні станції повинні повідомляти вищі інстанції державної санітарно-епідеміологічної служби про випадки харчових отруєнь та гострих кишкових інфекцій. 4.2. Порядок подання позачергових повідомлень визначений наказом МОЗ України від 23.05.2002 року № 190 “Про надання позачергових повідомлень Міністерству охорони здоров’я України” Вища інстанція державної санітарно-епідеміологічної служби повідомляється про випадок харчового отруєнні з кількістю потерпілих більше 3 осіб протягом 24 годин з часу отримання екстреного повідомлення. 4.3. Центральна санепідстанція МОЗ України Кримська Республіканська санепідстанція обласні міські районні та районні в містах центральні санепідстанції на водному залізничному і повітряному транспорту санепідстанції міністерств і відомств отримавши відповідну інформацію надають необхідну допомогу територіальній установі державної санепідслужби за місцем виникнення захворювання. 4.4. Вища інстанція державної санітарно-епідеміологічної служби повинна негайно ознайомитися з донесеннями і у випадку необхідності терміново повідомити СЕС яка їх направила свої зауваження і вимоги про додаткові відомості які мають бути представлені негайно. 4.5. Якщо при проведенні розслідування харчове отруєння не підтвердилося про це негайно повідомляють вищі інстанції державної санепідслужби. 4.6. У випадку коли при проведенні розслідування харчового отруєння було встановлено що на продукцію харчовий продукт продовольча сировина супутні матеріали обладнання тощо яка спричинила виникнення отруєння видано позитивний Висновок державної санітарно-епідеміологічної експертизи то про встановлений факт негайно повідомляється МОЗ України і Головним державним санітарним лікарем України призначається повторна державна санітарно-епідеміологічна експертиза що підтверджує або визначає недійсним результат попередньої експертизи. У випадку коли Висновок державної санітарно-епідеміологічної експертизи визнається недійсним про це інформуються установи та заклади державної санепідслужби а також при необхідності відповідні контролюючі органи Держспоживстандарт митна служба служба веретинарної медицини та інші за належністю . 4.7. По завершенню розслідування харчового отруєння відповідні матеріали акти результати лабораторних досліджень донесення пояснювальні записки працівників харчових об`єктів тощо направляють в установленому порядку до вищої інстанції санітарно-епідеміологічної служби не пізніше 30 діб з дня виникнення харчового отруєння або у терміні що визначаються відповідним наказом головного державного санітарного лікаря. 5. Реєстрація та облік 5.1. Екстрені повідомлення реєструються в Журналі реєстрації екстрених повідомлень про харчові та професійні отруєння ф. 361/0 затв. наказом МОЗ України від 11.07.2000 р. № 160 . 5.2 Кожний підтверджений розслідуванням випадок харчового отруєння в тому числі і побутові з кількістю потерпілих менше 5-ти осіб і легким перебігом захворювання підлягає обліку в Журналі реєстрації харчових отруєнь ф. 360/0 затв. наказом МОЗ України від 11.07.2000 р. № 160 . 5.3. Журнали мають бути прошнуровані сторінки пронумеровані і скріплені печаткою та підписом головного лікаря установи держсанепідслужби. 6. Звітність 6.1. Дані про харчові отруєння вносяться до форми № 18 річна державної статистичної звітності таблиця № 9 6.2. У пояснювальній записці до форми надається аналіз харчових отруєнь за звітний період а також прийняті у цих випадках заходи та санкції результати справ переданих у прокуратуру тощо . 6.3. В аналізі відображають причини отруєнь та їх зв’язок з окремими видами продуктів. Випадки отруєнь що пов’язані з підприємствами і установами а також що виникли в домашніх умовах аналізують окремо. 6.4. На основі представлених матеріалів МОЗ України складає аналіз харчових отруєнь за звітний рік. 7. Відповідальність 7.1. Фахівці органів установ і закладів державної санепідслужби закладів та установ охорони здоров’я незалежно від форми власності та підпорядкування несуть відповідальність за своєчасність та об’єктивність проведення розслідування спалаху та прийняття відповідних заходів. 7.2. Суб'єкти підприємницької діяльності – фізичні та юридичні особи усіх форм власності які займаються розробленням виробництвом транспортуванням зберіганням ввезенням а також реалізацією використанням утилізацією або знищенням харчових продуктів і продовольчої сировини зобов'язані відшкодовувати споживачам шкоду заподіяну внаслідок порушення законодавства України про якість та безпеку харчових продуктів і продовольчої сировини. 7.3. У разі якщо епідемія чи спалах захворювання виникли з вини встановленої юридичної або фізичної особи витрати з Державного бюджету України та місцевих бюджетів на локалізацію та ліквідацію зазначених епідемії чи спалаху інфекційної хвороби можуть бути відшкодовані за рахунок винної особи в порядку встановленому законом. 8. МЕТОДИ МІКРОБІОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ 8.1. Загальні положення 1. При проведенні мікробіологічних досліджень під час розслідування харчових отруєнь обов’язковою умовою є комплексно паралельне дослідження матеріалів від потерпілих осіб що можуть розглядатися як можливе джерело зараження продуктів та сировини що підозрюється та об’єктів довкілля. 2. Для уніфікації досліджень порівнянності результатів доцільно в процесі роботи використовувати поживні середовища системи для ідентифікації мікроорганізмів промислового виготовлення. 3. Хід досліджень повинен бути таким щоб максимально прискорити видачу відповіді. При цьому використовують усі доступні методи експрес та прискореної діагностики включаючи молекулярно-генетичні. 4. При одночасному направленні зразків і проведенні досліджень у двох лабораторіях для одержання порівняльних результатів обов'язкове використання того самого методу в обох лабораторіях. 5. Культури мікроорганізмів що виділені від потерпілих носіїв та з об’єктів довкілля негайно направляються для підтвердження до СЕС вищого рівня управління Кримська республіканська обласні Київська Севастопольська міські Центральна на водному транспорті які одразу після отримання результатів направляють їх до Центральної СЕС МОЗ України для підтвердження та подальшого вивчення. При неможливості остаточної ідентифікації культур на місцях їх також негайно направляють в СЕС вищого рівня управління а ті в свою чергу у визначеному порядку в Центральну СЕС МОЗ України для ідентифікації. 6. Порядок поводження з культурами мікроорганізмів визначений “Положением о порядке учета хранения обращения отпуска и пересылки культур бактерий вирусов риккетсий грибов простейших микоплазм бактерийных токсинов ядов биологического происхождения”. 7. Результати лабораторних досліджень попередні та кінцеві видаються у встановлені терміни на офіційних бланках лабораторії що досліджувала матеріал. Терміни видачі результатів лабораторних досліджень обумовлені методиками їх проведення. 8. Вірусологічні дослідження проводяться відповідно до чинної нормативної документації на методи досліджень. 8.2. Порядок первинного посіву матеріалу що надійшов на дослідження Перший день Для дослідження щільних харчових продуктів на наявність сальмонел та шигел м’ясо ковбаса вінегрети сир тощо роблять наважки по 25 г і засівають у селенітовий бульйон по Лейфсону або магнієве середовище та у жовчний бульйон у співвідношенні 1:4 тобто на 25 г наважки беруть 100 см3 середовища збагачення. Рідкі та напіврідкі продукти молоко перші страви тощо засівають у середовища збагачення у кількості 25 см3 використовуючи селенітове та магнієве середовища подвійної концентрації. Паралельно продукти також засівають на елективні середовища Ендо Плоскірева та вісмут-сульфітний агар . Для досліджень на умовно-патогенні мікроорганізми роблять розведення харчових продуктів у 0 1% пептонній воді ПВ починаючи з 10-1 до 10-10. З розведень 10-1 до 10-8 по 0 1 см3 висівають у середовище Кеслер та на поверхню добре підсушених чашок із середовищем Ендо для дослідження на наявність ешеріхій. З розведень 10-1 до 10-6 по 0 1 см3 на середовище Плоскірева та у конденсаційну воду свіжоскошеного агару за методом Шукевича для дослідження на наявність бактерій роду Proteus. З розведень 10-3 та 10-4 по 0 1 см3 на сольовий поліміксиновий агар з 2 3 5-ТТХ для виявлення B. cereus. З розведень 10-1 до 10-6 по 0 1 см3 – на середовище Байрд-Паркер або жовточно-сольовий агар для дослідження на наявність золотистого стафілокока. З розведень 10-1 до 10-7 по 0 1 см3 – на Ентерококагар для виявлення ентерококів. Продукти моря а також кулінарні вироби з м’яса та овочів у кількості 25-30 г засівають в 100 см3 1% ПВ з 3% NaCl 1-е середовище збагачення . При цьому стерильно взяту наважку продукту твердої консистенції перед посівом гомогенізують з невеликою кількістю 1% ПВ з 3% NaCl. Співвідношення досліджуваного продукту і 1% ПВ з 3% NaCl повинно дорівнювати 1:4. Посіви з першим середовищем збагачення інкубують у термостати при 37?1 ?С 6 годин. Через 6 годин матеріал з поверхні 1-го середовища збагачення за допомогою петлі діаметром 5 мм переносять у 10 см3 ПВ з 3% NaCl 2-ге середовище збагачення і залишають до ранку при кімнатній температурі. Також роблять висів на лужний агар та бакагар Плоскірева. Паралельно нерозведені харчові продукти у співвідношенні 1:10 засівають у 6 5% і 10% сольові бульйони та 1% цукровий бульйон. При дослідженні харчових продуктів що містять великі кількості солі оселедець кільки і тощо посіви у сольові середовища не роблять. Також не роблять посіви у цукровий бульйон продуктів з великим вмістом цукру крем морозиво і тощо . Кров засівають у 10-20% жовчний бульйон або середовище Раппопорт у співвідношенні 1:10. Сечу осад після центрифугування засівають на чашки з диференційно-діагностичними середовищами та у середовища збагачення. Випорожнення блювотні маси промивні води шлунку пунктат запальних вогнищ засівають на чашки з диференційно-діагностичними середовищами та у середовища збагачення. Для виявлення сальмонел та шигел нативний матеріал сіють на середовища Ендо Плоскірева та вісмут-сульфітний агар та у селенітовий бульйон магнієве середовище жовчний бульйон у співвідношенні 1:4. Якщо випорожнення рідкі то використовують середовища збагачення подвійній концентрації. Для досліджень на наявність умовно-патогенних мікроорганізмів роблять розведення з 10-1 до 10-10. Для виявлення стафілококів матеріал висівають з 10-1 до 10-7 розведень по 2 краплі на жовточно-сольовий агар або середовище Байрд-Паркер а також нативний матеріал у 1% цукровий бульйон та 6 5% і 10% сольові бульйони у співвідношенні 1:10. Для виявлення ешеріхій висів роблять з 10-1 до 10-6 на середовище Ендо по 0 1 см3. Для виявлення бактерій роду Proteus висів роблять з 10-1 до 10-8 на середовище Плоскірева та у конденсаційну воду свіжоскошеного агару за методом Шукевича по 0 1 см3. Для виявлення B.cereus висівають по 0 3 см3 з 10-1 на три чашки середовища Нікодемуса і на три чашки кров’яного агару та по 0 1 см3 з 102 на одну чашку середовища Нікодемуса та одну чашку кров’яного агару. Для виявлення ентерококів висівають по 0 1 см3 з 10-1 до 10-5 розведень на Ентерококагар. Для дослідження на наявність патогенних вібріонів 1-2 см3 г матеріалу засівають у 50 см3 1% ПВ з 3% NaCl 1-е середовище збагачення на лужний агар та бакагар Плоскірева. Через 6 годин матеріал з поверхні 1-го середовища збагачення за допомогою петлі діаметром 5 мм переносять в 10 см3 ПВ з 3% NaCl 2-ге середовище збагачення і залишають до ранку при кімнатній температурі. Також роблять висів на лужний агар та бакагар Плоскірева. Якщо випорожнення доставлені в консерванті краплю суспензії їх наносять на поверхню твердого середовища з краю чашки і ретельно розтирають стерильним скляним шпателем по всій поверхні середовища. Дуоденальний вміст жовч засівають на чашки з диференційно-діагностичними середовищами та у флакони з м’ясо-пептонним бульйоном МПБ у співвідношенні 1:10. Рештки матеріалу поміщують у термостат разом з посівами. При дослідженні секційного матеріалу шматочки органів мезентеріальні вузли і відмиті від вмісту шматочки кишечнику ретельно подрібнюють з додаванням декількох см3 фізіологічного розчину. Після відстоювання суспензії надосадову рідину засівають піпеткою на щільні середовища й у середовища збагачення. Окремо проводять посів вмісту кишечнику і крові. Матеріал висіяний на тверді поживні середовища ретельно втирають шпателем у поверхню середовища. Всі посіви інкубують при 37?1 ?С протягом 18 – 24 год. Посіви на стафілокок та ентерокок інкубують до 48 год. при 37?1 ?С . При дослідженні щільних харчових продуктів на наявність лістерій м'ясо сири салати тощо готують наважки в кількості 25 г см3 і засівають у середовище збагачення у співвідношенні 1:5 тобто 25 г наважки на 100 см3 середовища збагачення. Як середовище збагачення можуть застосовуватись МПБ з 1% глюкози або МПБ з 1% глюкози та 2% гліцерину. Одночасно роблять посіви на поверхню добре підсушених чашок з диференційно-діагностичним середовищем – МПА з 1% глюкози та 2% гліцерину. Рідкі та напіврідкі харчові продукти молоко супи та ін. засівають у середовище збагачення у кількості 25 см3 і на диференційно-діагностичне середовище. При проведенні досліджень з метою виявлення лістерій в матеріалі від постраждалих: кров в кількості 10 см3 спинномозкову рідину в кількості 2-5 см3 засівають на середовище збагачення у співвідношенні 1:10 та на щільне диференційно-діагностичне середовище. З секційного матеріалу шматочків внутрішніх органів тварин або птахів – роблять мазки-відбитки фіксують фарбують за Граммом і мікроскопують. Матеріал розтирають у стерильний ступці з фізіологічним розчином і засіваються на середовище збагачення та диференційно-діагностичне середовище як харчові продукти. Посіви поміщають в термостат при температурі 37±1 ?С на 18 – 24 години. Кров та спинномозкову рідину витримують в термостаті протягом 3 тижнів з висівами кожні 7-10 день на диференційно-діагностичне середовище та кров'яний агар. Слід пам'ятати що посіви на середовище збагачення робляться паралельно в 2 ємності з яких одна вміщується в термостат друга в холодильну шафу при температурі 4-6 ?С. Методика посіву матеріалів для виявлення патогенних клостридій наведена у відповідних розділах. 9. БАКТЕРІЇ РОДУ SALMONELLA 9.1. Загальні положення Серед збудників харчових токсикоінфекцій одне з провідних місць займають бактерії що відносяться до роду Salmonella родини Enterobacteriaceae. За даними ВООЗ існує понад 2500 серологічних типів сальмонел потенційно патогенних для людини та тварин; при цьому деякі з них мають множинні фаготипи. За сучасною класифікацією род Salmonella складається з двох видів: S.enterica та S.bongori. Вид S.enterica поділяється на 6 підвидів: S. enterica підвид enterica S. enterica підвид salamae S. enterica підвид arizonae S. enterica підвид diarizonae S. enterica підвид houtenae S. enterica підвид indica. Назви підвидів не є необхідними для ідентифікації і тільки серовари підвиду enterica мають назви. Бактерії роду Salmonella – грамнегативні палички із закругленими кінцями довжиною 1-3 ммк а шириною 0 5 – 0 6 ммк. Усі вони за деяким виключенням S.Gallinarum-Pullorum рухливі завдяки наявності перитрихіально розташованих 8-12 джгутиків. Спор і капсул не утворюють добре фарбуються аніліновими барвниками. Сальмонели є факультативними анаеробами. Вони добре ростуть на звичайних поживних середовищах за винятком окремих серологічних варіантів S.Paratyphi A S.Abortusequi S.Abortusovis S.Typhisuis та деякі інші які утворюють більш дрібні колонії діаметром біля 1 мм. Оптимальною температурою росту для сальмонел є 37 ?С рН середовища 7 2-7 4. При більш низькій температурі 20 ?С або більш високій 42 ?С та при іншій реакції середовища рН від 5 0 до 8 0 вони також можуть розмножуватись але значно повільніше ніж при оптимальних умовах. Колоніям S. Paratyphi B S. Abortusequi S. Tyhisuis та деяких інших сальмонел при зберіганні протягом 1-2 діб при кімнатній температурі властива здатність до валоутворення яка виражається у тому що колонії по зовнішньому краю злегка піднімаються утворюючи слизуватий вал. Здатність до валоутворення у S. Paratyphi B використовують для диференціації цього збудника від S. Java що має аналогічну з S. Paratyphi B антигенну формулу але не утворює вал при рості на агарі. Ферментативні властивості сальмонел різноманітні не тільки у окремих представників окремих підродів але можуть змінюватись і в межах одного і того ж серовару. Вони звичайно утворюють сірководень S.Paratyphi A та деякі інші серовари рідко і не утворюють індол хоча іноді зустрічаються окремі серовари або їх різновиди які утворюють індол. Сальмонели не ферментують і саліцин утилізують цитрат на середовищі Сімонса S.Typhi не утилізують і варіабельні в ацетатному агарі. Для сальмонел характерні також ферменти лізин- орнітиндекарбоксилаза і аргініндегідролаза хоча зараз відомі штами S.Typhimurium S.Enteritidis v. ratin та деяких інших сероварів які мають знижений вміст ферменту лізиндекарбоксилази або зовсім його не мають. Всі сальмонели дають позитивну реакцію з метиловим красним MR і негативну реакцію Фогеса-Проскауера VP редукують нітрати ферментують маніт і глюкозу з утворенням газу але у таких серологічних типів як S.Typhimurium S.Derby S.Thompson S.Enteritidis можуть зустрічатися і "безгазові" варіанти. Постійно не утворюють газу S.Typhi і S.Gallinarum. Не ферментують сахарозу і адоніт хоча відомі випадки виділення штамів окремих сероварів що ферментують сахарозу S.Newport S.Meleagridis S.Stenleyville та ін. . Майже всі сальмонели швидко ферментують сорбіт. Як правило не розріджують желатину. Відношення сальмонел до арабінози дульциту інозиту ксилози рамнози трегалози гліцерину за Штерном а також до d- і - та L- тартрату цитрату і мукату неоднакове навіть у межах одного серологічного типу що дозволяє підрозділяти їх на ряд стабільних біохімічних варіантів. Результати біохімічного типування використовуються в епідеміологічних цілях. Сальмонели мають два основні антигенні комплекси що представляють різні структурні частини бактеріальної клітини. Соматичні -О-антигени – термостабільні зберігаються при кип'ятінні культури протягом 2-5 годин. Джгутикові -Н-антигени – термолабільні. О-антигени являють собою складні фосфоліпідо-полісахаридні комплекси структура яких вивчена досить повно. Н-антигени мають білкову природу можуть існувати у двох серологічних фазах: першій і другій або “специфічній” та “неспецифічній” . Крім зазначених двох основних антигенних комплексів у бактерій роду Salmonella доведена наявність також і інших антигенів. До них відносяться К Т М Vі та ін. які зустрічаються у багатьох представників родини Enterobacteriaceae. Антиген К – зустрічається в S.Paratyphi B S.Paratyphi А S.Typhimurium S.Heidelberg S.Haifa S.Cholerae-suis S.Typhi S.Stenley S.Anatum а також у деяких інших серологічних варіантів. Він представляє собою білково-полісахаридний комплекс стійкий до кислоти та етанолу і володіє вираженими антигенними властивостями. Vі – термолабільний соматичний антиген є одним із компонентів О-антигену і відноситься до групи К-антигенів. Він властивий трьом серологічним варіантам сальмонел – S.Typhi S.Paratyphi C S.Dublin а також зустрічається у деяких інших представників родини Enterobacteriaceae Escherichia Citrobacter . Структурно Vі-антиген являє собою полімер N-ацетиламіно-гексуронової кислоти. М-антиген слизуватий виявлений у слизуватих штамів S. Paratyphi B S. Potsdam і деяких інших. Він не розчиняється у воді руйнується під дією кислоти і етанолу і володіє слабкими антигенними властивостями. Антигенна структура покладена в основу схеми Кауфмана-Уайта для ідентифікації серогруп і сероварів сальмонел однак основними класифікаційними ознаками сальмонел як і усіх ентеробактерій є біохімічні властивості а не серологічна структура. На підставі спільності будови О-антигенів сальмонели об’єднують в серологічні групи які позначаються буквами латинського алфавіту А В С Д Е F Н та ін. до Z і далі арабськими цифрами від 51 до 67 які містять серологічні типи що відрізняються між собою структурою Н-антигенів. В даний час схема Кауфмана-Уайта включає 67 О-груп що відрізняються різними комбінаціями більш 20 різних комплексів Н-антигенів першої фази і більш 10 різних комплексів Н-антигенів другої фази. Бактерії Аrizonae включені до роду Salmonella і ідентифікація їх сероварів здійснюється за схемою Кауфмана-Уайта. Визначення антигенної формули сальмонел відбувається в реакції аглютинації із сальмонельозними монорецепторними монофакторними сироватками. За допомогою специфічних типових бактеріофагів деякі із серологічних варіантів сальмонел S.Typhimurium S.Typhi S.Paratyphi A S.Paratyphi B та ін. можуть бути підрозділені на ряд фаготипів. Сальмонели мають порівняно високий ступінь стійкості до впливу різних факторів довкілля. У рідких середовищах фізіологічний розчин бульйон при +50 ?С вони гинуть протягом 1 2 3 хвилин а при кип'ятінні – відразу. Найдовше сальмонели виживають у маслі – понад 200 діб. У молоці в залежності від кислотності – від 4-9 годин до декількох місяців у стерильному – навіть до 2 років у кисломолочних продуктах – від 4 до 301 дня а у деяких м’який сир – до 616 днів. Вони добре зберігаються при низьких температурах. Соління в’яління і копчення продуктів незначно знижують життєздатність сальмонел. У м'ясному розсолі що містить до 29% повареної солі при температурі 6 – 12 ?С вони можуть залишатися життєздатними до 4 місяців а в солоному і копченому м'ясі гинуть через 2 5-3 місяці. Факторами розповсюдження сальмонел як правило є продукти тваринного походження. Найчастіше захворювання виникають в наслідок вживання в їжу інфікованих м'яса і м'ясних продуктів. Переважає при цьому м'ясо великої рогатої худоби і свинина. М'ясо домашніх птахів качки курки індички гусака також нерідко є причиною захворювання людей сальмонельозами. Останні роки значну роль у поширенні захворювань сальмонельозного походження грають курячі яйця. Небезпеку представляють також яєчні продукти: меланж яєчний порошок. Молоко і молочні продукти займають більш скромне місце в поширенні сальмонельозів однак у разі їх інфікування вони виявляються причиною виникнення значних спалахів. Епідеміологічна роль риби і рибних продуктів відносно невелика разом з тим відомі випадки коли риба гарячого копчення різні рибні блюда і навіть оселедець пряного засолу виявлялися причиною виникнення захворювань сальмонельозом. Необхідно відзначити також що деякі з холоднокровних тварин яких вживають у їжу в деяких країнах можуть виявитися причиною захворювань устриці черепахи змії жаби та ін. . Інфікованими можуть виявитися продукти не тільки тваринного походження але і рослинного овочі фрукти ягоди білкові концентрати із сої різні злаки сушені фрукти й ін. . Описано випадки коли причиною спалахів харчових токсикоінфекцій та сальмонельозів виявлялися харчові дріжджі кондитерська фарба кармін тощо. Найбільшу небезпеку представляють продукти і страви які після готування не піддаються термічній обробці і особливо якщо вони довго зберігаються при кімнатній температурі. Готові страви і продукти можуть бути як первинно інфіковані м'ясо молоко яйця хворих тварин і птахів так і вторинно забрудненими в процесі їх кулінарної обробки через руки інфікований інвентар при неправильному зберіганні і транспортуванні . Варто пам'ятати що навіть при інтенсивному розмноженні сальмонел у харчових продуктах вони не змінюють їх смак запах зовнішній вигляд. 9.2. Бактеріологічні дослідження Другий день Переглядають посіви на щільних поживних середовищах і пересівають 3-5 підозрілих колоній у пробірки із комбінованими середовищами – Олькеніцького Кліглера . На комбіновані середовища посів роблять спочатку штрихами по скошеній частині а потім уколом усередину стовпчика. Для прискорення дослідження можна підозрілі колонії паралельно з пересівом на комбіновані середовища пересівати на скошений м’ясо-пептонний агар. Пробірки з посівами інкубують у термостаті при температурі 37?1 ?С до наступного дня. Розмір колоній на щільних поживних середовищах при посіві помірної густоти сягає 1-2 мм але зустрічаються і карликові колонії. На середовищі Ендо сальмонели ростуть у вигляді круглих безбарвних чи злегка рожевих прозорих ніжних колоній. На середовищі Плоскірева колонії сальмонел також безбарвні але більш щільні і дещо менших розмірів. На вісмут-сульфіт агарі сальмонели як правило ростуть у вигляді чорних колоній з характерним металевим блиском при цьому спостерігається прокрашування в чорний колір ділянки середовища під колонією. Виключення складають S.Paratyphi A і деякі серологічні типи з групи С та інших груп що при рості на цьому середовищі утворюють ніжні світло-зелені колонії. Посіви на вісмут-сульфітному агарі переглядають додатково через 48 годин. Якщо на чашках підозрілі колонії відсутні відповідь видають тільки після обліку результатів висівів із середовищ збагачення. У випадку якщо в результаті прямого посіву випорожнень не виросло жодної колонії здійснюють повторний висів збільшивши порцію матеріалу що засівається. При повторній відсутності росту варто отримати матеріал для досліджень ще раз. З посівів жовчі в бульйон і вихідної жовчі що містяться в термостаті роблять перший висів на чашки із вісмут-сульфітним агаром і середовищем Плоскірева. З посіву крові в жовчний бульйон середовище Раппопорт роблять висів на чашку із середовищем Ендо або зі звичайним поживним агаром рН 7 2 – 7 4 а первинний посів крові знову поміщають у термостат. Через 18 – 20 год. проводять висіви із середовищ збагачення на щільні поживні середовища. Третій день Проводять попередню ідентифікацію культур висіяних напередодні на середовища Олькеніцького Кліглера по ферментації лактози глюкози сахарози гідролізу сечовини утворенню сірководню а також за серологічними властивостями що визначають у реакції аглютинації на склі з полівалентними сироватками. Якщо культури ферментують лактозу і глюкозу з утворенням газу і гідролізують сечовину вони не належать до бактерій роду Salmonella. Культури що не ферментують лактозу і не гідролізують сечовину але ферментують глюкозу з утворенням чи без утворення газу утворюють сірководень піддаються подальшому вивченню. Культури що не ферментують лактозу ферментують глюкозу без газоутворення не утворюють сірководень і не гідролізують сечовину підозрілі як паратифозні чи дизентерійні. Їх випробовують у реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними та шигельозними сироватками і подальше вивчення роблять в залежності від результату аглютинації. Культури що не ферментують лактозу ферментують глюкозу з утворенням газу не утворюють сірководню і позитивні в реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними сироватками можуть належати до роду Salmonella. Усі підозрілі культури пересівають на поживні середовищa мінімального диференційного ряду таблиця 1 для підтвердження приналежності даної культури мікроорганізмів до роду Salmonella і проводять серологічну ідентифікацію. Для прискорення досліджень отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори що зареєстровані в Україні типу: ЕНТЕРОтест PLIVA-Lachema АРІ bioMereux та ін. Таблиця 1 Біохімічні властивості родів родини Enterobacteriaceae що зустрічаються найчастіше Тест або субстрат Salmo-nella Shigella Esche-richia Citro-bacter Kleb-siella Proteus Цитрат Сімонса + - - - + + Х Сечовина - - - Х + + - Малонат натрію - + - - - + + - Рухливість + - - + - + - + - Індол - - + + - - + - + + - Сірководень + - - - + - - + - VP - - - - - - + MR + + + + + + Фенілаланін- дезаміназа - - - - - + Лізин-декарбоксилаза + - - + - - + - Орнітин-декарбоксилаза + - + Х Х - - + Цитрат Крістенсена Х - Х + + Х Умовні позначення: + – ферментація середовища - – середовище не ферментується + - – середовище ферментується деякими варіантами не ферментується - + – середовище не ферментується деякими варіантами ферментується Х – варіанти стосовно даної ознаки Серологічну ідентифікацію сальмонел починають з випробовування їх у реакції аглютинації на склі із полівалентною сироваткою АВСДЕ що включає в себе аглютиніни до О-антигенів 2 4 61 62 7 8 9 і 3-10 12 Vi. При відсутності реакції аглютинації з зазначеною сироваткою культуру випробовують із полівалентною сироваткою до рідких груп сальмонел що включає антитіла до антигенів 11 13-22 14-34 15 19 23 та ін. При одержанні позитивних результатів аглютинації з однією з полівалентних сироваток культуру випробовують з кожною із О-сироваток що входять до її складу окремо для визначення приналежності її до однієї з О-груп. Після встановлення належності культури до визначеної О-групи її випробовують з Н-сироватками спочатку першої фази а потім – другої. Починати слід з Н-сироваток що відповідають більш розповсюдженим серологічним типам сальмонел даної групи. Після визначення Н-антигена першої фази визначають Н-антигенні компоненти другої фази і у такий спосіб встановлюють антигенну формулу виділеної культури тобто її серологічний варіант. При позитивному результаті реакції аглютинації виділеної культури з відповідними сироватками можна видати попередню відповідь про вид сальмонел. Для аглютинації з О-сироваткою культуру варто брати з верхньої частини росту на скошеному агарі для аглютинації з Н-сироватками – із самої нижньої частини росту культури чи з конденсату де розташовуються мікроорганізми з найбільш розвинутим Н-антигеном. На третій день дослідження переглядають чашки з висівами із середовищ збагачення і підозрілі колонії відсівають на середовища Олькеніцького чи Кліглера. Якщо при первинному посіві і при висіві із середовищ збагачення підозрілих колоній не виявлено може бути видана відповідь про негативний результат дослідження. Посіви на вісмут-сульфіт агарі із середовища збагачення незалежно від результатів перегляду залишають у термостаті ще на 24 години. У цей же день переглядають чашки з першим висівом із флакона з засіяною кров'ю і дуоденальним вмістом підозрілі колонії пересівають на середовище Олькеницького чи Кліглера і роблять другий висів на чашки. Крім перелічених вище методів ідентифікації виділених культур і пересівів на третій день роблять посів виділеної культури для дослідження її на чутливість до сальмонельозного О-бактеріофагу. Для цього дві краплі 4 або 18 годинної бульйонної культури досліджуваного штаму наносять тонко відтягнутою пастерівською піпеткою або петлею діаметр 0 4-0 5 мм на добре підсушений слабко лужний агар у чашці Петрі. Після підсихання на одну з крапель петлею або пастерівською піпеткою меншого діаметру наносять О-бактеріофаг а на іншу як контроль – краплю бульйону. Фаг наносять у робочому розведенні зазначеному на етикетці. На одній чашці таким чином можна випробувати одночасно 5-6 культур. Чашки з нанесеними культурами і О-бактеріофагом поміщають у термостат при 37?1 ?С на 18-20 годин після чого проводять облік результатів. Поява на місці нанесення фага чітко обмеженої зони зливного лізису або більшого чи меншого числа негативних колоній чітко видимих неозброєним оком свідчить про чутливість культур до О-бактеріофагу. При відсутності лізису в місцях нанесення фага буде суцільний ріст культури як у контролі. О-фаг може бути використаний для попереднього дослідження культури з чашки з диференційним середовищем. Культура що лізується О-фагом є підозрілою на сальмонелу і може бути прямо з чашки випробувана в реакції аглютинації із полівалентними сальмонельозними О-сироватками. Атипові сальмонельозні культури в більшості випадків чутливі до О-фагу у той час як культури подібні із сальмонелами за біохімічними властивостями наприклад лактозонегативні Е.coli як правило не лізуются цим фагом. Четвертий день Облік результатів посівів на мінімальний диференційний ряд. При виділенні культур грамнегативних рухливих паличок що ферментують глюкозу з утворенням або без утворення газу не ферментують лактозу і сахарозу не гідролізують сечовину і не утворюють індолу утворюють сірководень та мають інші характерні для цього роду біохімічні властивості і мають чітку серологічну характеристику – видають відповідь про виділення сальмонел. Деякі з найбільш широко розповсюджених сероварів підлягають подальшому вивченню з метою визначення внутрішньосероварної диференціації або епідемічного маркування. У таблицях 2 - 6 представлені схеми типування найбільш розповсюджених сероварів сальмонел. Культури що мають відхилення від типових властивостей – піддаються подальшому вивченню. Переглядають чашки із другим висівом дуоденального вмісту з бульйону і третій висів з останнього на щільні середовища. При негативних результатах перших двох висівів з жовчного бульйону з посівом крові висіви повторюють на 5-й і 10-й дні. При ідентифікації культур підозрілих на сальмонели найчастіше викликають труднощі при вивченні бактерій біохімічно подібних до сальмонел але які не аглютинуються сальмонельозними сироватками або які дають аглютинацію але мають відхилення по біохімічним властивостям. У таких випадках насамперед необхідно переконатися в чистоті культури для чого її розсівають на середовищі Ендо відбирають найбільш типові колонії і піддають їх додатковому вивченню. Посів культури в рідке середовище що містить підвищену кількість лактози 4% і знижену кількість пептону 0 3-0 5% дозволяє в більш ранній термін виявити відношення до лактози. У випадку виділення культур що аглютинуються сумішшю О-сироваток рідких груп але не аглютинуються ні однієї з О-сироваток що входять у суміш досліджують такі культури на здатність ферментувати саліцин малонат натрію адоніт дульцит сорбіт а також у реакціях VP та MR. За допомогою цих тестів вдається диференціювати бактерії роду Salmonella від представників інших родів родини Enterobacteriaceae що мають загальні антигенні комплекси із сальмонелами. Для виявлення відсутньої фази джгутикового антигену варто зробити посів в U-подібну трубочку заповнену напіврідкими 0 2% агаром. Для виявлення найбільш рухливих мікроорганізмів потрібно переглядати ріст через 4-6 годин і на наступний ранок. З появою росту в іншому коліні відразу ж роблять пересів з останнього на свіжоскошений агар. Так вловлюються найбільш рухливі мікроорганізми. Для визначення відсутньої фази Н-антигена використовують також посів за Свеном-Гардом. Принцип його полягає в тому що на напіврідкому агарі 0 6% рояться всі рухливі мікроорганізми. Якщо додати до агару 1-2 краплі сироватки відомої фази тобто тієї фази що була визначена то вона зв'яже виявлений антиген а мікроорганізми багаті іншим невідомим антигеном будуть бурхливо роїтися. Цей антиген легко може бути виявлений при дослідженні культури взятої з краю макроколонії у реакції аглютинації з Н-сироватками. Таблиця 2 Скорочена схема визначення біоварів S.Typhimurium Позначення біовару Рамноза Інозит a + + b + - c - - d - + Таблиця 3 Схема визначення біоварів S.Enteritidis Біовари Бульйон Штерна jena + ratin - Таблиця 4 Схема визначення біоварів S.Typhimurium повна схема Позна-чення біовару Арабі-ноза Ксило-за Рамно-за d-тарт-рат i-тарт-рат Мукат Інозит 1 + - - - - - - 2 + + - - - - - 3 + + + - - - - 4 + + + + - - - 5 + + + + + - - 6 + + + + + + - 7 + + + + + + + 8 + - + + + + + 9 + + - + + + + 10 + + - + + - + 11 - + + - - + + 12 + + - + + + - 13 - - - + + + + 14 - - + + + + + 15 + - + + + + - 16 + - + - - + + 17 + + + - - + - 18 + + + - - + + 19 + + + - - - + 20 + + + - + - - 21 + + + + - + + 22 + + + - + + - 23 + + + - + + + 24 + + + + - + - 25 + + + + + - + Тести з мукатом враховують через 48 – 96 год. по зміні кольору. В тесті з тартратами результат враховують через 48 – 96 год. по величині осаду що випав після додавання насиченого водного розчину ацетату свинцю. Облік результатів росту в бульйоні Штерна роблять до 7 днів. Таблиця 5 Схема визначення біоварів S.Typhi Позначення біовара Ксилоза Арабіноза I + - II - - II + + IV - + Таблиця 6 Схема визначення біоварів S.Enteritidis і S.Dublin Біовари Арабіноза* Дульцит* Рамноза* Бульйон Штерна** S.enteritidis + + + ++ S.enteritidis v.danysz X + + - S.enteritidis v.chaco + + + + S.enteritidis v.essen + + + ++ S.dublin + або - Х + + S.dublin v.accra + + + + S.dublin v.coeln + або - + + ++ Умовні позначення: *+ – позитивна реакція протягом 1-2 діб; + – позитивна реакція пізніше 3 діб; + або - – позитивна реакція пізніше 3 діб або негативна; - – негативна реакція; Х – різні реакції; ** ++ – фіолетове забарвлення середовища; + – фіолетово-червоне забарвлення середовища; - – колір середовища не міняється 9.3. Серологічні дослідження Серологічні дослідження проводять з метою: 1. підтвердження клінічного діагнозу; 2. підтвердження етіологічної ролі виділеного збудника; 3. ретроспективної постановки або виключення діагнозу. У перших двох випадках вирішальним буде наростання титру антитіл у процесі хвороби. Реакція аглютинації повинна бути простежена в динаміці для чого її ставлять на 1-3 день захворювання прищеплювальна або анамнестична реакція а потім на 7-10-й день і на 15-20 день. Кров для серологічного дослідження беруть з пальця або з ліктьової вени. Для постановки реакції аглютинації необхідно не менш 0 5-1 см3 крові. Кров збирають у стерильну пробірку поміщають її в термостат при 37?1 ?С на 30-60 хвилин після чого згусток відокремлюють від стінок пробірки пастерівською піпеткою і переносять пробірку в холодильник. Після відстоювання сироватку відсмоктують і досліджують. Для постановки реакції аглютинації готують перше розведення сироватки 1:100 для чого в пробірку вносять 0 1 см3 досліджуваної сироватки і 9 9 см3 фізіологічного розчину. Далі готують ряди пробірок по чотири у кожному у кількості що відповідає числу застосовуваних антигенів діагностикумів . В усі пробірки крім першої кожного ряду наливають по 0 5 см3 фізіологічного розчину. Сироватку розведену 1:100 по 0 5 см3 додають у 1 і 2 пробірки кожного ряду при цьому в другій пробірці розведення сироватки буде 1:200. Вміст 2-ої пробірки після ретельного перемішування в кількості 0 5 см3 градуйованою піпеткою переносять у 3-ю пробірку розведення 1:400 із третьої в четверту розведення 1:800 . З останньої пробірки після ретельного перемішування 0 5 см3 сироватки виливають. У кожен ряд аглютинаційних пробірок з розведеннями сироватки і у контрольну пробірку в якій міститься 0 5 см3 фізіологічного розчину додають по одній краплі одного з діагностикумів. Другим контролем контроль сироватки є пробірка із сироваткою розведеною 1:50 чи 1:100 у яку діагностикум не додають. Після додавання діагностикумів штатив із пробірками енергійно струшують і поміщають у термостат при температурі 37 ?С на 18 – 20 годин. Облік результатів реакції аглютинації роблять за допомогою аглютиноскопа або лупи. Останнє розведення сироватки у якому спостерігається добре виражена аглютинація вважають її титром. Перед постановкою реакції гемаглютинації аглютинації уважно вивчають настанову інструкцію на препарат. Реакцію аглютинації можна поставити і зі штамом виділеним у хворого або бактеріоносія аутоштам . У цьому випадку в якості діагностикума використовують суспензію живої або убитої добової культури бактерій у фізіологічному розчині. Абсолютна висота титрів аглютинінів не може бути доказом наявності захворювання. Одержання достовірних результатів реакції аглютинації досягають при повторних випробуваннях сироватки крові в динаміці інфекційного процесу. Про позитивний результат серологічного дослідження сироватки буде свідчити виразне наростання титру аглютинінів. 9.4. Критерії діагностики При епідеміологічній розшифровці окремих захворювань або спалахів сальмонельозної етіології особливо обумовлених одночасно декількома типами збудника а також при виявленні сальмонел у харчових продуктах або інших об'єктах довкілля нерідко доводиться зустрічатися з певними труднощами пов'язаними з встановленням джерел інфекції і факторів її передачі. Ці труднощі можуть бути пов'язані з необхідністю: а доведення етіологічної ролі збудника виділеного у хворого; б ретроспективного виявлення раніше перехворілих з метою встановлення масштабів поширення інфекції і її імовірних джерел; в аргументації наявності єдиного або множинних джерел інфекції і факторів її передачі для всіх потерпілих. У перших двох випадках поряд з даними епідеміологічного і бактеріологічного обстеження велику допомогу можуть надати також серологічні дослідження з виявлення в сироватці крові обстежуваних специфічних антитіл. У третьому випадку доказом будуть служити виділення у хворих бактеріоносіїв з харчових продуктів води змивів з об'єктів довкілля і у тварин сальмонел того самого серологічного варіанту. Велику допомогу для встановлення або виключення епідеміологічних зв'язків між окремими випадками захворювань сальмонельозами а також підтвердження або виключення епідеміологічної ролі підозрюваних джерел люди або тварини – хворі або бактеріоносії і факторів передачі інфекції можуть оказати результати біохімічного вивчення або фаготипування виділених збудників. При визначенні типу захворювання сальмонельозної етіології перш за все слід враховувати характер клінічних проявів захворювання та даних епідеміологічних спостережень. Орієнтовні лабораторні критерії діагностики та визначення типу захворювання сальмонельозної етіології наведені нижче. Вид досліджень та досліджуваний матеріал Результат досліджень Передбачувана форма захворювання ГКІ ХТІ Виділення сальмонел з матеріалу від постраждалих поодинокий ріст колоній збудника або виділення його лише з середовищ накопичення* + висока контамінація збудником матеріалу від постраждалих* + Дослідження сироватки постраждалого в реакції аглютинації із штамом збудника виділеного у вогнищі т.зв. ауто-Відаль значне наростання титру 1:200 або більше + невеликі титри 1:50 – 1 :100 або відсутність наростання титру + Виділення збудника з інкримінованого продукту. виділення сальмонел при посіві 25 г см3 інкримінованого продукту на середовище накопичення або негативний результат бактеріологічного дослідження + виділення збудника у високій кількості 106 КУО або більше + * Такий критерій особливо показовий для промивних вод та блювотних мас. 10. БАКТЕРІЇ РОДУ SHIGELLA 10.1. Загальні положення Харчові продукти контаміновані бактеріями роду Shigella можуть бути причиною захворювань що протікають по типу харчових бактеріальних отруєнь. Серед продуктів що можуть викликати масові захворювання і які протікають клінічно по типу харчової токсикоінфекції найчастіше реєструються молоко і молочні продукти вироби з відварного м'яса – холодне паштети м'ясні салати макарони "по-флотськи". Життєздатність шигел в продуктах при кімнатній температурі від 2 – 3 днів консервовані огірки до 50 – 60 днів олія маргарин . Термін цей збільшується при зберіганні продуктів у холодильнику. Вважають що більшість штамів шигел можуть розмножатися у діапазоні від 6-10 ?С до 45 ?С гинуть при 60 ?С однак зустрічаються більш термостійкі штами. Встановлено що у коров’ячому молоці сирому пастеризованому стерильному шигели розмножуються помірно при 20-22 ?С оптимально – при 37 ?С. Шигели зберігаються довше у стерильному менше контамінованому сапрофітами молоці. За сучасною класифікацією шигели є самостійним родом Shigella родини Enterobaсteriaceae. Основні диференційні ознаки окремих представників цього роду що не підрозділяються морфологічно полягають у відмінностях метаболізму і специфічності антигенної структури. У зв'язку з цим ідентифікація шигел базується на визначенні їх ферментативної активності і серологічної характеристики. До шигел відносяться грамнегативні палички довжиною від 2 до 4 ммк і шириною від 0 5 до 0 8 ммк. Шигели не мають джгутиків не утворюють спор добре фарбуються аніліновими барвниками. Шигели – факультативні анаероби добре ростуть в аеробних умовах на простих поживних середовищах. Оптимальна температура росту 37 ?С однак представники виду S. sonnei здатні розмножуватися при температурі від 10 ?С до 45 ?С . Оптимальна реакція середовища при pН близько 7 2. Відповідно до пропозиції Підкомітету по кишкових бактеріях Міжнародної комісії з Shigella до роду Shigella відносяться бактерії що мають наступні біохімічні властивості таблиця 7 . Таблиця 7 Біохімічна характеристика бактерій роду Shigella Глюкоза кислотоутворення без газу Адоніт кислота не утворюється Ацетат натрію не утилізується Дульцит кислотоутворення непостійно Желатин не розріджується Індол утворюється або не утворюється Інозит кислота не утворюється Лактоза кислотоутворення непостійно Маніт кислотоутворення непостійно Нітрати редукуються Реакції MR/ VP позитивна/негативна Рухливість нерухливі Саліцин кислота не утворюється Сахароза кислотоутворення непостійно Сечовина не розщеплюється Сірководень не утворюється Цитрат амонію не утилізується Основною диференційною ознакою шигел є ферментація вуглеводів без газоутворення. Виключення складають деякі біохімічні варіанти S.flexneri VI що ферментують глюкозу з утворенням газу. Сучасна класифікація шигел будується на комплексі біохімічних та серологічних властивостей таблиця 8 . Таблиця 8 Класифікація бактерій роду Shigella Підгрупа Вид Серовар Підсеровар Скорочена антигенна формула А S. disenteriae 1 – 12 – В S. flexneri 1 1a I:4… 1b I:6… 2 2a II:3 4… 2b II:7 8… 3 3a III:6 7 8… 3b III:3 4 6… 4 4a IV:3 4… 4b IV:6… 5 5а V:3 4… 5b V:7 8… 6 – VI:- X-variant – -:7 8… Y-variant – -:3 4… C S. boydii 1 – 18 – D S. sonnei – – Антигенна структура шигел відрізняється простотою і представлена в основному соматичними термостабільними О-антигенами. Термолабільний К-антиген виявлений у всіх шигел крім S. sonnei і S. flexneri . Він подібний до К-антигенів ешеріхій і здатен маскувати О-антигени викликаючи інаглютинабильність свіжовиділених культур О-сироватками. Цей дефект легко усувається кип'ятінням неаглютинабильних штамів. Поряд з вивченням біохімічних властивостей проводиться серологічна ідентифікація шигел заснована на вивченні їх антигенної структури шляхом виявлення типових і групових антигенів таблиця 9 . Таблиця 9 Біохімічні властивості шигел різних видів Тест або субстрат Реакція S.dysenteriae S.flexneri S.boydii S.sonnei cеровари 1-5 cеровар 6 Глюкоза газ - - - + - - Лактоза - - - - + Маніт - + + - + + Сахароза - - - - + Дульцит - + - X X - Сорбіт X X + + X - Арабіноза X X X + + Рафіноза - X - - X Рамноза X X - - + + Мальтоза X X + + X + + Ксилоза X - X X X Трегалоза + + + + + + + + + Целобіоза - - - - X Гліцерин X - + + X X Індол - + - + - - + - Аргінін X - X X - Орнітин - - - - + Мукат - - - - - + ?-галактозидаза - + - - - + + Умовні позначення: + – ферментація середовища - – середовище не ферментується + - – середовище ферментується деякими варіантами не ферментується - + – середовище не ферментується деякими варіантами ферментується Х – варіанти стосовно даної ознаки 10.2. Бактеріологічні дослідження Перший день Для прискореної діагностики з об'єктів довкілля вода змиви харчові продукти і т. ін. при можливості застосовують метод імунофлюоресценції. Для перегляду препаратів використовують люмінесцентні мікроскопи. Колір світіння залежить від кольору люмінесцентного барвника що застосовується для мітки сироватки. У випадку позитивної реакції на темному тлі препарату видно клітини характерної морфології що світяться по периферії. Оцінка результатів проб безпосередньо з об'єктів довкілля з метою виявлення збудників дизентерії повинна бути дуже обережною. Використання люмінесцентних дизентерійних сироваток до S.flexneri і S.sonnei дозволяють одержати відповідь що має лише сигнальне орієнтовне значення. Основна причина цього – існування спільності антигенної структури серед непатогенних видів бактерій і зокрема кишкової палички з бактеріями роду Shigella що приводить до хибно позитивного фарбування супутньої мікрофлори. Остаточний висновок може бути видано тільки на підставі виділення з досліджуваного матеріалу збудника і його подальшої ідентифікації. Другий день Після інкубації переглядають чашки з посівами і лактозонегативні колонії відсівають на середовище Олькеніцького Кліглера та на скошений м’ясо-пептонний агар. Із жовчного бульйону селенітового середовища роблять висів на середовище Плоскірева та Ендо. Усі посіви інкубують при 37±1 ?С 18 – 20 годин. Третій день Переглядають чашки з висівами із середовища збагачення і відсівають лактозонегативні колонії на середовище Олькеніцького Кліглера і скошений м’ясо-пептонний агар та інкубують при 37±1 ?С 18-20 годин Проводять попередню ідентифікацію виділених напередодні культур по біохімічним і серологічним властивостям у реакції аглютинації на склі з адсорбованими сироватками. Для подальшого вивчення відбирають культури грамнегативних безспорових паличок з характерними властивостями для шигел а саме: не розщеплюють лактозу і сечовину не утворюють сірководень ферментують глюкозу з утворенням кислоти і без газу. Варто враховувати що серед S.sonnei зустрічаються біохімічні варіанти що ферментують лактозу до кислоти а деякі варіанти S.flexneri VI розщеплюють глюкозу до кислоти і газу. Для остаточної ідентифікації досліджувані культури засівають на мінімальний диференційний ряд таблиця 1 . Для прискорення досліджень отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори що зареєстровані в Україні типу ЕНТЕРОтест PLIVA-Lachema АРІ bioMereux . Культури підозрілі як шигели досліджують у реакції аглютинації на склі спочатку із полівалентною сироваткою до S.flexneri I-VI sonnei а у випадку негативної реакції – з набором полівалентних сироваток до S.boydii S.dysenteriae. При позитивній реакції аглютинації на склі однієї з полівалентних сироваток продовжують серологічну ідентифікацію культури з адсорбованими сироватками що входять у полівалентну. У випадку позитивної реакції з полівалентною сироваткою до S.flexneri I-VI sonnei проводять аглютинацію з полівалентною сироваткою до S.flexneri I-VI та S.sonnei. Якщо аглютинація відбулась із сироваткою S.flexneri I-VI то далі необхідно визначити серовар і підсеровар S.flexneri таблиця 9 у реакції аглютинації на склі з типовими і груповими сироватками. При позитивному результаті аглютинацій з монорецепторними сироватками можна видати попередню відповідь про наявність у досліджуваному матеріалі шигел. Четвертий день Проводять остаточну ідентифікацію культур за біохімічними властивостями табл. 1 9 встановлюють антигенну формулу за допомогою повторної реакції аглютинації на склі культур знятих зі скошеного агару і видають остаточну відповідь про наявність або відсутність в досліджуваному матеріалі шигел. При ідентифікації виділених культур можуть виникнути наступні ускладнення: 1. Виділення культур шигел із відхиленнями від типової характеристики по ферментативній активності. Наприклад зустрічаються манітнегативні варіанти S.flexneri і S.sonnei манітферментуючі різновиди S.dysenteriae ксилозоферментуючі варіанти підвиду S.flexneri; лактозоферментуючі варіанти S.boydii. 2. Виділення інаглютинабельних культур. * через наявність поверхневого антигену К. У цьому випадку прогрівання культури протягом 1-1 5 годин при 100 ?С руйнує термолабільний К-антиген і аглютинація з О-сироваткою відновлюється; * через втрату типоспецифічного антигену S.flexneri. Селекціонування окремих колоній з поживного агару що володіють повним антигенним комплексом дозволяє з'ясувати дійсний серовар культури. 3. Виділення атипових представників родини Enterobacteriaceae що виявляють подібність за біохімічними і серологічними властивостями із шигелами. Диференційні біохімічні ознаки деяких представників родів родини Enterobacteriaceae що найбільш часто зустрічаються котрі можуть допомогти при їх ідентифікації представлені в таблиці 1. Додатково доцільно досліджувати чутливість виділених культур до полівалентного дизентерійного бактеріофагу. Для цього використовують наступну методику: на добре підсушену чашку зі слабко лужним агаром рН 7 6 наносять пастерівською піпеткою краплю змиву 18-20-годинної агарової культури. На підсохлі краплі відтягнутою пастерівською піпеткою наносять дизентерійний бактеріофаг; після підсушування чашки інкубують при 37?1 ?С протягом 18-20 годин. При позитивному результаті спостерігається затримка росту культури на чашках з бактеріофагом. У складних випадках при ідентифікації бактерій родини Enterobacteriaceae рекомендується застосовувати кератокон’юктивальну пробу на морських свинках. При постановці проби повну петлю діаметром 5 мм добової агарової культури вносять у кон’юнктивальний мішок ока морської свинки під нижнє віко. Переважна більшість свежовиділених шигел викликає в морських свинок специфічний кератокон’юнктивіт на 2 – 5 добу: кон’юнктива гіперемована роговиця мутна набрякла з білуватим відтінком рясні гнійні виділення. Крім шигел кератокон’юнктивіт можуть викликати патогенні кишкові палички серотипу 0124:К17 і дуже рідко деякі сальмонели наприклад – S.typhimurium але ці ентеробактерії легко диференціюються від шигел за їх біохімічними властивостям. Для видачі остаточної відповіді що підтверджує не тільки виділення шигел із досліджуваного матеріалу але і загальне джерело зараження і шляхи передачі інфекції потрібно більш поглиблене вивчання виділених штамів з використанням методів внутрішньовидового типування. Для цього виділені культури шигел піддають більш детальному біохімічному вивченню що дозволяє здійснити подальшу диференціацію збудника усередині серологічних типів і крім того використовують методи засновані на феномені коліциногенії також визначення антибіотикограм. Для визначення біохімічних варіантів застосовують вуглеводи що дозволяють підрозділити серовари на “+” варіанти що ферментують за 24 години і “-“ варіанти що не ферментують таблиці 10 11 12 13 14 . Таблиця 10 Схема визначення біоварів S.flexneri 1-5 var.X Y Н.А. Хоменко Б.С. Кисельова 1967 Біовар Ферментація вуглеводів мальтоза арабіноза сорбіт рамноза 1 + + + + + + + + 2 + + + + + + - 3 + + - + + + + 4 + + - - - 5 + + - + + - 6 + + + + - - 7 + + + + - + 8 - + + + + + + 9 - - + + + + 10 - + + + + - 11 - - + + - 12 - + + - - 13 - + - + 14 - - - + 15 - - - - Умовні позначення: + – ферментація через 24 години + – уповільнена ферментація + + – ферментація частіше у 1-у добу рідше пізніше - – відсутність ферментації S.flexneri VI в залежності від характеру ферментації глюкози маніта і дульцита поділяються на 7 біоварів таблиця 11 . Таблиця 11 Схема визначення біоварів S.flexneri VI Edwards P. Ewing W. 1972 Біовари Ферментація вуглеводів глюкоза маніт дульцит Boyd 88 + + - Boyd 88 + + + Manchester +г +г +г Manchester +г +г - Newcastl +г - +г Newcastl + - - Newcastl + - + Умовні позначення: + – ферментація на першу добу до кислоти г – газоутворення + – пізня ферментація - – ферментація відсутня Ю.П. Солодовніков із співавторами на основі схеми K. Bojlen 1934 з використанням ксилози рамнози і мальтози у 1971 запропонували поліпшену схему типування S.sonnei що дозволяє підрозділити їх на 7 біохімічних типів. Для позначення окремих біохімічних типів використовують два види знаків: римські цифри І ІІ ІІІ ІV і латинські букви a b c g e d f. Таблиця 12 Схема визначення біоварів S.sonnei Ю.П. Солодовніков 1971 Біовар Ферментація вуглеводів рамноза ксилоза мальтоза Іа + 1 - + 1-2 Іb + 1 - + ?2 ІІg + ?1 - + 1-2 ІІe + ?1 - + ?2 ІIId + 1 + 1 + 1-2 IIIc + 1 + 1 + ?2 IVf + 1 + 2 і пізніше + 1 і пізніше Умовні позначення: + – ферментація у дужках вказані терміни ферментації ; - – відсутність ферментації У зв’язку з тим що частка штамів S.sonnei не вкладались в схему типування за Ю.П. Солодовніковим у 1988 році в Україні була рекомендована інша схема таблиця 14 внутрішньовидового типування S.sonnei. Вона вміщує 12 біоварів і тривалість дослідження 3 доби. Таблиця 13 Схема визначення біоварів S.sonnei ІЕІХ Біовар Ферментація вуглеводів рамноза ксилоза мальтоза Іа + - + 1-2 Іb + - + 3 Im + - - ІІe + 2-3 - + 1-2 ІІg + 2-3 - + 3 ІІl - - - ІІk - - + 1-3 ІIId + + + 1-2 IIIc + + + 3 IVf + + 2-3 + 3 Vn - + 1-3 - Vu - + 1-3 + 1-3 Умовні позначення: + – ферментація у дужках вказані терміни ферментації - – відсутність ферментації Таблиця 14 Схема визначення біоварів S.boydii Stypulkowska-Misiurewicz H. Noworyta J. 1973 Біовар Ферментація вуглеводів сорбіт гліцерин ксилоза дульцит 1 + + + + 2 + + - + 3 + + + - 4 - + - - 5 + + - - 6 - + - + 7 + - - + 8 - + + + У зв'язку з тим що на окремих територіях відзначається значна перевага окремих ферментативних типів метод біохімічного типування не завжди може бути використаний як самостійний при ідентифікації культур під час епідеміологічного розслідування групових захворювань і спалахів. У цьому випадку доцільно проводити коліцинотипування по чутливості до коліцину і коліциногенотипування по здатності продукувати коліцини виділених культур шигел. Методика наведена у додатку та інші види типування. Остаточна відповідь не тільки про етіологію захворювань що видається на 4-тий день аналізу але і про джерело інфекції шляхи її передачі може бути дана тільки після зіставлення епідеміологічних і клінічних даних з результатами докладного всебічного і ретельного вивчення біологічних властивостей усіх виділених у вогнищі культур від хворих з продуктів харчування змивів з об'єктів довкілля секційного матеріалу і т. ін. їх ідентичності за біохімічним варіантом антибіотикограмам коліциногенності і спектру чутливості до еталонних коліцинів. У разі виділення з інкримінованих продуктів S.sonnei в кількості ? 102 КУО в 1 г/см3 паралельно з виділенням цього ж збудника з матеріалу від потерпілих при наявності типових клінічних проявів притаманних харчовим отруєнням та відповідних епідеміологічних даних випадок слід розцінювати як харчову токсикоінфекцію спричинену слабовірулентним штамом S.sonnei. В усіх інших випадках захворювання етіологічно пов’язане з шигелами має бути розцінено як гостра кишкова інфекція шигельоз . 11. БАКТЕРІЇ РОДУ ESCHERICHIA 11.1. Загальні положення Виникнення харчових токсикоінфекцій що викликані ешеріхіями звичайно пов'язане з масивним інфікуванням продуктів цими бактеріями. У доброякісних харчових продуктах можуть виявлятися ешеріхії в невеликих кількостях припустимі межі регламентуються відповідними ГОСТ ДСТУ ТУ тощо . Тому при дослідженні на ешеріхії підозрюваних продуктів набуває особливого значення кількісне визначення ступеня обсіменіння цими бактеріями. У випадку виділення штамів ешеріхій підозрілих як збудники даного захворювання з метою підтвердження діагнозу досліджують у динаміці кров потерпілих на наявність аглютинінів до аутоштаму. Збудниками захворювань можуть бути ентеропатогенні або ентеротоксигенні кишкові палички а також і ешеріхії інших серологічних груп антигенна структура яких не може бути розшифрована на місцях через відсутність необхідних діагностичних сироваток. У зв'язку з цим необхідно встановити ідентичність культур за ферментативними властивостями виділених з різних матеріалів харчові продукти блювотні маси промивні води і т.д. і якщо розшифровка їх антигенної структури не можлива на місці то такі штами направляють для ідентифікації в обласні СЕС та Центральну СЕС МОЗ України. Рід Escherichia поєднує грамнегативні рухливі і нерухомі палички що не утворюють спори ростуть на простих поживних середовищах не утворюють цитохромоксидазу не утилізують цитрат не утворюють ацетилметилкарбінол не розкладають сечовину не розріджують желатин не утворюють сірководень відновлюють нітрати утворюють індол ферментують лактозу деякі різновиди ферментують лактозу в пізній термін або не ферментують її і глюкозу. Стосовно інших вуглеводів і багатоатомних спиртів ешеріхії поводяться по-різному таблиця 15 утворюючи велике число біохімічних варіантів. Таблиця 15 Ферментація вуглеводів і багатоатомних спиртів Лактоза Глюкоза Сахароза Ксилоза Рамноза Рафіноза Арабіноза Маніт Дульцит Саліцин Адоніт Інозит Сорбіт + або – + + або – + + або – + або – + + + або – + або - – рідко + – + або – У практиці для встановлення приналежності бактерій до роду Escherichia звичайно буває достатньо постановки обмеженого числа тестів Таблиця 1 . Диференційно-діагностична схема ешеріхій побудована на основі антигенної структури цих бактерій. Діагностичне значення мають три комплекси антигенів: соматичний О-антиген соматичний К-антиген який маскує проявлення аглютинабельності живих бактерій з О-сироваткою і джгутиковий Н-антиген. На теперішній час у ешеріхій відомо 159 основних різновидів О-антигенів біля 100 різновидів К-антигенів і 53 різновиди Н-антигенів. О-антиген термостабільний Н-антиген – термолабільний. К-антиген по чутливості до прогрівання підрозділяється на 3 типа: А В і L. L і B антигени термолабільні. Прогрівання при 100 ?С протягом 1 години призводить до повної інактивації L-антигену і бактерії що містять такий антиген добре аглютинуються О-сироваткою не аглютинуються відповідною L-сироваткою і не здатні зв'язувати L-антитіла. Аналогічна обробка ешеріхій що мають В-антиген також робить бактерії аглютинабильними О-сироваткою але не позбавляє здатності зв'язувати відповідні В-антитіла і в окремих випадках аглютинуватися В-сироваткою. А-антиген термостабільний. Аглютинабельність бактерій які мають А-антиген О-сироваткою досягається тільки після прогрівання їх при 120 ?С протягом 2 5 годин. Етіологічною причиною харчових токсикоінфекцій з числа ешеріхій досить часто бувають ентеропатогенні кишкові палички. Їх антигенна структура представлена в таблиці 16. Таблиця 16 Антигенна структура ентеропатогенних ешерихій О-антиген К-антиген Н-антигени що зустрічаються у ешеріхій даної ОК-групи 18а 18с 77 1 4 7 10 11 12 16 26 30 32 20а 84 9 10 19 25 26 34 25а 11 6 12 30 26 60 2 6 7 8 9 10 11 12 14 16 18 19 27 30 32 33 46 44 74 4 12 18 32 34 55 59 1 2 4 6 7 8 10 11 12 19 21 25 27 32 33 34 39 86а 61 2 6 7 8 9 10 11 12 18 21 26 27 34 47 111а 111b 58 2 4 6 7 11 12 16 20 21 25 27 30 32 34 40 ”635” 112а 112с 66 Н- 114 90 4.10.21.32 119 69 1 2 4 5 6 8 9 11 18 25 27 32 39 40 124 72 2 16 19 30 32 38 12 125 70 2 4 6 7 10 11 12 15 19 21 25 30 32 40 126 71 2 5 7 9 10 11 12 19 20 21 27 29 30 33 34 45 127 63 1 4 5 6 9 11 19 21 26 27 33 40 128аbc 67 2 6 7 8 9 10 11 12 16 19 21 27 35 142 86 6 18 38 143 12 144 4 Н- 151 - 10 11 “408” 10 12 Примітка: Н- – нерухомі можуть бути в кожній серогрупі і являються самостійним сероваром. Крім перелічених у таблиці різновидів у різних країнах окремими дослідниками описані як збудники гострих кишкових захворювань ешеріхії інших серологічних груп. До їх числа відносяться ешеріхії О-груп: 04 06 08 022 027 028 042 073 075 086а 091 091 0112 0114 0127а 0136 «561» -015 К62 «10244»-0117: К62 «21706»-077:К62 197 та ін. Серологічна ідентифікація ешеріхій проводиться за допомогою ОК-сироваток. В окремих випадках обов'язково а в інших бажано застосування О-сироваток. Для визначення Н-антигена використовують Н-сироватки. 11.2. Бактеріологічні дослідження Другий день Вибирають характерні колонії і пересівають їх на поверхню скошеного МПА та на середовище Олькеніцького Кліглера . Посіви інкубують 18 – 24 години при 37±1 ?С. Вибір колоній для дослідження із середовища Ендо роблять після ретельного перегляду морфології і кольору колоній. При наявності тільки однотипних колоній для подальшого дослідження відбирають 10 колоній. При виявленні кількох видів колоній відбирають 3-5 колоній кожного виду як лактозопозитивні так і лактозонегативні. З чашок із середовищем Плоскірева відбирають тільки блідо-рожеві і безбарвні колонії схожі на колонії шигел тому що деякі ешеріхії що викликають дизентерієподібні захворювання уповільнено ферментують лактозу а ріст їх на середовищі Плоскірева не пригнічується. Відібрані колонії засівають на середовище Олькеніцького Кліглера і скошений МПА Якщо на другий день дослідження на середовищі Ендо відсутній ріст підозрілих на ешеріхії колоній або виявляються поодинокі колонії при посіві нерозведеного матеріалу роблять пересів петлею на середовище Ендо з пробірок з первинними посівами на середовищі Кесслер. Третій день Проводять облік результатів посіву на середовище Кесслер враховуючи помутніння та газоутворення та висівають на середовище Ендо. При наявності росту бактерій на середовищі Ендо з посівів із середовища Кеслер подальшу роботу проводять так як описано у відношенні колоній що виросли на середовищі Ендо з первинним посівом матеріалу. Культури відсіяні в попередній день на середовище Олькеніцького Кліглера і скошений МПА вивчають у такий спосіб: * на середовищі Олькеніцького Кліглера враховують газоутворення при ферментації глюкози розщеплення лактози сечовини і продукцію сірководню. Подальшому дослідженню піддають культури штамів що не продують сірководню і не розщеплюють сечовину; * пересівають культури грамнегативних паличок на напіврідкий 0 3% поживний агар для визначення рухливості і на середовища мінімального диференційного ряду таблиця 1 для визначення біохімічних властивостей бактерій. Для прискорення досліджень отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори що зареєстровані в Україні типу ЕНТЕРОтест PLIVA-Lachema АРІ bioMereux . * культури грамнегативних паличок зі скошеного агару випробовують у реакції аглютинації на склі з полівалентною ОКА-сироваткою у випадку позитивного результату продовжують з ОК- сироватками більш вузького спектру дії – ОКВ ОКС ОКД ОКЕ. При позитивній реакції з однією з цих сироваток продовжують з моновалентними ОК-сироватками або з ОК-імуноглобулінами що входять до тієї полівалентної котра викликає аглютинацію бактерій; * у штамів що аглютинувалися на склі з якою-небудь моновалентною ОК-сироваткою або ОК-імуноглобуліном визначають у реакції аглютинації на склі О-антиген з адсорбованими груповими і факторними О-сироватками з грітою культурою 30 хв. при 100 ?С . * перша попередня відповідь може бути видана на третій день після одержання результатів реакції аглютинації бактерій на склі з моновалентними ОК-сироватками. У випадку позитивної реакції аглютинації з однієї з моновалентних сироваток відповідь формулюють у такий спосіб: “В... вказати матеріал дослідження виявлені бактерії підозрілі як ентеропатогенні ешеріхії вказати ОК-групу наприклад 055:К5 або 026:К6 і т. ін. дослідження продовжується”. При негативних результатах аглютинації на склі відповідь формулюють: “В... вказати матеріал дослідження ентеропатогенних ешеріхій не виявлено дослідження продовжується”. В певних випадках для окремих серологічних варіантів ешеріхій необхідно встановлення епідеміологічних маркерів. В таблицях 17 18 19 20 21 представлені схеми біохімічного типування деяких сероварів ешеріхій. Таблиця 17 Схема визначення біоварів E.coli O75:K95 Голубева І.В. Андронова Н.І.1982 Серовар Біовар Глюкоза газ Дульцит Рамноза Саліцин О75:К95:Н5 1 + + + + О75:К95:Н5 2 + + + - О75:К95:Н5 3 + + + + О75:К95:Н5 4 + + + + О75:К95:Н5 5 + - - + О75:К95:Н19 + + + - О75:К95:Н19 + + + + О75:К-:Н7 + + + + О75:К95:Н10 О75:К95:Н16 + + + - Таблиця 18 Схема визначення біоварів EPEC O142:K86 Гедзе Г.І. 1982 Серовар Біовар Глюкоза газ Дульцит Сорбіт Сахароза О142:К86:Н6 1 - + - + О142:К86:Н6 2 + + - + О142:К86:Н18 3 + + + + О142:К86:Н38 4 + + + - Таблиця 19 Схема визначення біоварів EPEC О151:К- Кисельова Б.С. та ін. 1976 Серовар Біовар Глюкоза газ Дульцит Сорбіт Арабіноза Лізинде-карбокси-лаза О151:К-Н10 1 + + + 1-2 + + О151:К-Н10 2 - + + 1-2 - + О151:К-Н10 3 - + - - - О151:К-Н10 4 - + + 1-2 + + О151:К-Н11 5 - - + + + Таблиця 20 Схема визначення біоварів ЕРЕС О144:К Кисельова Б.С. та ін. 1975 Серовар Біовар Глюкоза газ Дульцит Сорбіт Арабі-ноза Лізинде-карбокси-лаза О144:К:Н- 1 - + - - - О144:К:Н4 2 + + - + + + О144:К:Н18 3 + - + + - + О144:К:Н25 Таблиця 21 Схема визначення біоварів ЕРЕС О124:К72 Голубєва І.В. Кісельова Б.С. та ін. 1982 Серовар Біовар Глюкоза газ Лакто-за Дуль-цит Рамно-за Салі-цин О124:К72:Н- О124:К72:Н30 1 + - + - + - О124:К72:Н30 2 + - + + - - О124:К72:Н2 3 + + + + + О124:К72:Н12 Четвертий день Враховують результати визначення рухливості бактерій та біохімічних властивостей. На підставі цих тестів встановлюють належність виділених бактерій до роду Escherichia. Проводять облік результатів біохімічного типування Для визначення Н-антигену використовують метод заснований на принципі іммобілізації у напіврідкому агарі рухливих бактерій у присутності Н-сироватки що відповідає їх Н-антигену. Для цього пересівають уколом з напіврідкого агару рухливі штами ешеріхій віднесені за результатами реакції аглютинації на склі до ентеропатогенних різновидів на ряд пробірок з напіврідким 0 3% агаром кожна з яких містить одну з Н-сироваток і інкубують18 – 20 годин при 22-27 ?С. У пробірці у якій сироватка відповідає Н-антигену засіяного штаму бактерії ростуть уздовж лінії уколу. В інших пробірках що містять сироватки не відповідні Н-антигену досліджуваного штаму бактерії при вирощуванні вільно поширюються і викликають дифузне помутніння всього середовища. Н-антиген в антигенній формулі штаму позначають по найменуванню Н-сироватки у присутності якої відбулася іммобілізація бактерій. Наприклад рухливий штам ешерихій 055:К5 іммобілізувався в присутності сироватки Н6. Його повна антигенна формула позначається 055:К5:Н6. Приготування діагностичного середовища напіврідкого агару що містить Н-сироватку здійснюють з дотриманням всіх правил асептики. Ампулу із сухою сироваткою розкривають і розчиняють вміст ізотонічним розчином NaCl. Вміст ампули змішують з попередньо розтопленим і охолодженим до 45-50 ?С напіврідким 0 3% поживним агаром і не допускаючи застигання середовища розливають по 2 5 см3 у стерильні бактеріологічні пробірки. Для контролю стерильності пробірки з застиглим діагностичним середовищем поміщають у термостат на 48 годин при 37 ±1 ?С. Пересів ешеріхій на диференційний ряд із сахарозою дульцитом саліцином сорбітом рафінозою і рамнозою для одержання додаткових ферментативних “міток” штаму. Ці дослідження не проводять з різновидами ешеріхій виділеними із середовища Кесслер які не відносяться до ентеропатогенних. П'ятий день Облік результатів визначення Н-антигену. В остаточній відповіді вказують кількість виявлених ентеропатогенних різновидів ешеріхій у 1 г/см3 досліджуваного продукту з вказівкою їх антигенної формули результати дослідження виділень потерпілих і реакції аглютинації з кров'ю потерпілих на наявність аглютинінів до гемокультури в динаміці. Крім вище згаданих сероварів ешеріхій з 1982 року у світі реєструються харчові отруєння викликані ентерогеморагічними кишковими паличками О157:Н7. Біохімічною ознакою що відрізняє їх від інших кишкових паличок є відсутність здатності ферментувати сорбітол і продукувати фермент ?-D-глюкуронідазу. За іншими біохімічними властивостями E.coli О157:Н7 практично не відрізняється від інших E.coli крім того вона лактозопозитивна що ускладнює її пошук. Тому для виділення E.coli О157:Н7 використовують поживне середовище яке має такий самий механізм дії як і середовище Ендо але замість лактози воно містить сорбітол “Сорбітол Е соІі 157: Н7 агар” . Середовище виробляє Державний науковий центр прикладної мікробіології Росія м.Оболенськ . Колонії E.coli О157:Н7 на цьому середовищі середньої величини випуклі круглі безбарвні прозорі в той час як колонії інших кишкових паличок забарвлюються в червоний колір. В усьому іншому схема дослідження не міняється. Серологічна ідентифікація передбачає виявлення О- та Н-антигенів у E.coli О157:Н7. Визначення цих антигенів проводиться в реакції аглютинації на склі з ешеріхіозними сироватками до E.coli О157:Н7 що випускаються АТОВ “Біомед” ім.Мечнікова Росія або латексним антитільним діагностикумом виробництва ДНЦПМ Росія м. Оболенськ . Для бактеріологічної діагностики гастроентероколітів подібних до холери в разі відсутності відповідних бактеріологічних знахідок доцільно залучати методи визначення ентеротоксигенності виділених культур Е соІі. З цією метою можуть бути використані методи серологічної ідентифікації термолабільного ентеротоксину Імуноферментний аналіз або Ко-агглютинація з антисироватками до термолабільного ентеротоксину . Опосередковану інформацію щодо ентеротоксигенності виділених штамів Е соІі а також ентеробактерій інших родів наприклад: клебсіел ентеробактерів цітробактерів тощо можна отримати за рахунок реакції манітрезістентної гемаглютинації Методичні рекомендації “Выявление патогенності ешерихий на питательных средах” МОЗ України 1991 . Критерії. У разі виділення з інкримінованих харчових продуктів ентеропатогенних ешеріхій за результатами серологічної ідентифікації та ентеротоксигенних ешеріхій за визначенням ентеротоксигенності прямими чи опосередкованими методами в кількості 102 КУО в 1г/см3 паралельно з виділенням аналогічного збудника з матеріалу від потерпілих при наявності клінічних проявів притаманних харчовим отруєнням та відповідних епідеміологічних даних випадок слід розцінювати як харчову токсикоінфекцію зумовлену слабовірулентними штамами ентеропатогенних або ентеротоксигенних ешеріхій. В разі виділення з інкримінованих харчових продуктів Е.соІі з невизначеними серологічними або патогенетичними характеристиками в кількості ? 106 КУО в 1г/см3 або вищій за показник БГКП для даного продукту при наявності клінічних проявів притаманних харчовим отруєнням та відповідних епідеміологічних даних незалежно від виявлення аналогічних штамів Е.соІі в матеріалі від потерпілих випадок слід розцінювати як харчову токсикоінфекцію спричинену умовно-патогенними Е.соІі На користь етіологічного значення ешерихій вагомим свідченням є позитивний результат аглютинації штамів виділених у вогнищі з сироватками крові потерпілих т. зв. аутовідаль . 12. БАКТЕРІЇ РОДІВ PROTEUS MORGANELLA PROVIDENCIA 12.1. Загальні положення Бактерії родів Proteus Morganella та Providencia представлені грамнегативними безкапсульними в основному рухливими бактеріями властивості яких відповідають загальній характеристиці родини Enterobacteriaceae. Вони добре ростуть на звичайних поживних середовищах є факультативними анаеробами не утворюють цитохромоксидази ростуть у присутності КСN дають позитивну реакцію MR і негативну реакцію VP не ферментують лактозу арабінозу дульцит не володіють декарбоксилазою лізину і дегідролазою аргініну не утилізують малонат. Серед біохімічних властивостей бактерій вказаної групи особливо характерним являється дезамінування фенілаланіну що відрізняє їх від ентеробактерій інших родів. Виражена гетерогенність бактерій цей групи проявляється у варіабельності їх по відношенню до ряду субстратів зокрема до маніту сахарози адоніту гліцерину інозиту мальтози саліцину сечовини желатину орнітину утилізації цитрату у середовищі Сімонса. Ці властивості мають значення для внутрішньородової і внутрішньовидової диференціації. Біохімічна характеристика родів Proteus Morganella Providencia наведена в табл. 22. Таблиця 22 Основні біохімічні відмінності родів Proteus Morganella Providencia Тести Proteus Morganella Providencia Феномен справжнього роїння + - - Утворення індолу -* + +* Гідроліз желатини + - - Гідроліз сечовини + +** + Утворення сірководню +*** - - Утворення кислоти з: манози - - + ксилози + - - Умовні позначення: * – за виключенням P.vulgaris та М.heimbachae ** – за виключенням Providencia stuartii *** – за виключенням P.myxofaciens У етіології харчових токсикоінфекцій провідну роль грають бактерії роду Proteus. Захворювання можуть виникати при вживанні продуктів рясно контамінованих цим збудником. Це можуть бути м'ясні вироби особливо з рубаного м'яса рибні блюда овочеві салати та ін. До роду Proteus відносяться бактерії що крім перелічених властивостей характерних для всієї групи Proteae розріджують желатин гідролізують сечовину продукують сірководень не ферментують маніт інозит сорбіт арабінозу рафінозу звичайно не утворюють ацетилметилкарбінола і дають позитивну реакцію MR. У відношенні ферментації сахарози саліцина й утилізації цитрату поводяться по-різному. На підставі розходжень по деяких ферментативних властивостях можлива диференціація роду Proteus на види: P.vulgaris P.mirabilis P.myxofaciens та P.penneri. Характерним для бактерій роду Proteus є розлитий ріст феномен роїння на твердих агарових середовищах як при 20-25 ?С так і при 37 ?С. Рідко зустрічаються і нерухомі варіанти 0-форми . Останніми дослідженнями встановлено що до 25% ізолятів P.stuartii і до 40% штамів P.rettgeri можуть давати феномен роїння. Більшість штамів здатні до роїння після інкубації при 30 ?С або при зниженні щільності агару 1 3% . Для роїння провіденцій характерно утворення поліморфних структур у вигляді дерев протуберанців але не класичних концентричних кіл. У практичних лабораторіях для визначення належності виділених бактерій до роду Proteus та внутрішньородової диференціації достатньо використовувати обмежене число тестів таблиця 23 . Таблиця 23 Мінімальний набір біохімічних тестів для віднесення виділеного штаму до роду Proteus Тест або субстрат Proteus mirabilis myxofaciens penneri vulgaris Утворення індолу - - - + Реакція VP ? + - - Цитрат Сімонса ? + - ? частіше- Утворення сірководню + - ? частіше- + Орнітиндекарбоксилаза + - - - Ферментація з утворенням кислоти: мальтози - + + + сахарози ? частіше- + + + ксилози + - + + Бактерії родів Morganella та Providencia також можуть бути причиною харчових токсикоінфекцій. Їх біохімічні характеристики що використовуються для внутрішньовидової диференціації представлені в таблицях 24 і 25. Таблиця 24 Біохімічні характеристики підвидів Morganella morganii Біологічна група Підтип Лізин декарбокси-лаза Орнітин декарбокси-лаза Чутливість до тетрацикліну A morganii - + ? B morganii + + + C morganii - - - D morganii + - + E sibonii + + - F sibonii + - - G sibonii - + + Таблиця 25 Біохімічні властивості бактерій роду Providencia Тест або субстрат P.alcalifa-ciens P.heimba-chae P.rettgeri P.rusti-gianii P.stua-rtii Утворення індолу + - + + + Цитрат Сіменса + - + ? частіше- + Ферментація: глюкози газ ? частіше+ - - ? - арабітола кислота - + + - - галактози кислота - + + + + інозита кислота - ? + - + маніта кислота - - + - - рамнози кислота - + ? - - трегалози кислота - - - - + Антигенна структура бактерій родів Proteus Morganella Providencia подібна до антигенної структури інших бактерій родини Enterobacteriaceae. Вона формується із соматичних О- і джгутикових Н-антигенів у деяких випадках у протеїв визначаються поверхневі соматичні К-антигени. О-антигени термостабільні представляють собою ліпополісахардно-білкові комплекси; Н-антигени термолабільні і мають білкову природу. У 1950 році створена загальна антигенно-діагностична схема для P.vulgaris P.mirabilis. В ній представлені 49 серологічних О-груп і 19 Н-антигенів. Було також встановлено що О- і Н-антигени можуть мати мозаїчну будову. У 1967 році створена антигено-діагностична схема для M.morganii в яку увійшли 32 О-групи та 25 Н-антигенів відмічена мозаїчність О1 групи у зв’язку з чим вона поділена на 3 підгрупи. У окремих штамів виявлені термолабільні К-антигени. Існує також антигено-діагностична схема для P.rettgeri. Серологічний варіант бактерій цих родів встановлюють по поєднанню О- та Н-антигенів з урахуванням їх факторного складу. 12.2. Бактеріологічні дослідження Другий день Переглядають титраційні посіви на скошеному МПА. При наявності повзучого ніжного вуалеподібного росту визначають титр по найменшій кількості засіяного матеріалу у якому виявлений ріст бактерій роду Proteus. Після інкубації протягом 18-24 годин у термостаті при 37±1 ?С чашки з посівами переглядають і відзначають колонії що підлягають подальшому дослідженню. На середовищі Плоскірева бактерії родів Proteus Morganella та Providencia ростуть у вигляді прозорих колоній злегка лужать середовище що зафарбовується біля них у жовтуватий колір. При більш тривалому збереженні чашок з посівами колонії каламутніють а їх центр здобуває буре фарбування. На вісмут-сульфіт-агарі через 48 годин штами бактерій роду Proteus виростають у вигляді ізольованих колоній зеленого кольору колір середовища під колоніями не змінюється?..Бактерії роду Providencia утворюють колонії різноманітних кольорів: від безколірних до оливково-зелених. Бактерії роду Morganella утворюють поліморфні колонії. Якщо ріст 18–24-годинної культури однорідний то для подальшого вивчення використовують не менше трьох колоній при рості різних колоній для їх вивчення треба брати більше колоній різних по зовнішньому вигляді. Для визначення родової приналежності досліджуваного штаму ізольовані колонії відсівають у пробірки із скошеним поживним агаром і комбінованим середовищем Олькеніцького Кліглера . Третій і четвертий дні Враховують результати ферментативної активності культур на середовищі Олькеніцького Кліглера . Грамнегативні культури що ферментують глюкозу гідролізують сечовину утворюють сірководень і не ферментують лактозу оцінюють як такі що належать до роду Proteus. Бактерії що ферментують глюкозу не ферментують лактозу гідролізують сечовину оцінюють як ті що відносяться до роду Morganella. Бактерії що ферментують глюкозу не ферментують лактозу не гідролізують сечовину не утворюють сірководень можуть бути віднесені до роду Providencia. Із скошеного МПА роблять пересів на середовища мінімального диференційного ряду для підтвердження відношення виділеної культури до групи Proteае та на додаткові середовища для визначення роду таблиця 22 . Через 18-20 год. інкубації при 37±1 ?С враховують результати. Якщо виділена культура утворює фенілаланіндезаміназу то вона відноситься до групи Proteае. По додаткових тестах визначають рід мікроорганізму. Штами що не утворюють фенілаланіндезаміназу підлягають подальшому вивченню для визначення їх належності до інших родів родини Еnterobacteriaceae. Для прискорення досліджень отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори що зареєстровані в Україні типу ЕНТЕРОтест PLIVA-Lachema АРІ bioMereux . Після визначення роду культуру пересівають на середовища для внутрішньородової ідентифікації таблиці 23 24 25 . Враховують результати внутрішньородової ідентифікації та визначають вид мікроорганізмів. Постановку реакції аглютинації виділеної культури із сироваткою крові хворого необхідно робити повторно щоб виявити динаміку антитіл. Доказом етіологічної ролі протея є масивне виявлення ? 106 КУО в 1 г/см3 цього мікроба в харчових продуктах блювотних масах і випорожненнях а також позитивний результат реакц аглютинації виділеного мікроба із сироваткою крові потерпілих. У разі виділення інших мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae дослідження проводять за методами вказаними в “Методических указаниях по микробиологической диагностике заболеваний вызванных энтеробактериями” №04-723/3 1984г. При підозрі на кампилобактеріозну етіологію захворювання дослідження проводяться згідно “Инструкции по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза” №15-6/23. 13. ГАЛОФІЛЬНІ ВІБРІОНИ 13.1. Загальні положення До патогенних для людини представників родини Vibrionaceae роду Vibrio крім збудників холери відносяться морські галофільні вібріони Vibrio parahaemolyticus та Vibrio alginolyticus які викликають харчові отруєння холеро- та шигельозоподібні захворювання що пов’язані з вживанням в їжу продуктів моря. Найбільш характерною ознакою цих мікроорганізмів є галофілія любов до солі – нездатність до розмноження у відсутності повареної солі та стабільність до значних її концентрацій 7 – 10% . V.parahaemolyticus вважаються найбільш вірулентними і викликають тяжкі захворювання людей. V.alginolyticus виділяються рідше і лише при легких формах захворювання. Галофільні вібріони широко розповсюджені на земної кулі і є постійними мешканцями морів океанів солених озер а також гідробіонтів яки живуть в цих водоймищах. Вперше ці мікроорганізми виявлені у Японії у 1950 році в період великого спалаху харчових отруєнь пов’язаних з вживанням у їжу слабосолоної риби. В даний час цей мікроорганізм виявлений у зразках морепродуктів майже всіх континентів. Захворювання викликані парагемолітичними вібріонами є типовими харчовими токсикоінфекціями і виникають в наслідок накопичення достатньої кількості вібріонів та їх токсинів в продукті. Встановлено що при вмісті в 1 г продукту 104 – 105 вібріонів вона може бути причиною захворювання. Вірулентність. Парагемолітичні вібріони відносяться до умовно патогенних мікроорганізмів. Патогенні властивості вірулентних варіантів V.parahaemolyticus обумовлені їх здатністю продукувати сильні екзотоксини. Японськими дослідниками встановлено високу ступень кореляції між вірулентністю та здатністю викликати гемоліз на спеціальному середовищі Вагатцума. Цей тест одержав назву феномен Канагава. За його допомогою штами парагемолітичних вібріонів ділять на Канагава-позитивні вірулентні та Канагава-негативні авірулентні . Штами виділені від хворих майже в 100% Канагава-позитивні у той час як в об’єктах довкілля кількість вірулентних вібріонів залежить від сезону і значно збільшується в літньо-осінній період. Морфологічні та культуральні властивості. Парагемолітичні вібріони – поліморфні рухливі грамнегативні палички овоїдної форми. Факультативні анаероби. На твердих поживних середовищах можуть утворювати колонії декількох видів: правильної круглої форми плоско-випуклі з вологою блискучою поверхнею рівним або хвилястим краєм полупрозорі голубуваті або мутні. При рості на рідких поживних середовищах парагемолітичні вібріони викликають рівномірне помутніння та утворюють плівку. Оптимальна концентрація хлористого натрію в поживних середовищах для виявлення галофільних вібріонів знаходиться у межах 1 5-4 %. В рідких середовищах вібріони ростуть при більш високих концентраціях NaCl; середовища які містять кров не нуждаються в підвищених концентраціях солі. Оптимальна температура росту 35-37 ?С рН 7 5–8 5. Антигенна будова. Біохімічні властивості. Парагемолітичні вібріони мають три антигени: джгутиковий термолабільний – Н соматичний термостабільний – О та поверхнево-капсульний – К. Н-антиген є спільним для всіх представників біотипу parahaemolyticus. Встановлено 12 типів О-антигену і 64 - К-антигену. Серологічне типування парагемолітичних вібріонів на даний час має більш теоретичне значення так як набори аглютинуючих О і К-сироваток для реакції аглютинації РА на склі в нашій країні не виробляються. Постановка РА принципово не відрізняється від такої при ідентифікації інших мікроорганізмів. Парагемолітичні вібріони є типовими представниками роду Vibrio не тільки за морфологією а і за біохімічною активністю. Основні властивості галофільних та негалофільних вібріонів патогенних для людини диференціальні ознаки видів парагемолітичних вібріонів наведені в таблицях 26 27. Таблиця 26 Основні властивості галофільних та негалофільних вібріонів патогенних для людини Ознаки Види вібріонів V.parahae-molyticus V.alginoly-ticus V.vulnifi-cus V.mimi-cus Наявність індофенолоксидази + + + + Наявність лізиндекарбоксилази + + + + Наявність орнитиндекарбоксилази + або + + або + + або + + або + Наявність аргиніндігідролази - - - - Ріст в 1% пептонній воді: без NaCl - - - + з 3% NaCl + + + + з 5-6% NaCl + + + ? з 7-8% NaCl ? + - - з 10% NaCl - + - - Ферментація: без газу глюкози в аеробних і анаеробних умовах + + + + лактози - - + - сахарози - + - - манози + + + + арабінози ? ? - - маніту + + ? + мальтози + + + + крохмалю + + + + інозиту - - - - Утворення: ацетилметилкарбонолу - + - - індолу + + + + сірководню - - - - Продовження таблиці 26 Ознаки Види вібріонів V.parahae-molyticus V.alginoly-ticus V.vulnifi-cus V.mimi-cus Наявність: желатинази + + + + лецитинази + + + + каталази + + + + ?-галактозидази ONPG - - + + уреази - - - - Редукція нітратів в нітрити + + + + Рухливість монотрихі + + + + Примітка: + позитивний; + повільний; - негативний Таблиця 27 Диференціальні ознаки галофільних вібріонів патогенних для людини Найменування тестів V.parahemolyticus V.alginolyticus V.vulnificus Розщеплення: лактози - - + сахарози - + - маниту + + ? Утворення ацетилметилкарбинолу - + - Наявність ?-галактозидази ONPG - - + Ріст в пептонній воді: з 7% NaCl + + - з 10% NaCl – + – Феномен роїння ? ? - Примітка: + позитивний; - негативний; ? рідко Другий день 1. Пересів матеріалу з поверхні 2-го середовища збагачення на лужний агар та бакагар Плоскірева. 2. Перегляд чашок з первинними посівами. Підозрілі на галофільні вібріони колонії а також лактозонегативні колонії з середовища Плоскірева відсівають в ПВ без NaCl і тією ж петлею без обпалювання – в глюкозо-лактозне середовище Ресселя уколом в стовпчик та штрихом по поверхні . Третій день 1. Вивчення посівів з 2-го середовища збагачення та виділення підозрілих культур проводять за другим днем дослідження. 2. Облік характеру росту культур на середовище Ресселя та ПВ без NaCl для подальшого дослідження на галофільні вібріони. відбирають культури які не ростуть на ПВ без NaCl розщеплюють глюкозу без утворення газу та мають позитивну реакцією на індолфенолоксидазу на папері. Роблять їх мікроскопію в пофарбованих за Грамом препаратах і підрахунок з наступним перерахуванням на 1 г продукту за загальноприйнятою методикою. Культури з грамнегативними поліморфними паличками трошки вигнутими прямими або овоїдними продовжують досліджувати. 3. Відібрані культури засівають на такі середовища що містять 3% NaCl: * 0 3% та 1 5% лужні агари; * Хью-Лейфсона з глюкозою Гіса з сахарозою манозою арабінозою лактозою манітом Кларка; * з амінокислотами; * бульйон з індикаторними папірцями на індол та сірководень. При необхідності визначення вірулентності виділених галофілів за їх гемолітичним властивостям проводять пересів культур петлею із сольового бульйону на сектора добре підсушеної чашки з кров'яним сольовим агаром середовище Wagatsuma . Інкубують при 35?1 ?С 18 – 20 годин. Вірулентні штами викликають на середовищі гемоліз еритроцитів. Четвертий день 1. Облік результатів ідентифікації визначення виду та біотипу виділених культур з 1-го середовища збагачення. Видача попередньої відповіді. 2. Культури ізольовані з 2-го середовища збагачення досліджують за схемою третього дня дослідження. П’ятий день 1. Облік результатів ідентифікації визначення виду та біотипу виділених культур з 2-го середовища збагачення. Видача заключної відповіді. Критеріями діагностики захворювань викликаних V. рarahaemolyticus є виявлення їх у випорожненнях хворих та підозрюваному продукті в кількості 106 і більш живих клітин у 1 г/см3. 14. БАКТЕРІЇ РОДУ LISTERIA – listeria monocytogenes 14.1. Загальні положення В останні роки бактерії роду лістерій включені в перелік мікроорганізмів які викликають важкі форми харчових отруєнь з різко вираженими ознаками ураженням нервової системи типу менінгіту менінгоенцефаліту або енцефаліту. Род Listeria за Визначальником бактерій Берджі 9 видання відноситься до 19 групи мікроорганізмів – грампозитивні неспороутворюючі палички правильної форми і включає 7 видів. В патології людини має значення два види: L. monocytogenes та L. ivanovii рідко . Мікроорганізми що відносяться до цього роду являють собою невеликі коковидні грампозитивні палички з тенденцією до утворення ланцюжків з 3-5 або більше клітин у гладкій формі . У шорсткуватій R-формі подовжені або нитковидні. Розмір лістерій залежить від умов культивування температури вирощування та інтенсивності посіву. Зустрічаються вигнуті форми мікроорганізму з потовщенням на кінцях іноді з'єднаних у вигляді римської цифри V. Спор та капсул не утворюють. Однак при низьких температурах вирощування можуть оточуватись капсулоподібною речовиною. Лістерії добре фарбуються аніліновими фарбниками. Молоді культури грампозитивні однак по мірі старіння зустрічаються грамнегативні палички. Стійки до метиленової сині чутливі до генціан- кристалвіолету фуксину що використовується для їх диференціації. Мають один термінально розташований джгутик іноді 3 - 4 бокових. Лістерії рухомі при температурі 20-25 ?С. Ця здатність збільшується при тривалих пересівах культури. S-форми колоній лістерій – дрібні випуклі з рівним краєм зернистою структурою прозорі безкольорові з голубуватим відтінком в падаючому світлі – сірувато-молочного кольору діаметром 0 5-2 мм. R-форми утворюються при довготривалому культивуванні; у колонії з’являються одно- або двосторонні бокові вирости довжина яких іноді перевищує діаметр колонії. Колонії стають мутними майже білими але зберігають гладку блискучу поверхню. По краю з’являється плоский валик. При 37 ?С джгутики втрачаються і з ними втрачається рухомість. Лістерії є факультативними анаеробами оптимальна температура вирощування 30-37 ?С однак можуть розмножуватись і при більш низьких температурах. Ростуть на звичайних поживних середовищах більш пишний ріст спостерігається при вирощуванні на середовищах з додаванням сироватки. Однак оптимальними для них є глюкозо- 1% гліцерино- 2% сироваточний 3-5% агар. На простих поживних середовищах МПА МПБ з додаванням 1% глюкози ріст появляється через 24 години іноді буває затримка його при виділенні лістерій з клінічного матеріалу. Добові колонії на чашках з МПА дрібні круглі слабо випуклі з рівним краєм напівпрозорі ледь помітні неозброєним оком через 48 годин – розмір колонії достигає до 1-2 мм. При густому посіві на скошеному агарі через добу спостерігається ріст у вигляді тонкого напівпрозорого сіруватого нальоту який видно неозброєним оком. Слід пам'ятати про нерівномірність росту культури – на фоні більш прозорого суцільного росту часто бувають невеликі білуваті вкраплення що імітує ріст сторонніх колоній. На МПБ культура дає слабке рівномірне помутніння без плівки на дні осад який при струшуванні підіймається у вигляді “косички”. Лістерії каталазопозитивні ферментують з утворенням кислоти без газу глюкозу мальтозу рамнозу левульозу ескулін та саліцін; уповільнено сахарозу гліцерин лактозу не ферментують маніт дульцит арабінозу рафінозу сорбіт. Індол не утворюють желатину не розріджують сірководень не утворюють на звичайних поживних середовищах однак при вирощуванні на середовищах з амінокислотами бульйон Хоттінгера можуть утворювати його. Сечовину не гідролізують в реакціях MR та VP – позитивні. На середовищах з глюкозою левульозою саліцином лістерії мають – типовий "кислуватий" запах що нагадує запах сиру або молочної сироватки. На кров'яному агарі через 24 години утворюють маленькі до 1 мм в діаметрі голубувато-білі колонії з вузькою зоною ?-гемолізу навкруги. Лістерії стійки до NaCl зберігають життєздатність у 18-24% розчинах його. Лістерії патогенні для багатьох видів ссавців в тому числі гризунів комахоїстивних а також птиць. З лабораторних тварин найбільш чутливими є кролі морські свинки та білі миші. При внутрішньо мозковому зараженні білих мишей загибель настає на 1-4 день з ознаками сепсису при підшкірному та внутрішньом'язовому – на 3-14 з характерним ураженням внутрішніх органів крапкові некротичні вузлики . Лістерії стійкі у довкіллі ростуть при широкому діапазоні температур 3-42 ?С рН від <5 5 до 9 5 . В ґрунті при помірній та низькій температурі зберігаються місяцями а при сприятливих умовах можуть розмножуватися. На зерні при низьких температурах зберігаються до 3 років. Бактерії інтенсивно розмножуються у молоці м’ясі овочевих салатах свіжих фруктових соках навіть при низьких температурах 4-6 ?С. Витримують прогрівання при 58 ?С при 70 ?С вони гинуть через 20-30 хв. при 100 ?С через 3-5 хв. Чутливі до дезінфекційних засобів. Факторами поширення лістеріозу як правило є продукти тваринного походження м'ясо птиця та продукти з них. Переважає при цьому м'ясо птахів. Інфікованими можуть бути жирові продукти тваринного походження крім топлених жирів. Молоко молочні продукти сири посідають значне місце в поширенні лістеріозу. Можливе поширення інфекції через рибу устриці жаби молюски креветки тощо. Інфікованими можуть виявитися продукти рослинного походження овочі фрукти та холодні блюда з них що не підлягають термічній обробці салати супи . 14.2. Бактеріологічні дослідження Другий день Через 18-24 години переглядають посіви. З підозрілих колоній готують мазки і фарбують по Граму. Характерну за морфологічними та тінкторіальними властивостями культуру пересівають на 2-3 пробірки зі скошеним МПА для отримання чистої культури. Переглядають характер росту на середовищі збагачення і роблять висів на чашки Петрі з глюкозо-гліцеріно-сироваточним і кров'яним агарами. Характер росту на рідких та щільних поживних середовищах викладено у загальному положенні. Якщо на чашках підозрілі колонії відсутні відповідь видають тільки після результатів висівів з середовищ збагачення. В більшості випадків ріст лістерій відбувається на 2-3-день. Третій день Проводять ідентифікацію культури що виросла на скошеному МПА. Підтверджуючі тести родової і видової ідентифікації включають фарбування за Грамом визначення рухливості виділених на агаризованих середовищах типових по фізіологічних і морфологічних ознаках культур їх здатності відновлювати нітрати до нітритів зброджувати рамнозу ксилозу і маніт здатності до гідролізу лецетину на середовищі з активованим вугіллям а також визначення наявності ?-гемолізу на кров'яному агарі і диференціацію L. monocytogenes від інших гемолизуючих лістерій у САМР-тесті з контрольними штамами Staphylococcus aureus і Rhodococcus equi. При необхідності ставлять біологічну та керато-кон'юнктивальну проби та імунофлюоресценцію Для визначення належності виділених мікроорганізмів до роду Listeria отримані на середовищах культивування чисті культури мікроскопують за Грамом визначають наявність у них каталази рухливість при двох температурах інкубації – 22 і 37 ?С здатність до ферментації маніту і ставлять реакцію редукції нітратів. Фарбування за Грамом. Бактерії роду Listeria є грампозитивними тонкими короткими паличками спор не утворюють. Рухливість культур визначають посівом уколом у середовище для визначення рухливості лістерій і інкубації при двох температурах – 25±1 ?С і 37±1 ?С протягом 48-72 год. Бактерії роду Listeria рухливі при 20-25 ?С утворюють характерний схожий на парасольку ріст навколо лінії уколу і нерухомі або слабо рухомі при 35-37 ?С. Утворення каталази. Реакцію ставлять з охолодженої до кімнатної температури добовою культурою на стерильному предметному склі. Ізольовану колонію узяту з поверхні поживного середовища скляною паличкою або платиновою петлею розтирають на склі і піпеткою наносять краплю 3 % розчину перекису водню. При позитивній реакції через 30-60 сек. на склі з'являються пухирці газу. Паралельно ставлять контрольну пробу. Бактерії роду Listeria є каталазопозитивними. Гемолітична активність. ?-гемоліз визначається шляхом посіву чистих культур на кров'яний агар який витримують добу в термостаті при 37 ?С і 24 години при температурі 20-25 ? С. Здатність зброджувати вуглеводи. Чисту культуру пересівають на середовища Гиса. Посіви інкубують 7 діб при 37±1 ?С наявність ферментативної активності у відношенні вуглеводів визначають по зміні кольору середовищ за рахунок утворення кислоти. Більшість бактерій роду Listeria не утилізують маніт за винятком L. grayi та L. grayi subsp. murrayi . Визначення нітрат-редукції проводять за ГОСТ 10444.8-88. Бактерії роду Listeria не відновлюють нітрати до нітритів за винятком L. grayi і L. grayi subsp. murrayi . Виявлення в посівах грампозитивних коротких тонких паличок каталазопозитивних що не відновлюють нітрати до нітритів не утилізують маніт рухливі при 25±1 ?С і нерухомі при 37±1 ?С указує на належність виділених культур з до роду Listeria. Для підтвердження приналежності виділених лістерій до виду L. monocytogenes визначають здатність до ферментації рамнози ксилози наявність лецитиназної і ?-гемолитичної активності і проводять постановку CAMP-теста. Диференційні ознаки видів роду Listeria зазначені в табл. 28. Для видової диференціації виділених культур лістерій рекомендується використовувати біохімічні тест-системи API Listeria фірми “BioMerieux”. При їх застосуванні варто керуватися рекомендаціями виробника. САМП-тест ставлять для диференціації L. monocytogenes від інших видів лістерій що володіють ?-гемолітичною активністю. Для проведення тесту 2-3-добові культури гемолітичних штамів S. aureus і R. equi засівають на кров'яний агар з еритроцитами барана двома рівнобіжними штрихами на відстані 5 0 – 5 5 см як показано на мал. 1. Між вертикальними штрихами S. aureus і R. equi засівають рівнобіжними штрихами досліджувані культури лістерій на відстані друг від друга не менш 1 см і від вертикальних штрихів – 0 5 см. У якості контролю використовують тест-штами L. monocytogenes і L. ivanovii. Інкубують 24 години при 37±1 ?С. Визначають форму і розміри зон гемолізу біля вертикальних штрихів росту стафілокока і родокока. Listeria monocytogenes дає розширення зони гемолізу біля штриха S. aureus позитивний САМП-тест і має відсутність змін зони гемолізу поруч зі штрихом R. equi негативний САМП-тест . Визначення лецитиназної активності. Дно двох чашок Петрі із середовищем № 1 поживне середовище для культивування та підрахунку аеробних бактерій що містять: 1 чашка – жовток курячого яйця і активоване вугілля 2 чашка – жовток курячого яйця без активованого вугілля – ділять на кілька секторів або квадратів. Досліджувані культури і контрольні штами лістерій пересівають паралельно короткими штрихами на відповідні сектори чашок з вугіллям і без нього. Інкубують 48 год. при 37±1 ?С. Чашки переглядають у минаючому світлі і визначають наявність активності в присутності і у відсутності активованого вугілля порівнюючи з контрольними висівами музейних штамів. Listeria ivanovii дає щільну зону помутніння шириною 3-6 мм незалежно від присутності активованого вугілля. Listeria monocytogenes дає аналогічну зону помутніння в присутності активованого вугілля і не дає при відсутності вугілля. Інші види лістерій не дають зони помутніння. Імунофлюоресценція – при фарбуванні лістерійними люмінесціюючими антитілами відбувається специфічне світіння типових клітин на 3-4+. Біологічна проба – ставиться на білих мишах підшкірним або внутрішньом'язовим зараженням в дозі 0 3-1 см3 добової зависі культури 105-106 м.к. . Лістерії викликають загибель тварин на 3-6 добу. При розтині виявлять численні некротичні вогнища у печінці селезінці нирках та міокарді. Керато-кон'юнктивальна проба- проводиться шляхом нанесення на слизову оболонку ока морської свинки 2-3 крапель добової бульйонної культури лістерій. Через 18-24 години з'являється набряк віка гіперемія сльозотеча і через 36-72 години з ока виділяється гнійний ексудат. Четвертий – шостий день Облік результатів посівів за кожним тестом ідентифікації культури окремо таблиця 28 . Таблиця 28 Характеристика бактерій роду Listeria Ознака L.mono-cytogenes L.ivano-vii L.see-ligeri L.inno-cua L.grayi L.wel-shimeri Ферментація: маніту - - - + - ксилози - + + - - + рамнози + - - +/- +/- +/- ?-гемоліз + + + - - - CAMP-тест збільшення гемолізу біля штриха: R. equi - + - - - - Staphylococcus aureus + - + - - - Лецитиназна активність: на середовищі з активованим вугіллям + + - - - - на середовищі без вугілля -- + - - - - При негативних результатах перших висівів з середовищ збагачення дослідження повторюються з наступних висівів які повторюються через 7 – 10 діб протягом 3 тижнів. 15. СПОРОНОСНІ АЕРОБИ – B. cereus 15.1. Загальні положення B.сereus ґрунтовий мікроорганізм надзвичайно широко розповсюджений у довкіллі – воді повітрі і пилу приміщень на устаткуванні й апаратурі підприємств харчової промисловості і громадського харчування. Завдяки широкому поширенню в довкіллі B.сereus часто виявляється в продуктах харчування де при сприятливих умовах розмножується до кількостей 106-107 у 1 г і може викликати харчові отруєння. Низька вимогливість до умов необхідних для росту приводить до того що B.сеrеus може розмножуватися на будь-якому продукті харчування і внаслідок цього практично будь-який продукт при його масивному обсіменінні даним мікроорганізмом може привести до виникнення захворювання. У зв'язку з B.сеrеus описані отруєння викликані м'ясними рибними рослинними і молочними продуктами кондитерськими виробами. За сучасною класифікацією B.сеrеus віднесений до роду Bacillus групи 18 “Грампозитивні палички і коки що утворюють ендоспори” яка поєднує 25 видів. У мазках з поверхні скошеного агару пофарбованих за Грамом B.cereus має вид великих грампозитивних паличок зі злегка закругленими кінцями що лежать у вигляді ланцюжків чи штахетоподібних скупчень рідше – окремо один від одного. У висячій краплі рухливі однак можуть зустрічатися штами зі слабко вираженою рухливістю близько 15% і навіть зовсім позбавлені рухливості менш 0 5% . На поверхні МПА утворюють великі розпластані колонії білого кольору зі злегка порізаними краями. На середовищах з жовтком колонії оточені широкою зоною глибокого рівномірного білого-матового коагуляту позитивна реакція на лецитиназу . На поліміксинових середовищах із ТТХ 2 3 5 трифенилтетразолій хлорид колонії B.cereus зернисті матові яскраво рубінового кольору на тлі зони білого коагуляту. На кров'яному агарі колонії B.cereus сіруватого забарвлення зернисті у відбитому світлі з перламутровим відливом у минаючому світлі оточені зоною гемолізу різної інтенсивності. На стовпчику скошеного агару B.cereus дає суцільний білий ріст іноді борошнистого виду. Ріст цього мікроорганізму на рідких поживних середовищах супроводжується помутнінням бульйону утворенням пластівчастого осаду білого кольору 25-30% штамів і ніжної білої плівки на поверхні середовища. Усі штами B.сеrеus згортають молоко частково пептонізуючи його на 6-10 добу. Близько 85% штамів розріджують желатин протягом 1 – 4 діб. Усі без винятку штами B.cereus дають позитивну реакцію на лецитиназу й ацетилметилкарбінол розщеплюють до кислоти глюкозу і мальтозу а частина штамів – також сахарозу гліцерин декстрин лактозу галактозу інулін і дульцит. Оптимум росту для B.cereus 30 ?С однак спори його можуть проростати в широкому інтервалі температур – від 3-5 до 70 ?С і давати ріст при 6-55 ?С близько 4% а при температурі 12-39 ?С досить інтенсивне зростання дають усі штами даного мікроорганізму. B.сеrеus здатний давати ріст у широкому інтервалі рН від 4 до 12 5 і найбільше інтенсивно від 7 до 9 5. Досить стійкий він до дії повареної солі цукру коптильних препаратів. Поварена сіль затримує розмноження цього мікроорганізму лише при 10-15% змісті. B.cereus легко і швидко утворює спори. Вміст спор вже в 2-добовій культурі складає до 50% від загального числа клітин даного мікроорганізму. При цьому спори B.cereus мають досить високу температурну стійкість і можуть виживати не тільки при звичайних методах технологічної обробки їжі варіння обсмажування кип'ятіння але і при стерилізації молока і консервів. Критеріями діагностики захворювань викликаних B.cereus є: виявлення B.cereus у підозрюваному продукті харчування в кількості більш ніж 105 у 1 г; виявлення B.сereus у випорожненнях блювотних масах або промивних водах шлунку в кількості 102-103 у 1 г/см3; виявлення B.cereus у випорожненнях більшості потерпілих при розслідуванні отруєння; виявлення B.cereus при спорадичних захворюваннях у випорожненнях потерпілого тільки в гострий період захворювання з наступним зникненням цього мікроорганізму з кишкового вмісту до моменту видужання. 15.2. Бактеріологічні дослідження Другий день Вивчають морфологію колоній що виросли мікроскопію мазків пофарбованих за Грамом і підраховують типові колонії. Штами B.cereus на середовищі Никодемуса утворюють великі білі розпластані колонії зі злегка порізаними краями оточені широкою зоною білого рівномірного матового коагулянту або подвійною зоною – коагулянт і просвітління. На сольовому поліміксиновому агарі з 2 3 5-ТТХ вони утворюють яскраво рубінові колонії на тлі широкої зони глибокого рівномірного білого коагуляту; колонії з перших годин росту – округлі опуклі надалі 24–48 годин розпластані на поверхні агару з порізаними краями. На кров’яному агарі колонії розпластані зернисті з широкою зону гемолізу. Для визначення B.cereus у досліджуваному об'єкті кількість типових колоній що вирослі на чашках множать на відповідне розведення і виражають у перерахунку на 1 г/см3 досліджуваного об'єкта. Пересівають 3 – 5 колоній на скошений агар з наступною інкубацією 18 – 24 години при температурі 30 – 37 ?С. Третій день Вивчають характер росту на скошеному агарі морфологію культур що виросли у пофарбованих за Грамом препаратах і перевіряють чистоту культури. Мікроскопія висячої або роздавленої краплі для встановлення рухливості виділеної культури. B.сereus у відмінності від B.аnthracis рухливі. Посів на диференційний ряд що включає: арабінозу ксилозу крохмаль маніт. Інкубація протягом 18-24 годин при температурі 30-37 ?С. Пересів на глюкозо-пептонний бульйон інкубація 48 годин при температурі 30–37 ?С для наступної постановки реакції на ацетилметилкарбінол. Четвертий день Ідентифікація виділених культур по диференційному ряду і кров'яному агару. П'ятий день Постановка реакції на ацтилметилкарбінол. Позитивна реакція відзначається у вигляді рожевого забарвлення через 2-24 години інкубації при 37±1 ?С. Остаточний облік реакції через 24 години. Характерним для B. cereus є гемолітична активність позитивна реакція на лецитиназу й ацтилметилкарбінол рухливість і відсутність здатності ферментувати маніт таблиця 29 . Таблиця 29 Диференціація B. cereus з B. anthracis та іншими аеробними споровими сапрофітами Назва Диференційні тести Гемолітична активність Лецитиназна активність Ацетилметил-карбінол Рухливість Арабіноза Ксилоза Крохмаль Маніт B. cereus + + + + - - + - B. antracis – – + - - - + – B. mycoides + + + + - - + – B. megaterium + – – + ± ± + ± B. subtilis + + – + + + + + B. pumilis + + + + + - 16. БАКТЕРІЇ РОДУ STAPHYLOCOCCUS 16.1. Загальні положення Стафілококи належать до широко розповсюджених в природі мікроорганізмів. За класифікацією Берджи вони відносяться до родини Micrococcaceae роду Staphylococcus що включає 27 видів з них декілька патогенних для людей: S.aureus S. epidermidis S.saprophyticus. Стафілококи – грампозитивні мікроорганізми сферичної форми що діляться більше ніж у двох площинах мають фермент каталазу що відрізняє їх від мікроорганізмів інших родів родини Micrococcaceae які не мають цього ферменту. Здатність деяких стафілококів коагулювати цитратну плазму крові під впливом ферменту коагулази визначає їх патогенність. Позитивна реакція плазмокоагуляції є показником патогенності стафілококів і одночасно є показником потенційної їх ентеротоксичності. Роль ентеротоксигенних стафілококів у етіології харчових стафілококових токсикозів загальновизнана і в даний час не викликає сумнівів. При цьому інвазія життєздатних бактерій не обов’язкова хоча може передумовити або супроводжувати інтоксикацію. Така особливість пояснює можливу відсутність живих стафілококів інкримінованому продукті і зумовлює негативний результат бактеріологічного дослідження. Будучи факультативними аеробами стафілококи добре ростуть на різних субстратах. Розмножуються вони однаково добре як у продуктах багатих вуглеводами так і в продуктах багатих білками не змінюючи при цьому зовнішнього вигляду кольору і смаку харчового продукту. Пов’язувати стафілококові інтоксикації з певним видом харчових продуктів у даний час не представляється можливим. Практично варто вважати що будь-який харчовий продукт може бути причиною цих захворювань або то молочні м'ясні продукти кондитерські вироби продукти рослинного походження або різні консервовані продукти. Харчові продукти що викликають стафілококові інтоксикації звичайно бувають значно забруднені золотистими коагулазопозитивними стафілококами. У грамі такої їжі виявляються сотні тисяч мільйони стафілококів. Стафілококи стійкі до дії фізичних і хімічних факторів: добре витримують висушування і дію прямого сонячного світла. У рідкому середовищі стафілококи переносять нагрівання при температурі 70 ?С протягом години а при температурі 80 ?С протягом 10 хв. Температурний оптимум 37 ?С температурні межі розмноження відзначаються в широкій зоні від 6 6 ?С до 45 ?С . Стафілококи дуже стійкі до хлористого натрію що знаходиться в продуктах при концентрації NaCl рівної 7-10% ще спостерігається їх розмноження. Цукор не перешкоджає розмноженню стафілококів і лише концентрація його більш 60% є затримуючим чинником їх росту. Продуктом життєдіяльності S.aureus є ентеротоксин особливістю якого у порівнянні із бутулінічним є його висока терморезистентність. Ентеротоксин витримує автоклавування при 120 ?С протягом 20 хв. Зниження терморезистентності ентеротоксину пов'язане з рН середовища. Так при рН 4 5 нагрівання на киплячій бані протягом 40 хв. знижує активність ентеротоксина в 10 разів а при рН 3 0 ентеротоксин цілком руйнується. Встановлено що фільтрати культур S.aureus що викликали харчові інтоксикації являють собою комплекс різних білкових речовин специфічних поліпептидів що містять антигенно різні типи ентеротоксинів. В даний час відомо вже 6 типів стафілококових ентеротоксинів що позначені буквами латинського алфавіту А В С D E F. Однак техніка одержання очищених ентеротоксинів необхідних для виготовлення антиентеротоксичних сироваток пов'язана з великими методичними труднощами і дотепер ці сироватки є тільки в деяких високоспеціалізованих лабораторіях. 16.2. Бактеріологічні дослідження Другий день 1. Переглядають посіви на чашках з жовточно-сольовим агаром ЖСА або середовищем Байрд-Паркер і з окремих типових колоній готують препарати фарбують їх за Грамом і мікроскопують. Колонії S.aureus на ЖСА мають форму правильних дисків від 2 до 4 мм у діаметрі з рівними краями і помірно опуклою поверхнею оточені зоною лецитиназної активності. Колонії не прозорі і пофарбовані в колір пігменту утвореного мікробами від білого до оранжево-жовтого кольору . На середовищі Байрд-Паркер колонії S.aureus круглі випуклі середнього розміру чорного кольору блискучі із зоною лецитиназної активності При виявленні грампозитивних коків для подальшого вивчення роблять відсів чистих культур на скошений агар інкубують при 37±1 ?С 18 – 24 години. 2. При відсутності росту на ЖСА підозрілих на S.aureus колоній роблять висів із середовищ збагачення на сектори щільних середовищ. Із сольових бульйонів проводять висів на МПА з глюкозою або з кров'ю з цукрових бульйонів на ЖСА. Третій день 1. Проводять підрахунок колоній стафілококів що виросли при первинному посіві продукту на ЖСА або середовищі Байд-Паркер і роблять перерахунок їх числа на 1 г/см3. Кількісний облік стафілококів що виросли при посіві матеріалу від хворих не роблять. 2. Перевіряють у мазках пофарбованих за Грамом чистоту культур на скошеному агарі і визначають їх патогенність у реакції плазмокоагуляції. Реакція плазмокоагуляції Для постановки реакції плазмокоагуляції РПК використовують комерційний препарат який представляє собою ліофілізовану під вакуумом плазму кролячу цитратну в скляній ампулі. Вміст ампули розчинити в 1 або 2 см3 стерильного 0 9% розчину хлориду натрію і розвести із розрахунку 1:5 тим же розчином. По 0 5 см3 плазми розведеної 1:5 внести в стерильні пробірки з пробками і по одній петлі досліджуваної добової агарової культури ретельно розтерти у плазмі. Одну пробірку з плазмою залишають незасіяною як контроль. Пробірки поміщають у термостат при 37±1 ?С. Облік результатів проводять згідно інструкції до препарату через 3 – 18 – 24 години. Ступінь коагулювання плазми відзначають знаками «+». РПК вважають позитивною починаючи з 2+ до 4+. При реакції на 2+ утвориться невеликий компактний згусток у той час як у реакції на 1+ згусток дифузійний. З метою прискорення дослідження для РПК замість добових агарових культур можна застосовувати 2–3-годинні бульйонні культури додаючи їх по 2 краплі до 0 5 см3 розведеної плазми. Облік результатів коагуляції плазми в даному випадку проводять у терміни від 30 хвилин до 2 – 4 годин. При відсутності коагулазопозитивних стафілококів при первинному посіві на щільні середовища вивчають колонії виділені із середовищ збагачення як описано в розділі “Третій день”. Для оцінки результатів дослідження на S.aureus при харчових отруєннях вказується кількісне обсіменіння ними харчових продуктів що у цих випадках виражається в сотнях тисяч і більш на 1 г продукту. Кількісний облік коагулазопозитивних стафілококів у харчових продуктах служить непрямим показником наявності в них ентеротоксинів. Цей показник варто використовувати враховуючи у кожному конкретному випадку характер харчового продукту технологію його приготування спосіб і час зберігання. Орієнтовними критеріями можуть бути: * рівень контамінації стафілококами підозрюваного продукту ? 105 КУО/см3; * рівень контамінації матеріалу від потерпілих блювотні маси промивні води шлунку випорожнення ? 103 КУО/см3. Належність виділених стафілококів до S.aureus. Ідентичність штамів стафілококів ізольованих з матеріалу від потерпілих з підозрюваних продуктів та від джерела хворий носій . Примітка: Такі кількісні критерії є провідними для бактеріологічної діагностики харчових токсикоінфекцій і не є обов’язковими в разі встановлення етіології харчової інтоксикації. В даний час при стафілококових інтоксикаціях серологічні реакції з кров'ю потерпілих не ставлять. 16.3. Фаготипування S.aureus При епідеміологічному вивченні стафілококових інтоксикацій застосовують метод фаготипування стафілококів. Типуванню підлягають усі S.aureus виділені з інкримінованого продукту від потерпілих зі змивів з інвентарю устаткування та ін. Для цих цілей використовують міжнародний набір типових бактеріофагів. Дослідження проводять за методикою що наведена в Інструкції до набору. Біологічні дослідження Біологічні дослідження проводять: * для вивчення здатності виділених S.aureus утворювати ентеротоксин на поживних середовищах; * для виявлення наявності стафілококового ентеротоксина в інкримінованому продукті. В якості експериментальних тварин можуть бути використані кошенята 1 5 – 2-місячні і дорослі кішки. Біологічна проба на кошенятах. Досліджуваний продукт або п’ятидобову молочну культуру виділеного стафілокока 15 – 20 см3 згодовують кошенятам натще. Якщо кошенята не їдять даний продукт варто приготувати суспензію продукту в дистильованій воді 1:1 добре гомогенізувати і споїти по 15 – 20 см3 кожному кошеняті за допомогою піпетки або ложки. У досліді повинно бути 2 – 3 кошенята. Позитивною реакцією вважають блювоту що наступила через 30 – 60 хвилин іноді спостерігаються понос і загальна прострація. Блювота що з'являється через 5 – 10 хвилин неспецифічна. Спостереження за кошенятами ведуть протягом 4 – 5 годин. Якщо за цей період кошенята не реагують біологічна проба вважається негативною. Біологічна проба на кішках. Ентеротоксичність визначають шляхом внутрішньовенного введення матеріалу кішкам. Цей метод внутрішньовенного введення матеріалу дорослим кішкам досить чуттєвий. Недоліком методу є обмеженість його застосування для виявлення ентеротоксина безпосередньо в продуктах. Для виявлення ентеротоксичності культур користуються 0 75% агаром на телячому бульйоні або бульйоні Хоттінгера з 0 25% глюкози рН 7 4. Чашки засіяні культурами стафілококів поміщають в ексикатор з 20% вуглекислотою і інкубують 48 годин при 37 ?С. Щоб одержати в ексикаторі 20% вуглекислоти насипають на дно останнього двовуглекислу соду з розрахунку 1 г соди на кожен літр об’єму ексикатора завантажують його чашками і трошки відкривши кришку наливають піпеткою Мору 10% соляну кислоту безпосередньо на соду на 1 г соди – 8-9 мл кислоти . Після додавання кислоти кришку ексикатора швидко накривають і притирають. Після інкубації чашки виймають і на поверхню агару наливають 10 см3 фізіологічного розчину агар подрібнюють до рівномірної кашкоподібної консистенції і залишають при кімнатній температурі на 2 години. Екстракт центрифугують до одержання прозорого шару що відсмоктують прогрівають у киплячій водяній бані протягом 30 хв. і вводять кішкам у кількості 0 5 см3 на 1 кг ваги тіла у вену вуха або в стегнову вену. Наявність блювоти і поносу або тільки блювоти що наступила в терміни від 30 хвилин до 3 годин вказує на присутність ентеротоксина. Кожну кішку можна використовувати для цих цілей 3 – 4 рази. При одержанні негативних результатів у кішки що раніше була використана для аналогічних визначень необхідна перевірка на кішці що не була в досліді. За допомогою методу внутрішньовенного введення кішкам вирішувати питання про наявність ентеротоксина в харчовому продукті потрібно з великою обережністю. З продукту досліджуваного на наявність ентеротоксина готують суспензію в стерильному фізіологічному розчині таким чином щоб при наступному центрифугуванні одержати достатню кількість надосадової рідини для постановки біологічної проби. Як контроль необхідно одержати негативний результат у кішки призначеної для досліду при введенні надосадової рідини отриманої з доброякісного тотожного продукту підготовленого тим же способом що і досліджуваний зразок. 17. БАКТЕРІЇ РОДУ ENTEROCOCCUS 17.1. Загальні положення Ентерококи відносяться до роду Enterocococcus 17 групи за Bergey 1994 “Грамнегативні коки” Вони є мешканцями кишечнику людини і розглядаються як умовно-патогенні мікроорганізми що має санітарно-показове значення. У середині роду виділено 11 видів які викликають інфекційні процеси частіше всього в асоціаціях з кишковою паличкою протеєм S.aureus. Найчастіше ураження людей викликають Е. faecalis Е. faecium Е. durans. Для ентерококів характерні такі основні властивості. Ентерококи досить повільно ростуть на звичайних поживних середовищах тому для більш інтенсивного росту в середовища додають вуглеводи глюкозу лактозу багатоатомний спирт – манітол дріжджові препарати аутолізати діалізати екстракти амінокислоти аргінін аланін і ін. вітаміни рибофлавін нікотинова кислота й ін. Ріст ентерококів досягає максимуму через 36–48 годин при 37 ?С. Температурні межі росту коливаються від 10 ?С до 50 ?С у залежності від виду ентерококів. На щільних поживних середовищах ентерококи утворюють дрібні округлі колонії. При рості в рідких середовищах вони спричиняють дифузне помутніння й утворення аморфного осаду. Ентерококи стійкі до багатьох барвників кристалвіолету фуксину та ін. і антибіотиків пеніциліну стрептоміцину поліміксину тощо . У мазках з рідких середовищ ентерококи розташовуються у вигляді коротких і довгих ланцюжків у щільних – у вигляді диплококів або скупчень коків. Фарбуються за Грамом позитивно. Спор і капсул не утворюють. Як правило нерухомі але описані і рухливі варіанти з 1 – 4 джгутиками. Різко поліморфні. Поліморфізм особливо виражений у культур виділених з харчових продуктів. Серологічно ентерококи являють собою досить однорідну групу мікроорганізмів що володіє полісахаридним антигеном «Д» по Ленсфільд. У штамів Е. faecalis і його варіантів відзначена наявність видового антигену що по своїй хімічній природі є полісахаридам. Для всієї групи ентерококів характерна стійкість до 40% жовчі 6 5% хлористого натрію і високого рН 9 6 – 10 2 . Усі вони не ферментують рафінозу і не розкладають перекис водню Н2О2 тому що не виробляють фермент – каталазу. У свежовиділеніих штамів ентерококів відзначаються протеолітичні властивості. Саме ті ентерококи що володіють протеолітичними ферментами можуть зумовити харчове отруєння при вмісті 106 і більше КУО в 1 г/см3 продукту. Ентерококи є облігатними представниками нормальної мікрофлори кишечнику людини і теплокровних тварин у зв'язку з чим дуже широко поширені в довкіллі у тому числі й у різних харчових продуктах але особливо часто їх виявляють у молочних продуктах. Органолептика продуктів залежить від виду ентерокока який забруднює продукт. Так штами Е. faecium не змінюють органолептику м'ясних продуктів а молоко згортають і додають йому приємний смак кисломолочного продукту. Штами ж ентерококів що можуть викликати харчові отруєння додають продуктам неприємний гіркий смак і ослизнення але органолептичні зміни в продуктах настають коли в них міститься більш ніж 106 клітин ентерококів у 1 грамі. При лабораторній діагностиці ентерококових харчових отруєнь дослідженню варто піддавати продукти запідозрені як причина захворювання і випорожнення потерпілих. 17.2. Бактеріологічні дослідження Третій день Через 48 годин посіви переглядають. Типові колонії ентерококів мають округлу форму рівні краї блискучу поверхню діаметр 1 5 – 2 мм і бордове фарбування на світло-рожевому тлі середовища Ентерококагар або сіре з зоною протеолізу на середовищі . Підраховують усі типові колонії і число їх перераховують на 1 г/см3 продукту. 3 – 5 колоній відсівають на скошений агар для подальшої ідентифікації. На скошеному агарі посіви культивують при 37±1 ?С протягом 24 годин. Четвертий день З культури на скошеному агарі готують мазки і фарбують їх за Грамом. Одночасно визначають каталазну активність штамів. Для чого на очищене знежирене скло наносять краплю 1% водяного розчину перекису водню і в ній розтирають петлю культури якщо пухирці газу не виділяються значить реакція негативна. Грампозитивні каталазонегативні диплококи вивчають по тестам представленим у таблиці 30. Посів на середовище з 2 3 5-ТТХ не роблять тому що ця речовина входить у середовище Ентерококагар. Усі посіви поміщають у термостат при 37±1 ?С на 24 години. Таблиця 30 Диференційні ознаки ентерококів патогенних для людини Диференціальні ознаки Види ентерококів Е. faecalis E. faecium E. durans Редукція телуриту калію + – – Редукція 2 3 5-ТТХ + – – Гемоліз ?? ? ? Ферментація сорбіту + – – маніта + + – рафінози – – – рамнози + + - - сахарози + + - - арабінози - + - гліцерину + + - П’ятий день Через 24 години посіви переглядають і реєструють результати. Діагноз ентерококового харчового отруєння підтверджується якщо в інкримінованому продукті і випорожненнях хворих були виявлені протеолітичні штами ентерококів у кількостях більш ніж 106 у 1 г/см3 продукту і більш ніж 104 у грамі калу при типовій клінічній картині захворювання. 18. СПОРОНОСНІ АНАЕРОБИ – C. botulinum 18.1. Загальні положення Ботулізм – важке харчове бактеріальне отруєння з високою летальністю. В усіх країнах ботулізм пов'язаний головним чином із продуктами домашнього приготування заготовленими про запас. Загальноприйняті в домашніх умовах способи обробки харчових продуктів такі як консервування в банках копчення маринування соління та ін. не приводять до знищення збудників ботулізму і їх спор і при тривалому збереженні в цих продуктах може утворитися токсин. Збудники ботулізму широко поширені в природі. Вони виявляються у ґрунті у гної на фруктах і овочах у рибі у фуражі в екскрементах теплокровних тварин. Широке поширення збудників ботулізму в ґрунті неминуче веде до потрапляння цих мікробів на овочі і фрукти а також до обсіменіння різної сировини що йде для приготування консервів ковбас і інших продуктів. Інтенсивність зараження залежить від санітарних і технологічних умов обробки і збереження продуктів. Сьогодні відомо 8 серологічних варіантів ботулінічного токсину А В C1 C2 D Е F G. Для людини особливо небезпечними є серологічні варіанти А В Е та F а серовари ботулотоксина С та D визначались лише в поодиноких випадках. C.botulinum типів – дуже близькі за морфологією культуральним властивостям і дії їх токсинів на організм людини і тварин. Усі вони дають однакову клінічну картину хвороби. Зазначені типи ботулінічного мікроба відрізняються антигенними властивостями токсинів що вони продукують. Це означає що токсин кожного типу нейтралізується сироваткою того ж типу. По морфології C.botulinum являють собою невеликі палички довжиною 4 – 9 ммк і шириною 0 6 – 0 9 ммк з закругленими кінцями капсул не утворюють рухливі мають від 4 до 35 джгутиків. C.botulinum утворюють субтермінальні або термінальні спори; палички зі спорою мають вид тенісної ракетки. Легко фарбуються різними аніліновими фарбами. Молоді клітки фарбуються за Грамом позитивно. При старінні культури через 4–5 діб росту палички фарбуються грамнегативно. Збудники ботулізму – облігатні анаероби ростуть без доступу повітря тому звичайно розмножуються й утворюють токсин усередині великих шматків риби шинки ковбаси або в герметично закритих банках консервів. Установлено що збудники ботулізму типу Е а також непротеолітичні штами типу В і деякі штами типу F утворюють на поживних середовищах та у харчових продуктах крім токсину і нетоксичний попередник токсину – протоксин що не вбиваючи мишей при парентеральном уведенні виявляє свою біологічну активність при попаданні в шлунково-кишковий тракт людини і тварин внаслідок впливу на нього протеолітичних ферментів. При додаванні протеолітичних ферментів трипсину панкреатину in vitro також відбувається активація протоксина і перехід його у токсин. Цей феномен варто враховувати при проведенні лабораторної діагностики ботулізму. Нерідко консервні банки куди разом із продуктами попадає і C.botulinum виявляються бомбажними за рахунок утворення мікробом газу однак часто при наявності мікробів ботулізму і ботулінічних токсинів харчові продукти виглядають зовсім доброякісними і консервні банки не дають “бомбажу”. Іноді відзначається специфічний запах прогірклої олії. Найбільш придатною температурою для росту C.botulinum типів A B C D є температура 35 ?С для типів E F – 28 30 ?С. Ботулінічні токсини досить стійкі до температурних впливів. Токсин іноді руйнується тільки при кип'ятінні протягом 10-15 хвилин і не руйнується в шлунково-кишковому тракті під впливом травних ферментів. Лабораторна діагностика ботулізму має на меті виявлення ботулінічного токсину або C.botulinum в харчових продуктах що викликали отруєння а також у матеріалах узятих від хворого або в органах із трупів. При цьому важливо встановити не тільки присутність токсину або мікроба але і визначити їх тип з метою підтвердження клінічного діагнозу і призначення правильного лікування. 18.2. Бактеріологічні дослідження Перший день Проби що надійшли в лабораторію досліджують одночасно у двох напрямках: проводять виявлення ботулінічних токсинів і C.botulinum. Дві третини попередньо підготовленої як зазначено вище проби призначають для виявлення ботулінічних токсинів одна третина – для посівів з метою виявлення C.botulinum. Частину проби що досліджують на наявність токсинів витримують протягом 1–1 5 годин при кімнатній температурі для екстрагування токсинів фільтрують через ватно-марлевий фільтр або центрифугують при 2500 – 3000 об/хв. протягом 15–20 хвилин. Фільтрування через тальковий фільтр неприпустимо тому що тальк сорбує на собі ботулінічні токсини. Для виявлення ботулінічних токсинів з отриманими фільтратами або надосадовою рідиною ставлять реакцію нейтралізації токсину антитоксичною сироваткою РН . 18.2.1. Виявлення ботулінічних токсинів у реакції нейтралізації Дослідженню на наявність токсину можуть підлягати промивні води шлунку залишки їжі з шлунку сеча і випорожнення хворого секційний матеріал 2-3 шматочка по 5-10 грамів з серця печінки селезінки нирок головного мозку стінки шлунку товстого та тонкого кишечнику кров з серця харчові продукти фураж тощо. З секційного матеріалу найбільш часто токсин знаходять у печінці згустків крові вмісту кишечнику та з випорожнень роблять екстракти. Екстрагування токсинів з продуктів що містять повірену сіль проводять дистильованою водою. Настоювання досліджуваного матеріалу проводять протягом 1-2 годин. Після чого фільтрують через вату. Отримана після фільтрації рідина а також сироватки крові сеча можуть бути використані для реакції нейтралізації. Для визначення токсину в харчових продуктах враховуючи можливість гніздного розташування його проби матеріалів відбирають по 20-25 г у місцях найбільш підозрілих за органолептичними властивостями гомогенізують і заливають подвійним об’ємом фізіологічного розчину. Після 2-годинної експозиції екстракт центрифугують і ставлять РН. Примітка. Враховуючи що значна частина токсину типу Е продукується у вигляді протоксину що активізується під дією травних ферментів для виявлення токсину типу Е екстракт з продуктів перед постановкою РН рекомендується активізувати панкреатином або трипсином 1 см3 розчину ферментів на 10 см3 екстракту . Суміш екстракту з ферментом витримують при температурі 37±1 ?С протягом 2 годин. Використовуються сухі типоспецифічні діагностичні ботулінічні сироватки. В 1 см3 типоспеціфічної сироватки типу А міститься не менше 200 МО типу B не менше 100 МО типу C – не менше 150 МО типу E – не менше 200 МО типу F – не менше 50 МО антитоксину. Заборонено користатися для цілей діагностики лікувальними протиботулінічними сироватками. Для виявлення токсинів для кожної проби використовують мишей вагою 16 – 18 грамів. У зв'язку з тим що в досліджуваному матеріалі може бути один або кілька типів ботулінічних токсинів попередню реакцію ставлять із сумішшю сироваток діагностичних ботулінічних типів A B C E F. Доза сироватки що рекомендують для РН як правило забезпечує нейтралізацію гомологічного токсину в досліджуваній пробі тому що в організмі і виділеннях хворих а також в екстрактах з харчових продуктів дуже сильні токсини майже не зустрічаються. Для постановки РН готують суміш з рівних обсягів моновалентних сироваток типів A B C E F. Сироватки кожного типу набирають різними піпетками. До 1 см3 суміші сироваток A B C E F додають 4 см3 досліджуваного матеріалу витримують при кімнатній температурі не менше 30 хвилин після чого по 1 см3 суміші вводять чотирьом мишам внутрішньочеревно або підшкірно. Чотирьом контрольним мишам вводять по 0 8 см3 досліджуваного матеріалу без сироватки. Реакцію можна проводити також на 2-х морських свинках. Першій вводять внутрішньочеревно або підшкірно по 0 5 см3 суміші сироваток та 3 см3 досліджуваного матеріалу витриманого при кімнатній температурі не менше 30 хвилин. Контрольній свинці вводять 3 см3 досліджуваного матеріалу без сироватки. Спостерігають за тваринами протягом 4 днів. Якщо тварини що отримали досліджуваний матеріал без сироватки за цей час гинуть а ті що отримали досліджуваний матеріал з сироваткою залишаються живими це вказує на присутність ботулінічного токсину в досліджуваному матеріалі. Орієнтовна відповідь може бути видана на другу добу. Для визначення типу токсину у 6 пробірок розливають по 2 4 см3 досліджуваного матеріалу потім в кожну пробірку додають 0 6 см3 сироватки. В першу – типу А другу – типу В в третю – типу С четверту – типу Е п’яту – типу F в шосту вносять 0 6 см3 0 9% розчину хлористого натрію. Вміст пробірок перемішують і залишають при кімнатній температурі на 30 хвилин після чого вміст кожної пробірки вводять по 1 0 см3 двом білим мишам. Для кожної сироватки використовують окремий шприц. Для більш швидкої ідентифікації типу токсину РН з досліджуваним матеріалом ставлять одночасно з сумішшю і окремими типоспеціфічними сироватками. Облік результатів проводять попередньо через 4-6 годин через 24 години і остаточно через 4 дня. Ботулінічний токсин не дає миттєвої загибелі тварин протягом декількох хвилин або секунд миші гинуть не раніше ніж через 4 – 5 годин. Звичайно картина хвороби і загибелі мишей дуже характерна: з'являється хекання стан повного розслаблення м'язів западання черевної стінки “осина талія” паралічі і судоми перед смертю. Миші що отримали суміш гомологічного токсину і сироватки залишаються живими при загибелі усіх інших мишей. Якщо досліджуваний матеріал нейтралізується одночасно сироватками Е та F що пов’язано з наявністю спільних антигенів додатково ставлять реакцію нейтралізації з сироватками розведеними у 40 разів. При цьому нейтралізується лише гомологічний токсин. Особливу увагу потрібно звернути на постановку РН із сироваткою хворого тому що її звичайно буває мало. Варто ретельно відокремити сироватку від згустку крові який необхідно посіяти тому що при ботулізмі можна знайти в крові паличку ботулізму а із сироваткою поставити РН. У цьому випадку слід відразу поставити розгорнуту РН з моновалентними ботулінічними сироватками тільки типів А В Е тому що інші типи ботулінічних паличок зустрічаються дуже рідко. №№ пробірок Досліджу-ваний матеріал в см3 Ботулінічні сироватки в см3 Фізіологіч-ний розчин в см3 тип А тип В тип С тип Е тип F 1 пробірка 2 4 0 6 – – – – – 2 пробірка 2 4 – 0 6 – – – – 3 пробірка 2 4 – – 0 6 – – – 4 пробірка 2 4 – – – 0 6 – – 5 пробірка 2 4 – – – – 0 6 – 6 пробірка 2 4 – – – – – 0 6 При одержанні позитивного результату РН з діагностичними ботулінічними сироватками дають висновок про наявність у досліджуваному матеріалі ботулінічного токсину і вказують його тип. У випадку загибелі всіх 4-х мишей тобто тих котрим був уведений досліджуваний матеріал без сироватки і із сироваткою варто повторити РН з екстрактами розведеними в 5 10 20 і навіть 100 разів для зменшення неспецифічної токсичності сторонньої мікрофлори що звичайно присутня в блювотних масах випорожненнях органах трупів. При розведенні екстрактів стороння мікрофлора втрачає здатність убивати мишей а ботулінічні токсини володіючи звичайно більшою біологічною активністю будуть викликати загибель мишей навіть при розведенні. Тому в кращому випадку відповідь про наявність токсину в пробі може бути даний на 2 – 3 день а про його типову належність на 3 – 5 день від початку дослідження. 18.2.2. Виявлення збудників ботулізму Перший день Для виявлення збудників ботулізму роблять посів 3 – 5 см3 з попередньо підготовленого матеріалу на рідкі поживні середовища. Для первинних посівів краще використовувати середовище Вільсон-Блера або Кітт-Тароцці. Необхідно щоб рН був у межах 7 2 – 7 4. Обов'язковим є також наявність у м'ясних середовищах м'ясного або печінкового фаршу. Пробірка або флакон мають бути заповнені поживним середовищем не менш ніж наполовину. Перед посівом середовища нагрівають на киплячій водяній бані протягом 20 хвилин після чого швидко прохолоджують додають 0 5% глюкози і роблять посів. Посіви здійснюють в середовища у великих пробірках або у флаконах ємністю по 100 – 200 см3 залиті шаром вазелінової олії товщиною в 0 5 см. Краще засівати досліджуваний матеріал у великий об’єм середовища 70 0 – 150 см3 щоб культуральної рідини первинного посіву вистачило на всі дослідження постановка реакції з полівалентною сироваткою і розгорнутої РН нерідко з двох- або триразовим повторенням . Наступні пересіви досліджуваних проб з первинного посіву в ті ж рідкі поживні середовища можуть не дати токсиноутворення в середовищі очевидно через бурхливий ріст сторонньої мікрофлори. Посів проводять в чотири флакони один із яких прогрівають після посіву при 60 ?С 15 хвилин. У умовах прогрівання звичайно гинуть аероби і вегетативні форми анаеробів але зберігаються спори C.вotulinum типу Е що гинуть при 80 ?С; інший флакон прогрівають при 80 ?С 20 хвилин. Два флакони після посіву не прогрівають. Після цього усі флакони поміщають у термостат: один непрогрітий флакон і флакон прогрітий при 60 ?С інкубують при 28 ?С інший непрогрітий флакон і флакон прогрітий при 80 ?С інкубують при 35 ?С. Перші два флакони досліджують на C.вotulinum типів Е і F інші два флакони на C. вotulinum типів А В С. Якщо в досліджуваному матеріалі збудники ботулізму знаходяться переважно у вегетативній формі то ріст у посівах буде головним чином у непрогрітих флаконах. У випадку якщо в матеріалі є спорові форми ріст буде в прогрітих флаконах і в окремих випадках може відразу привести до виділення чистої культури з такого посіву. Ріст C.вotulinum характеризується нерідко сильним газоутворенням і іноді протеолізом шматочків печінки або фаршу. Залишки проб після посіву зберігають у холодильнику до закінчення дослідження. Через 48 годин після появи росту посіви досліджуються на наявність збудників ботулізму. В даний час є повідомлення закордонних учених про те що для виявлення C.вotulinum типу Е в середовище перед посівом варто додавати трипсин до кінцевої концентрації 0 1%. Оскільки для таких досліджень потрібно трипсин у досить великих кількостях його можна замінити еквівалентною кількістю панкреатину. Крім того такі середовища можна брати в пробірках з об’ємом середовища 15 – 20 см3. Трипсин готують у вигляді 1% розчину стерилізують шляхом фільтрації через азбестові пластини фільтра Зейтца і додають з розрахунку 1 см3 1% розчину трипсину на 10 см3 середовища у флакони що будуть інкубуватися при 28±1 ?С. У флакони що попередньо прогрівалися трипсин додасться після прогрівання. Третій день Через 48 годин від початку росту з усіх флаконів з дотриманням стерильності беруть проби культуральної рідини по 10 – 15 см3 і піддають їх дослідженню. Попередньо готують мазки фарбують їх за Грамом і мікроскопують. З культуральною рідиною ставлять РН з сумішшю ботулінічних сироваток типів А В С Е F як це описано для визначення токсинів. При одержанні позитивних результатів РН ставлять з кожною сироваткою окремо. При виявленні в досліджуваному посіві паличок типових по морфології для C.вotulinum а також ботулінічного токсину дають висновок про зараженість досліджуваного матеріалу збудником ботулізму і наявності в ньому ботулотоксину. Виділення чистої культури в такому випадку не є обов'язковим. Якщо в посівах виявляють мікроби морфологічно подібні з C.вotulinum а токсин відсутній то слід перед постановкою РН провести активацію культуральної рідини панкреатином або трипсином для виявлення ботулінічних токсинів типу Е непротеолитичних штамів типу В і деяких штамів типу F а також провести виділення і вивчення чистих культур. Активацію культуральної рідини перед постановкою РН з протиботулінічними сироватками проводять тільки в тому випадку якщо в середовище перед посівом не був доданий трипсин або панкреатин як це рекомендовано вище. Якщо через 48 годин у флаконах не виявлено росту то необхідно продовжити інкубацію посівів у термостаті а дослідження провести знову на 4 – 6 – 10 добу. Якщо дослідження проведені на 10 добу не дали позитивних результатів по виявленню C.вotulinum і їх токсинів то видають відповідь про відсутність C.вotulinum і їх токсинів у досліджуваних матеріалах. Для виділення чистих культур C.вotulinum застосовують прозорий 1% або 1 5% агар із глюкозою приготовлений на мартенівському бульйоні або бульйоні Хоттингера розлитий у пробірки діаметром 0 8 см і довжиною 15-18 см. Перед посівом агар розплавляють і прохолоджують до 45 – 50 ?С. Посів на високий стовпчик роблять у такий спосіб: не відламуючи кінця пастеровської піпетки занурюють її в досліджуваний матеріал частіше це первинний посів досліджуваного матеріалу і переносять послідовно з пробірки в пробірку ретельно перемішуючи після чого агар перемішується ще раз шляхом перекочування пробірок між двома долонями. Охолоджені пробірки з посівом інкубують при температурі 35 – 37 ?С. На кожен посів варто брати 5 – 8 пробірок стовпчика агару. Якщо в первинній культурі ріст не дуже рясний при пересіванні на високий стовпчик пастерівську піпетку варто обламати і набрати небагато культури в капіляр а потім проводити посів як зазначено вище. Якщо в первинному посіві відмічено масивний ріст сторонньої мікрофлори і мало типових ботулінічних паличок із спорами необхідно взяти 5 – 10 см3 культури в пробірку і піддати її прогріванню на водяній бані при 80 ?С 20 хвилин. Після цього культуру треба знову посіяти на високий стовпчик агару. Через 1 – 2 доби в останніх пробірках з'являються окремі колонії у вигляді грудочок вати пушинок з ущільненим центром чи правильних дисків чечевичок. Підозрілі колонії перевивають на рідке або напіврідке поживне середовище у пробірках з 0 5% глюкози під шаром вазелінової олії. Одночасно частину колонії що залишилася мікроскопують. Пересів колоній з пробірок можна робити двома способами: 1. Стовпчик агару проколюють зверху відламаним капіляром пастерівської піпетки і витягають потрібну колонію. 2. Дно пробірки з високим стовпчиком агару злегка підігрівають на полум'ї пальника; під дією пару закипілої рідини агар виштовхується в стерильну чашку Петрі. Підозрілу колонію витягають відламаним капіляром пастерівської піпетки. Культуру що виросла з колонії в рідкому середовищі мікроскопують і перевіряють на наявність токсину за допомогою реакції нейтралізації на мишах. Посів на чашки. Краплю досліджуваної рідини наносять на поверхню цукрово-кров'яного або печінкового агару розлитого тонким шаром приблизно 3–5 мм у чашці Петрі. Потім краплю шпателем злегка втирають в агар і послідовно переносять шпатель ще на 2 – 3 чашки. Чашки поміщають у микроанаеростат або GENBOX кришкою зверху і вирощують при температурі 35 – 37 ?С. З метою підтримки достатнього вакууму на дно анаеростата ставиться відкрита чашка Петрі з лужним розчином пірогалолу. Через добу колонії C.вotulinum виглядають у виді прозорих росинок димчастого кольору діаметром 0 1 – 0 2 см оточені зоною гемолізу. Через те що при великому забрудненні досліджуваних проб сторонньою мікрофлорою виникають труднощі у виділенні C. вotulinum особливо типу Е через те що чутливість спор цього мікроба до нагрівання не відрізняється від чутливості вегетативних форм деяких мікробів рекомендується простий метод виділення чистої культури мікроба заснований на стійкості спор C.вotulinum до 50% спирту. До 2 см3 культуральної рідини 2 – 3-денні інкубації при 28 ?С що містить ботулінічний токсин типу Е додають рівний обсяг етилового спирту-ректифікату. Суміш витримують 1 годину при кімнатній температурі періодично перемішуючи а потім з неї роблять висів на 2 – 3 чашки з печінковим агаром що містить жовток курячого яйця жовток одного яйця додають у 500 см3 розплавленого й охолодженого до 45-50 ?С агару . Через 48 годин інкубації при 35 ?С в анаеростаті серед колоній сторонньої мікрофлори C.вotulinum дають невеликих розмірів колонії оточені “перловим поясом”. Слід зазначити що деякі спорогенні анаеробі C.sporogenes тощо також мають навколо колоній “перловий пояс”. Ці колонії висівають у пробірки із середовищем типу Тароцци досліджують після інкубації в термостаті в РН. Особливо цей метод рекомендується для виділення чистої культури C.вotulinum типу Е. При відсутності в лабораторії анаеростатів або GENBOX для вирощування анаеробів можна використовувати простий чашковий метод при якому повітря просто виключається з поживного агару. Метод полягає в наступному: засіяний і злегка охолоджений агар наливається в кришку стерильної чашки Петрі після чого на агар що майже застиг міститься друга половина чашки Петрі так щоб дно її щільне стикалося з поверхнею залитого агару. Краї чашки можна залити парафіном. При цьому методі поверхня скла щільно стикається з агаром по всій його площі і в шарі агару що знаходиться між пластинами скла створюються умови сприятливі для росту самих строгих анаеробів. Вирослі колонії розглядають за допомогою лупи або стереоскопічного мікроскопу. Частину колоній використовують для готування мазків для мікроскопії. З поверхні чашки колонії знімають петлею або пастерівською піпеткою і засівають на пробірки із середовищем типу Тароцци з 0 5% глюкози. Вирослі посіви перевіряють на частоту шляхом мікроскопії і на наявність токсину шляхом постановки РН на мишах. Метод активації протоксина C. вotulinum Активацію протоксинів роблять в екстрактах з харчових продуктів промивних вод шлунка і блювотних мас а також культуральної рідини посівів якщо досліджуваний матеріал був засіяний у середовище без трипсину або панкреатину. Чистий сухий трипсин розчиняють перед вживанням у фізіологічному розчині в концентрації 1:100 1%-й розчин ; цей розчин приймають за вихідний. Для активації беруть даний розчин з розрахунку щоб в активуємій культуральної рідини його концентрація дорівнювала 0 1%. Трипсин може бути замінений сухим медичним високоактивним активність не повинна бути менше 50 одиниць панкреатином розчин якого готують у такий спосіб: 4 см3 панкреатину розчиняють у 100 см3 фізіологічного розчину і залишають у холодильнику при 6±2 ?С протягом ночі. Перед вживанням отриману рідину фільтрують через щільний паперовий фільтр а потім через пластинку фільтра Зейтца що стерилізує до одержання прозорої опалесцентної рідини. Готовий розчин панкреатину може зберігатися при 6±2 ?С протягом двох тижнів. Досліджувану 4 – 5-добову культуру отриману на рідкому м'ясному або казеїновому середовищі піддають центрифугуванню або фільтруванню з метою відділення мікробних тіл від культуральної рідини. Готовий розчин трипсину додають з розрахунку одержання в культуральної рідини концентрації 0 1% для чого на 1 см3 культуральної рідини беруть 0 1 см3 вихідного 1% розчину трипсину. Якщо замість трипсину застосовують панкреатин то культуральну рідину змішують у рівних пропорціях з готовим розчином панкреатину. Отримані суміші поміщають у термостат при 37±1 ?С на 1 годину. Після закінчення зазначеного терміну в активованій рідині визначають наявність ботулотоксину на білих мишах шляхом постановки РН. 19. СПОРОНОСНІ АНАЕРОБИ – C. рerfringens 19.1. Загальні відомості В даний час відомо що C.рerfringens типів А В С D Е викликають ряд захворювань людини і тварин. Установлено що причиною харчових токсикоінфекцій у людей можуть бути C.рerfringens типів А і С з яких краще вивчені харчові отруєння обумовлені штамами типу А. Роль C.рerfringens типів В D Е в патології людей мало вивчена. Однак у зв'язку з тим що вони викликають важкі ентеротоксемії в дрібної і великої худоби а також у птахів можна припускати їх етіологічне значення при харчових отруєннях у людей у випадку вживання в їжу м'яса тварин контамінованих штамами типів В С D Е що продукують летальні некротичні і гемолітичні токсини ? r i . Встановлено що при харчових токсикоінфекціях викликуваних C. рerfringens типу А основну роль у патогенезі захворювання грає ентеротоксин що продукується in vivo спорулюючими клітками цих мікроорганізмів що попадають у шлунково-кишковий тракт при інтенсивній контамінації харчових продуктів 106 і більше у см3/г зазначеними бактеріями. C. рerfringens типів А В С D Е – факультативні анаеробі що ростуть в умовах повного або неповного вакууму не менш 0 4 атм. являють собою великі грампозитивні палички здатні до поліморфізму нерухомі. Утворюють центральні або субтерминальні спори які у деяких штамів типів А і С можуть витримувати кип'ятіння від 1 до 6 годин. Оптимальна температура для культивування C. рerfringens знаходиться в межах 37 – 45 ?С однак активний синтез токсинів ? ? ? і відбувається при температурі 37 ?С. Ріст культури на рідких поживних середовищах супроводжується сильним газоутворенням. На щільних поживних середовищах C.рerfringens утворює різні форми S M R безбарвних колоній що на агарі з кров'ю звичайно оточені зоною гемолізу на агарі з жовтком – зоною перламутрового преципітату різної інтенсивності. На середовищі Вильсона–Блер колонії що вирослі мають інтенсивний чорний колір. C.рerfringens викликає зброджування лакмусового молока що супроводжується просвітлінням сироватки й утворенням згустку цегляно-червоного кольору. Ферментують з утворенням кислоти і газу глюкозу мальтозу лактозу сахарозу галактозу. Не зброджують маніт і дульцит. У тканинах людини і тварин а також на штучних поживних середовищах C.рerfringens типів А В С D Е можуть продукувати летальні некротичні і гемолітичні токсини що нейтралізуються типовими специфічними антитоксичними сироватками. C.рerfringens типів D і Е виробляють протоксини подібно C.вotulinum типів С Е і F здатні переходити в активні токсини під впливом протеолітичних ферментів. Бактерії виду C.рerfringens особливо типу А широко поширені в довкіллі ґрунт вода харчові продукти і т.д. присутні у вмісті кишечнику людей і тварин. Харчові отруєння частіше мають місце після вживання готових м'ясних блюд а також продуктів рослинного походження що виявляються значно забрудненими клітками C.рerfringens типу А в результаті порушення правил готування і збереження їжі. 19.2. Бактеріологічні дослідження У харчових продуктах і матеріалі від хворого крім крові визначають: * наявність бактерій C.рerfringens і масивність контамінації цими мікроорганізмами; * наявність токсигенних штамів C.рerfringens типів А В С D Е. * У крові хворого з явищами анаеробного сепсису і секційних матеріалах визначають: * наявність C.рerfringens типів А В С D Е і їх специфічних токсинів. Перший день З підготовлених до дослідження матеріалів харчові продукти блювотні маси випорожнення й ін. готують розведення на 0 1% пептонній воді до 10-10. По 1 см3 матеріалу з відповідних розведень переносять у розплавлене й охолоджене до 45 ?С середовище Вильсона – Блер розлите по 8 – 9 см3 у пробірки. Можна також використовувати кров'яний або жовтковий агари в чашках. Для цього 1 см3 кожного розведення додають у 15 см3 охолодженого до 45 ?С агару ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі. Після застигання суміші заливають додатково стерильним охолодженим до 45 ?С 2% м’ясо-пептонним агаром шаром не менш 2 мм. Інкубують 6 – 8 годин у термостаті при 45 – 46 ?С або 20 годин при 37±1 ?С. Крім того гомогенати досліджуваних матеріалів засівають в об’ємі 10 – 15 см3 на кожне з рідких середовищ розлитих по 70 см3 у флакони?. Кожен зразок матеріалу крім крові вносять у 2 флакони однакового середовища один флакон з посівом прогрівають при 80 ?С 20 хвилин а інший – не прогрівають потім обидва флакони інкубують при 37±1 ?С. В умовах прогрівання звичайно гине стороння мікрофлора і частина анаеробів що знаходяться у вегетативній формі. Зберігаються спори C.рerfringens що у цих умовах активно проростають. У вирослих культурах із прогрітих посівів у ряді випадків може знаходитися тільки C.рerfringens тобто чиста культура цих бактерій. Кров у випадку бактеріємії узята стерильно буде містити тільки вегетативні клітки C.рerfringens. Тому посів крові проводиться без прогрівання. Інтенсивне газоутворення що свідчить про активний ріст культури може спостерігатися через 3 – 6 годин після посіву матеріалу доставленого не пізніше доби. У цьому випадку варто проводити бактеріологічні і токсикологічні аналізи в перший день дослідження. При відсутності активного росту через 6 – 8 годин посіви інкубують при 37±1 ?С протягом 18 – 20 годин. Другий день У посівах на середовищі Вильсона – Блер роблять підрахунок чорних колоній де мається від 10 до 30 колоній або на чашках де міститься від 20 до 100 колоній із зоною гемолізу або з зоною опалесценції. Множать кількість колоній на розведення матеріалу в цій пробірці або чашці Петрі. Так якщо в 6 пробірці або чашці міститься 30 характерних колоній контамінації одного грама або одного см3 вихідного матеріалу буде складати 30?106. Роблять мазки з 3 – 5 характерних колоній фарбують фарбою для анаеробів або за Грамом. Крім того 2 – 4 колонії пересівають на лакмусове молоко і 3 – 5 колоній – на будь-які з м'ясних середовищ у пробірках для одержання чистої культури. Визначення токсинів варто проводити через 3 – 6 годин після посіву матеріалу на рідкі середовища з появою ознак початку росту культури див. перший день дослідження або на другу добу якщо посівний матеріал виростає тільки через 18 – 20 годин інкубації. З культур на рідких середовищах де відзначений ріст із газоутворенням готують мазки фарбують їх за Грамом або фарбою для анаеробів. Ті посіви у яких виявляють грампозитивні палички схожі по морфології на C.рerfringens перевіряють на присутність специфічних токсинів C.рerfringens типу А В С D Е Методом реакції нейтралізації з діагностичними сироватками C.рerfringens типів А В D Е на білих мишах вагою 16 – 18 г?. Сухі протиперфрингенс сироватки перед уживанням розводять 1 см3 дистильованої води. При легкому струшуванні сироватка цілком розчиняється. Потім сироватки А В D Е розводять у 10 разів фізіологічним розчином і в розведеному виді застосовують для постановки РН. Постановка реакції нейтралізації З флаконів у стерильних умовах відбирають по 8 – 10 см3 культуральної рідини. Культуру що залишилася у флаконах зберігають при температурі 6±2 ?С до закінчення дослідження. Після центрифугування при 3000 – 5000 об/хв. протягом 30 хв. у надосадовій рідині повинні знаходитися токсини C.рerfringens. Спочатку ставлять РН токсину в досліджуваній рідині із сироваткою C.рerfringens типу А. Для цього в 2 пробірки вносять по 1 5 см3 надосадової рідини. Потім у 1 пробірку додають 0 75 см3 антитоксичної сироватки типу А у 2-у контрольну – 0 75 см3 фізіологічного розчину. Суміш витримують 30 хвилин при 37 ?С потім уводять по 0 75 см3 у хвостову вену 2-ом білим мишам вагою 16 – 18 г. Спочатку вводять суміш з контрольної пробірки потім тим же шприцом – суміш з досвідченої пробірки. Реакцію враховують через добу. Третій день 1. Переглядають пробірки з посівами на лакмусовому молоці. Поява характерного зброджування з просвітлінням сироватки й утворенням згустку цегельного кольору є додатковим підтвердженням того що колонії чорного кольору а також колонії з зонами гемолізу і преципітату на щільних середовищах що визначають контамінацію досліджуваного матеріалу відносяться до C.рerfringens. Враховують результати РН. Якщо контрольні миші упали а ті що отримали суміш токсину із сироваткою типу А – живі варто дати висновок що в досліджуваному матеріалі виявлений C.рerfringens типу А активністю не менш 3 Dlm/см3 для білої миші і закінчити дослідження. У тому випадку якщо контрольні миші і що отримали суміш токсину із сироваткою типу А упали варто ставити розгорнуту РН із сироватками C.рerfringens типів В D Е. Для виявлення штамів типів D і Е варто проводити активацію протеолітичними ферментами неактивних протоксинів що продукують штами типів D і Е. Спосіб готування робочих розчинів протеолітичних ферментів викладений у розділі “Лабораторна діагностика ботулізму”. Приготовлений 4% робочий розчин панкреатину додають до надосадової рідини в співвідношенні 1 см3 панкреатину до 3 см3 надосадовій рідині. Для активації також можна користатися трипсином; для цього 1% робочий розчин трипсину додають до надосадової рідини до концентрації 0 1% на 1 см3 надосадовій рідині беруть 0 1 см3 робочого розчину трипсину . Суміш токсину з ферментом поміщають у термостат при 37±1 ?С на 1 годину після чого розводять у 3 рази і ставлять розгорнуту РН з культуральною рідиною після активації ферментами для виявлення токсинів типу D і Е а також ставлять РН з неактивованою культуральною рідиною розведеною в 2 рази для виявлення токсинів типів В і С. Метод постановки розгорнутої реакції нейтралізації У п'ять пробірок розливають досліджувану надосадову рідину: у першу і другу пробірки – по 1 5 см3 без активації у третю четверту і п'яту – по 1 5 см3 рідини після активації. Додають по 0 75 см3 антитоксичні діагностичні сироватки: у першу пробірку – типу В у третю – типу D і четверту – типу Е усі сироватки розливають різними піпетками . Друга і п’ята пробірки є контрольними на присутність токсинів у них додають по 0 75 см3 фізіологічного розчину. Суміш витримують 30 хвилин при 37±1 ?С і уводять внутрівенно по 0 75 см3 двом білим мишам з кожної пробірки. Для кожної проби береться окремий шприц. Результати враховують через добу. При наявності токсинів C.рerfringens гинуть миші що одержали розчин з контрольної пробірки. Виживають миші що одержали суміш токсину з гомологічною сироваткою. Так якщо в досліджуваному матеріалі знаходиться токсин типу В або типу С виживуть миші що одержали суміш досліджуваної культури із сироваткою типу В контрольні миші упадуть. При виявленні токсину типу що нейтралізується сироваткою В варто вважати що в досліджуваному матеріалі міститься C.рerfringens типу В або типу С. Присутність одного з токсинів типів В С D Е в досліджуваному матеріалі в сполученні з характерною клінічною картиною дає підставу вважати що харчова токсикоінфекція викликана штамами одного з зазначених типів C.рerfringens. Схема розгорнутої реакції нейтралізації №№ пробірок Надосадова рідина Сироватки антиперфрингенс Фізіологічний розчин контроль 1. типа В типа D типа Е 1 пробірка 1 5 см3 без активації 0 75 2 пробірка 1 5 см3 без активації 0 75 3 пробірка 1 5 см3 після активації 0 75 4 пробірка 1 5 см3 після активації 0 75 5 пробірка 1 5 см3 посля активації 0 75 Виділення чистої культури Чисту культуру C.рerfringens виділяють і досліджують у випадку нечіткого результату РН при наявності в первинних посівах досліджуваного матеріалу тобто у флаконах змішаної культури де поряд з C.рerfringens присутня стороння мікрофлора. Чисту культуру C.рerfringens одержують шляхом пересіву на м'ясні середовища в пробірках окремих характерних колоній чорні на середовищі Вильсона–Блер а також оточені зоною гемолізу чи перламутрового преципітату – на кров'яному або жовтковому агарах . Колонії на щільних середовищах виростають на 2-й день дослідження при вивченні контамінації матеріалу. Колонії характерні для C.рerfringens висівають по 3–5 колоній з посіву кожного зразка досліджуваного матеріалу на м'ясні середовища в пробірках див. 2-й день досліджень . Через 18–20 годин у вирослих посівах визначають методом мікроскопії наявність однорідної культури з морфологією характерної для C.рerfringens. Пробірки з культурами зберігають при 6±2 ?С і використовують надалі для вивчення чистої культури. Для виділення чистої культури з секційного матеріалу що не вивчається на обсеменінність C.рerfringens варто використовувати культури первинних посівів у флаконах див. 2-й день дослідження визначення токсинів . Для виділення окремих колоній використовують середовище Вильсона–Блер а також кров'яний або жовтковий агари в чашках Петрі куди стерильно вносять 1 – 2 краплі культури потім роблять розсів на 2 – 3 чашки шпателем. Посіви в чашках Петрі вирощують в анаеростатах протягом однієї доби при 37±1 ?С. Окремі колонії що вирослі пересівають на м'ясне середовище в пробірках. Для визначення типової приналежності виділених штамів C.рerfringens посівний матеріал із пробірок з м'ясним середовищем пересівають в об’ємі 2 – 3 см3 на одну з рідких поживних в середовищ флаконах. У вирослій культурі встановлюють присутність специфічних токсинів C.рerfringens методом реакції нейтралізації з типовими антитоксичними діагностичними антиперфрингенс сироватками типів А В D Е див. 2-й день досліджень . Критерії діагностики При наявності клінічних симптомів захворювання результати бактеріологічного дослідження підтверджують діагноз харчовий токсикоінфекції викликаної C.рerfringens якщо отримані наступні дані досліджень: 1. Висока контамінація C.рerfringens більш 106 у 1 г харчових продуктів що викликали отруєння. 2. Наявність C.рerfringens типів А або С в посівах досліджених матеріалів що підтверджується РН токсинів цих типів на тваринах. Ці показники дають підставу вважати що причиною харчового отруєння є C.рerfringens типів А або С. 3. Не виключена етіологічна роль C.рerfringens типів В D Е в харчових токсикоінфекціях людини тому виявлення в посівах досліджуваного матеріалу токсинів C.рerfringens кожного з типів В D Е свідчить про захворювання відповідної етіології. 4. Виділення з крові хворого штамів C.рerfringens кожного з типів А В С D або Е. 20. МЕТОДИ ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ РОТАВІРУСНОЇ ІНФЕКЦІЇ Гострий початок та короткий перебіг ротавірусного гастроентериту потребує застосування експрес-методів діагностики. Вибір методу в кожному випадку визначається технічним забезпеченням лабораторії та наявністю діагностичних препаратів. Клінічним матеріалом є фекалії або сироватка крові. Наявність і розповсюдження ротавірусів в довкіллі виявляється шляхом дослідження зразків харчових продуктів та води питна вода стічна та вода природних та штучних водоймищ зразків грунту та змивів. Для дослідження зразків фекалій готують 10% суспензію. При дослідженні зразків об`єктів довкілля і харчових продуктів проводять попередню концентрацію досліджуваного матеріалу. Виявлення вірусних частин за допомогою електронної і імунноелектронної мікроскопії. Так як в перші 2-3 дні хвороби вміст ротавірусів достатній для виявлення цими методами за характерними морфологічними ознаками та розмірами. Реакція непрямої гемаглютинації з еритроцитарними діагностикумами яка може застосовуватись як для виявлення антигенів так і специфічних антитіл у досліджуваних матеріалах. Реакція латекс- аглютинації – чутливий високоспецифічний метод виявлення антигенів ротавірусів. Чутливість реакції знижується при дослідженні з діагностичною метою матеріалів отриманих після 5-7 дня хвороби. Імуноферментний аналіз використовують для виявлення та кількісного визначення вірусних антигенів або специфічних антитіл. Використовується для ранньої серологічної діагностики ротавірусної інфекції шляхом визначення антитіл класу Ig M в сироватках крові хворих. Полімеразна ланцюгова реакція призначена для виявлення в матеріалі фрагментів послідовностей геному збудника. Реакція гальмування непрямої гемаглютинації використовується для встановлення сероконвірсії або підвищення титру антиротавірусних антитіл у 4 рази в другій сироватці крові хворого порівняно з першою. Першу сироватку крові одержують на початку захворювання другу – через 2-4 тижні після першої. Метод непрямої імунофлюоресценції який виявляє при позитивному результаті в цитоплазмі клітин чітку яскраво-зелену флюоресценцію антигенів ротавірусів. Виділення вірусів на культурі клітин. Імунохроматографічний метод. Експрес-метод для виявлення наявності антигену ротавірусу у випорожненнях. Застосовують згідно інструкції до препарату. У вірусологічних лабораторіях дослідження зразків клінічного матеріалу та проб з об`єктів довкілля в тому числі і харчових продуктів проводять відповідно затвердженим Настановам щодо проведення досліджень вищевикладеними методами. 21. ВИМОГИ БЕЗПЕКИ Дослідження проводять відповідно до вимог ДСП 9.9.5.-080-2002 “Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях відділах відділеннях мікробіологічного профілю”. Додаток 1 СХЕМА опитування потерпілого при харчовому отруєнні 1. Прізвище ім’я по батькові. 2. Вік. 3. Місце роботи навчання вказати адресу . 4. Де і чим харчувався на протязі останніх двох-трьох діб. 5. Чи мають місце подібні захворювання серед членів сім’ї і де вони харчувались вказати адресу 6. Дата і час початку захворювання. 7. Який продукт чи страва підозрюються? ?? 8. Клінічні симптоми. 9. Місце вказати адресу і час вживання у їжу підозрюваного продукту 10. Тривалість періоду від вживання підозрюваного продукту до початку захворювання Додаток 2 Схема аналізу симптомів захворювання № з/п Прізвище ім’я по батькові Дата і час вживання їжі Дата і час захворю-вання Основні симптоми сухість у роті нудота блювання пронос запор болі в животі болі у шлунку температура тіла озноб головний біль запаморочення розлади зору опущення повік розширення зіниць затруднення ковтання 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 14.07 9.00 14.07 11.00 + + + + 36 6 + 2 -“- 11.30 + + + + 36 4 3 -“- 14.00 + + + + + + 37 5 4 -“- 12.00 + + + + 36 5 + 5 -“- 12.00 + + + + 36 8 + 6 -“- 11.30 + + + + 36 7 + 7 -“- 13.30 + + + + + 37 2 + + 8 -“- 11.00 + + + + 36 6 + 9 -“- 10.30 + + + + 36 5 + 10 -“- 11.30 + + + + 36 7 + і далі -“- 12.00 + + + + 36 5 + -“- 11.30 + + + + 37 0 + Примітка: Виявлені симптоми позначають знаками плюс + температуру тіла відмічають у градусах С. Коментар. Коротка інкубація клініка гострого гастриту субфібрилітет дають підставу у першу чергу запідозрити отруєння стафілококовим токсином. Додаток 3 Найбільш характерні клінічні симптоми при деяких гострих захворюваннях Клінічні симптоми та симптомокомплекси Захворювання харчові токсикоінфекції Харчові токсикози Гострі кишкові інфекції Отруєння блідою поганкою Отруєння миш’яком Отруєння нітритами та нітратами Отруєння цинком стафіло-коковий ботулізм афлатоксикоз дизентерія Зонне сальмонельоз ешеріхіоз холера Ельтор 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Інкубаційний період 4-10 год. до 24 год. від З0 хв. до 4 год. 2-24 год. до 10 діб 1-6 год. 1-3 доби до 7 діб 1-3 доби до 7 діб 1-5 діб 6-12 год. до 25 год 1-3 год. 1-6 год. 3-10 год Температура підвищена норма норма норма висока підвищена висока підвищена нижче норми норма норма норма норма Нудота +++ +++ ± ++ + + - + + + ++ Блювання +++ +++ ± ++ ± ++ +++ +++ +++ +++ ++ Пронос без крові ++ ± ± ± ++ +++ +++ ++ +++ ++ ++ Біль в області живота +++ ± ± ± ± + ± ++ + ± ++ Біль в епігастрії ++ +++ ± ++ ± + - ++ +++ +++ + Біль внизу живота - - - - +++ + - - - - - Пронос з кров'ю - - - - ++ ± - + - ± - Продовження додатку 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Тенезми - - - - +++ - - - - - - Запор - - ++ - - - - - - - - Метеоризм ++ - ++- - - ± - - - - - Гострий гастрит ++ +++ ± ++ ± ± + ++ ++ + ++ Гострий ентерит ++ ± - ± + + +++ ++ ++ - - Гострий гастроентерит +++ ± ± + + ++ + +++ +++ + ± Гострий ентероколіт - - - - +++ +++ - - - - - Коліт - - - - +++ + - - - - - Головний біль + + - + ++ ++ + + + ++ + Розлади зору - - +++ - - - - + - ± - Розлади дихання - * +++ - - - - ± + ++ - Неврологічні розлади - ± +++ ++ + ± + + ++ ++ - Судома ± + - ++ ± ++ + ± + + - Ураження печінки ± + - ++ + + - +++ ++ ++ - Ураження крові - - + - - - - + + +++ - Умовні знаки: +++ – симптоми виражені різко; ++ – симптоми виражені сильно; + – симптоми виражені помірно; ± –симптоми спостерігаються не часто - – симптоми не спостерігаються Додаток 4 Деякі клінічні симптоми захворювань що мають перебіг подібний до харчових отруєнь № з/п Клінічні симптоми Варіант захворювання викликаний: сальмонелами шигелами переважно Зонне ентеротоксигенними ешеріхіями 1. Інкубаційний період години 6-24 6-24 6-24 2. Температура нормальна/підвищ. нормальна/підвищ. нормальна/підвищ. 3. Озноб ++ + + 4. Нудота ++ + + 5. Блювання ++ ++ + 6. Біль в епігастральній області + + + 7. Біль в епі- і мезогастральній області +++ +++ ++ 8. Рідкі випорожнення +++ +++ +++ 9. Випорожнення з кров‘ю + + + 10. Випорожнення із слизом + + + 11. Запор - - - 12. Метеоризм + - - 13. Загальна кволість запаморочення +++ +++ + 14. Головний біль +++ +++ +++ 15. Розлад зору диплопія птоз медріаз тощо - - - 16. Розлад мовлення ковтання - - - 17. Сухість в роті + + + 18. Втрата свідомості + + + 19. Судоми + + + 20. Пригнічення серцевої діяльності + + + 21. Розлад дихання - - - Додаток 5 Схема опитування захворілих з метою з‘ясування інкримінованого продукту при груповому харчовому отруєнні. № з/п Прізвище ім'я по батькові Група зміна цех група тощо Найменування продукту і дата його вживання Млинці з м‘ясом Овочеве рагу Риба заливна Сир із сметаною Компот Інші продукти дата дата дата дата дата дата 1. + + - - + - 2. - + - - - - 3. - + + - + + 4. - + - + - - 5. + + - + - - 6. + + - - + - 7. - + - - - - 8. - + - - + - 9. - + + - - + Примітка. Результати опитування позначають знаком “+” або “-“ Додаток 6 Схема опитування захворілих і не захворілих з метою з‘ясування інкримінованого продукту при груповому харчовому отруєнні № з/п Прізвище ім'я по батькові Загін зміна цех підрозділ тощо Найменування страв та дата вживання Відмітка про захворю-вання Дата день напередодні спалаху Дата день виникнення спалаху сніданок обід вечеря сніданок обід вечеря 1 2 1 2 3 1 2 1 2 1 2 3 1 2 1. + + + + + - - - - + + + + + - 2. + - + + + + + + + + + - - - + 3. - - + + + - - + + + - - - - + 4. + + + + + - - + + - - - - - + 5. + + - - + + + - + + + + + + - 6. - - + + + + + - + + + + + + - 7. + + + + + - - + + - - - - - + 8. - - - + + + + + + - - - - - + 9. - + + + + + + - + + + + + + - 10. + + - - + - - + + - - - - - + Коментар. З приведеної схеми видно що не захворіли тільки ті особи які не вживали страву № 1 на сніданок у день захворювання. По відношенню до інших продуктів такої закономірності не спостерігається. Ця обставина дає право вважати що загальним продуктом для потерпілих який спричинив захворювання є страва № 1 видана на сніданок у день розслідування спалаху отруєння за принципом: "не їв – не захворів" . Додаток 7 Загальна схема розслідування спалаху харчового отруєння мікробного походження № з\п Етапи розслідування Заходи які проводяться 1 2 3 1. Отримання екстреного повідомлення 1. Негайне інформування вищих інстанцій. 2. Оперативне складання плану розслідування і негайний початок його реалізації. 2. Виявлення загальних клінічних симптомів 1. Встановлення зв'язку з медичними працівниками і установою які надали першу допомогу потерпілим. 2. Ознайомлення з медичною документацією заведеною на потерпілих. 3. Опитування безпосередньо потерпілих і складання схеми за клінічними симптомами додаток 3 . 3. Виявлення підозрюваного продукту 1. Опитування безпосередньо захворілих і не захворілих та складання схеми вживання продуктів за додатками 5 і 6. 2. Перевірка документації що супроводжує просування продуктів. 3. Опитування персоналу харчового об’єкту який брав участь у виготовленні зберіганні і реалізації їжі. 4. Співставлення отриманих даних і виявлення продукту загального для усіх потерпілих з урахуванням клінічних проявів захворювання і характерних особливостей продукту. 4. Забір проб і відправлення їх в лабораторію 1. Оцінка правильності забору матеріалу працівниками установ які надали першу допомогу потерпілим. 2. Забір необхідного матеріалу і направлення його в лабораторію додаток 11 5. Обстеження харчового об’єкту з яким пов'язане харчове отруєння 1. Виявлення умов які сприяли розмноженню збудників у підозрюваному харчовому продукті: а встановлення терміну зберігання і реалізації продукту; б визначення температурних режимів зберігання і реалізації їжі; в перевірка виконання встановлених технологічних рецептур під час виготовлення їжі 2. Визначення ступеню ефективності теплової обробки страв і харчових продуктів. Продовження додатку 7 1 2 3 5. Обстеження харчового об’єкту з яким пов'язане харчове отруєння 3. З’ясування факторів які сприяли обсіменінню мікробами їжі з оцінкою: а санітарно-технічного стану харчового об'єкту; б виконання технологічного режиму; в виконання санітарного режиму. 4. Опитування та взяття пояснювальних записок у працівників харчових об`єктів 5. Виявлення джерела і умов обсіменіння інкримінованого продукту. 6. Застосування необхідних оперативних заходів. 7. Складання акту санітарного обстеження харчового об'єкту. 6. Оформлення матеріалів розслідування харчового отруєння. 1. Аналіз усіх отриманих даних і формування відповідного висновку. 2. Складання акту розслідування у відповідності з існуючими вказівками додаток 9 . 3. Оповіщення і представлення матеріалів розслідування у вищі інстанції. 4. Реєстрація та облік. Додаток 8 Усереднені дані про фоновий природний вміст деяких токсичних елементів у харчових продуктах Елемент Вміст токсичних елементів в продуктах мкг/100 г Риба М'ясо Молоко Хлібні вироби Картопля Овочі фрукти і ягоди Добовий раціон мкг/добу Ртуть 15 0.7 0.3 0.5 0.3 0.3 0.2 15 Кадмій 10 2 1 1 2 2 0.5 34 Свинець 45 15 5 20 20 20 15 310 Миш’як 100 10 4 20 10 10 5 240 Сурма 4 1 0.1 0.6 0.6 0.6 0.3 11 Мідь 150 150 2 300 140 110 100 2400 Цинк 1000 2500 400 1500 360 400 150 16700 Олово 200 150 15 20 15 10 5 640 Залізо 1000 3000 70 4000 900 700 600 27800 Нікель 20 10 2 10 10 10 5 150 Селен 60 50 4 20 10 10 5 290 Хром 15 9 2 5 5 4 3 90 Алюміній 250 100 300 1200 1860 500 400 13500 Фтор 700 40 18 40 17 20 10 910 Йод 70 10 5 15 10 10 5 220 Додаток 9 Примірний акт розслідування харчового отруєння 1. Вказати прізвище посаду і місце роботи санітарного лікаря який склав акт дату складання і хто ще приймав участь у розслідуванні отруєння. 2. Детально описати початок захворювання: його дату кількість захворілих протягом перших 3-4 годин і потім у наступні години і дні клінічну картину за схемою опитування додаток 2 тяжкість захворювання попередній діагноз а також загальну кількість людей які вживали у їжу підозрюваний продукт і кількість потерпілих з додаванням поіменного списку захворілих госпіталізованих померлих із зазначенням віку а також обставин пов'язаних з виникненням харчового отруєння; зазначити чи не було аналогічних захворювань у попередні дні. 3. Конкретизувати які матеріали отримані від захворілих промивні води блювотні калові маси кров сеча тощо від кого коли і куди направлені для лабораторного дослідження При наявності випадків захворювання з летальним кінцем вказати який матеріал відібраний при розтині трупів внутрішні органи вміст шлунку кишечника тощо і куди направлений для дослідження. 4. Вказати місце вживання їжі або придбання харчового продукту; описати детально розкладки до меню і блюд потерпілих за останні 48 годин до отруєння. В акті слід навести також меню не тільки потерпілих але й тих хто харчувався у тому ж місці що і потерпілі з додатку 6 . Примітка. При виникненні спалаху в організованому колективі чи в сім'ї вказати якщо це мало місце який продукт чи страва спричинили захворювання у людей які випадково харчувались тут у цей час наприклад сантехніки електрики слюсаря тощо або у членів персоналу даного закладу персоналу кухні та їх родичів які могли вживати той же продукт. Визначити скільки часу минуло після вживання підозрюваної їжі до появи перших симптомів захворювання. По результатам опитування додатки 5 6 свідчень персоналу перевірки меню та інших документів визначити який продукт підозрюється як причина отруєння. Відобразити оцінку захворілим якості органолептичних властивостей харчового продукту що спричинив отруєння зовнішній вигляд запах колір смак консистенція температура страви тощо а також кількість приблизну вагу споживаного продукту чи страви півпорції повну або подвійну порцію чи тільки покуштував її частину і зіставити кількісні дані з інтенсивністю симптомів захворювання. 5. Вказати коли і звідки був отриманий підозрюваний продукт або напівфабрикати чи сировина для виготовлення цього продукту страви наявність сертифікатів ветеринарних та інших свідоцтв що характеризують їх безпеку дати санітарну характеристику залишків продукту виявлених під час розслідування. 6. Представити короткий опис санітарного стану харчового підприємства де був виготовлений продукт що підозрюється як такий що спричинив отруєння. Детально описати технологічний процес і санітарні умови виготовлення підозрюваного продукту а також умови його зберігання реалізації. Описати умови транспортування зберігання сировини видачі і приймання продовольчих товарів. Примітка. Детальний акт санітарного обстеження харчового об’єкту де виникло отруєння або на якому виготовили підозрюваний харчовий продукт необхідно додати до акту розслідування харчового отруєння. 7. Вказати які продукти були затримані вилучені або знищені; коли куди і які продукти та інші матеріали були направлені для лабораторних досліджень. 8. Викласти результати хімічних бактеріологічних вірусологічних патолого-анатомічних та інших лабораторних досліджень усіх матеріалів. 9. Дати обґрунтовані висновки які підтверджують що в даному випадку дійсно мало місце харчове отруєння. У висновках вказати з яким харчовим продуктом пов’язано виникнення харчового отруєння і який мікробний фактор або яка шкідлива хімічна речовина знайдена у цьому продукті спричинила дане захворювання. Конкретно назвати які порушення технології зберігання або реалізації продукту обумовили виникнення харчового отруєння. Якщо причина харчового отруєння не встановлена зазначити який продукт що виявився загальним для усіх потерпілих підозрюється 1. Описати заходи прийняті органами санітарно-епідеміологічного нагляду щодо ліквідації та профілактики подібних захворювань а також вказати санкції застосовані у даному випадку. Примітка. До акту можуть бути внесені ще будь-які дані або інформація що стосується розслідування випадку харчового отруєння а також при необхідності подані відповідні пропозиції. Підписи осіб що приймали участь у розслідуванні. Додаток 10 Заклади охорони здоров’я в яких має надаватись допомога хворим з харчовими отруєннями та вимоги до них. Заклад охорони здоров'я Вид харчового отруєння 1 2 Інфекційні лікарні інфекційні відділення або інші відділення багатопрофільної лікарні неконтагіозність захворювань Харчові токсикоінфекції. Міксти мікробного походження Стафілококова інтоксикація. Мікотоксикози. Інфекційні лікарні інфекційні відділення або інші відділення багатопрофільної лікарні неконтагіозність захворювань з обов’язковою наявністю реанімаційного відділення. * Ботулізм * Скомбротоксикози. Токсикологічне відділення або спеціалізовані лікувально-профілактичні заклади * Отруєння токсичними речовинами хімічного рослинного і тваринного походження * Міксти немікробного походження * Міксти мікробного та немікробного походження. * Мікотоксикози * Отруєння невідомої природи АПТМ * * Аліментарна пароксизмально-токсична міоглобінурія гафська юксовська сартландська хвороба – доцільна госпіталізація в нефрологічні відділення. Під час госпіталізації та лікування хворих слід враховувати важкість захворювання і необхідність надання специфічного лікування. Заклад охорони здоров’я де надається перша допомога хворому з харчовим отруєнням обов’язково має бути забезпеченим спеціальним посудом для відбору матеріалу від хворого та залишків підозрюваного продукту з метою направлення в клініко-діагностичну лабораторію та лабораторії СЕС. Відібрані матеріали мають бути терміново направлені до лабораторії територіальної СЕС а при неможливості негайного відправлення належним чином збережені на термін не більше доби в умовах охолодження виключаючи заморожування. Додаток 11 Відбір направлення і підготовка проб для лабораторних досліджень 1. Відбір зразків для лабораторних досліджень проводить як правило санітарний лікар при його відсутності – помічник санітарного лікаря. За розпорядженням головного лікаря для надання допомоги при відборі проб можуть залучатись працівники лабораторії. 2. Для лабораторного дослідження направляють ті матеріали які за попередніми даними санітарно-епідеміологічного розслідування пов’язані з передбачуваною етіологією харчового отруєння. 3. Об’єктами дослідження мають бути: проби з об’єктів довкілля: * залишки їжі що підозрюється і яку вживали потерпілі а також початкові продукти і напівфабрикати що використовувались для її приготування; * добові проби готової їжі якщо встановлений порядок їх обов'язкового зберігання в дитячих закладах та інших колективах при умові їх зберігання на холоді; * змиви і зшкрібки з інвентарю обладнання тари рук персоналу; * питна вода з кранів резервуарів питних бачків графинів тощо; біологічний матеріал: * блювотні маси промивні води на чистій воді без домішок бактерицидних лужних препаратів сорбентів випорожнення і сеча потерпілих; * кров для отримання гемокультур і для постановки серологічних реакцій або для токсикологічних досліджень; * слиз із носа та ротоглотки виділення гнійних уражень шкіри персоналу зайнятого приготуванням готової їжі; * вміст шлунку відрізок тонкого кишечнику шматочки паренхіматозних органів печінки селезінки кров із серця кістковий мозок мезентеріальні лімфатичні вузли жовч - при летальному кінці захворювання. 4. Відбір проб для бактеріологічного дослідження проводять у стерильні широкогорлі банки ємністю 200 – 300см3 або у стерильні пакети. При відсутності стерильного посуду відбір проб допускається здійснити у скляні банки які попередньо кип’ятять протягом 15 хвилин. Обробка посуду дезінфікуючими засобами не допускається. 5. Харчові продукти для лабораторних досліджень відбирають дотримуючись чинних норм і правил виїмки проб харчових продуктів для дослідження. У випадках коли це здійснити неможливо проби відбирають у менших кількостях або задовольняються залишками їжі якщо їх ще знаходять . М'ясо для аналізу відбирають у кількості 500 г з різних частин туші з обов'язковим взяттям мезентеріальних лімфатичних вузлів а також ділянок трубчастої кістки. Якщо є можливість слід відбирати від тварин кров із серця вміст кишечнику жовч. Для досліджень можуть бути використані також змиви з поверхні туші. Птицю беруть цілою тушкою або її залишки включаючи анальний отвір. Рибу дрібну відбирають у кількості 2-3 штуки а від великої риби відрізають 2 – 3 шматка із спинки ближче до голови і з ділянок поблизу анального отвору. Солонину і засолені продукти у бочці беруть зверху із середини та на дні бочки. При цьому в окремий посуд відбирають 100 – 200 см3 розсолу. Проби рідких та напіврідких продуктів супи соуси креми молочні продукти компоти коктейлі тощо відбирають після ретельного перемішування у кількості біля 200 г. Молочні продукти промислового виготовлення відбирають в оригінальній упаковці. Норма виїмки для інших страв складає 1 – 2 порції. Гриби що споживались людиною і підозрюються як чинник що викликав отруєння відбираються всі що залишились від споживання включаючи страви що містять підозрілі гриби. Добові проби направляють в лабораторію безпосередньо у тому посуді в якому вони зберігались на холоді. Залишки їжі яку вживали потерпілі відправляють в лабораторію у тому посуді в якому вона була виявлена. Допускається їх доставка також у стерильних банках куди залишки їжі поміщають дотримуючись правил асептики. Залишки консервів направляють в лабораторію безпосередньо у тому посуді з якого їх споживали. При відсутності залишків консервів дослідженню підлягає вміст декількох нерозкритих банок з маркуванням повністю ідентичним маркуванню розкритої банки. Якщо в партії консервів однойменного маркування є бомбажні банки їх відбирають і досліджують у першу чергу. Маркувальні знаки поставлені на банці та кришці банок реєструють у лабораторному журналі. 6. Під час контролю поверхні інвентарю обладнання тари рук їх ретельно протирають ватним тампоном на скляній або дерев'яній паличці. З метою зволожування тампона застосовують стерильний фізіологічний розчин або водопровідну воду у кількості 2 см3 безпосередньо перед взяттям змивів. У разі обробки жирної поверхні використовують сухі тампони. Примітка: 3 метою оцінки санітарного стану харчового об'єкту або якості санітарної обробки інвентарю тари обладнання змиви відбирають з площі що приблизно дорівнює 100 см2 а з метою виявлення збудника захворювання – з якомога більшої поверхні і з додатковим використанням зшкрібок. 7. Зшкрібки роблять стерильним або прожареним на полум'ї пальника ножем чи скальпелем і поміщають у стерильну банку або чашку Петрі з невеликою кількістю 3-4 см3 фізіологічного розчину. 8. Відбір проб води проводять у кількості не менше ніж 1 – 2 дм3 окремо для проведення фізико-хімічних і мікробіологічних досліджень. Для мікробіологічних досліджень проби води відбирають у стерильний посуд. При необхідності дослідження води із графинів воду можна доставляти в лабораторію безпосередньо у графинах. Лікувально-профілактичні заклади ЛПЗ де надається перша допомога хворому з харчовим отруєнням обов’язково повинний мати запас стерильного посуду та засобів для відбору матеріалу від постраждалих для мікробіологічних досліджень що постійно поновлюється та посудом для відбору матеріалу для інших досліджень з метою направлення в профільні лабораторії ЛПЗ та СЕС. Проби біологічного матеріалу від постраждалих відбирають працівники лікувально-профілактичного закладу. 9. Проби випорожнень беруть з останньої більш рідкої порції що надходить з верхніх відділів кишечнику безпосередньо після дефекації у кількості 5 – 10 г. При наявності у випорожненнях слизу гною або крові їх необхідно включати до відібраного матеріалу. Відбирають проби стерильним інструментом із судна горшка спеціального лотка або пелюшки. За відсутністю можливості негайного посіву забрані порції випорожнень розміщують у пробірках з консервантом. В якості консерванту використовують гліцеринову суміш рН 7 2 – 7 4 або інші. Співвідношення випорожнень і консерванту має бути 1 : 5. 10. Блювотні маси відбирають у кількості 50 – 100 см3 але можна і у меншій кількості промивні води у кількості 100 – 200 см3 окремо від кожного потерпілого до початку застосування будь-яких лікарських засобів. При цьому консерванти добавляти не можна. 11. Кров у потерпілих забирають у кількості не менше 8 – 10 см3 при підозрі на ботулізм – 20 см3 із ліктьової вени у стерильну суху пробірку. Примітка: Допускається кров змішувати з 4% розчином лимоннокислого натрію у співвідношенні 1 : 3 але цитратну кров під час постановки біологічної проби можна вводити мишам тільки внутрішньочеревно. Матеріал від хворих на ботулізм: кров блювотні маси промивні води випорожнення відбираються до введення хворому протиботулінічної сироватки. 12. Проби сечі беруть у кількості 20 – 30 см3 у стерильний посуд з дотриманням правил асептики. 13. Жовч і вміст 12-палої кишки беруть для дослідження за допомогою дуоденального зонду у лікувальному закладі. Можливість проведення цього дослідження у кожному конкретному випадку вирішується клініцистом індивідуально. 14. Пунктат запальних осередків гній ексудат збирають у стерильні пробірки. 15. Спинномозкову рідину відбирають у стерильну пробірку в кількості 5 – 10 см3. 16. Забір матеріалу із ротоглотки і носа проводять стерильними ватними тампонами закріпленими на металевих дротиках. 17. Проби із секційного матеріалу забирають у кількості 50 – 60 г кожного органу або тканини дотримуючись стерильних умов. 18. При необхідності обстеження тварин необхідний матеріал кров сечу випорожнення секційний матеріал тощо забирають так само як і у людей. 19. Проби етикетують нумерують опечатують або пломбують і упаковують так щоб гарантувати цілість матеріалу і виключити можливість його контамінації або розповсюдження інфекції. На кожній банці повинна бути зроблена наклейка з чітким позначенням назви матеріалу прізвища ім'я та по батькові хворого дати та часу години хвилини відбору проби. 20. Пересилку проб в лабораторію проводять у найкоротший строк так як термін від забору до початку дослідження проб може відобразитись на достовірності результатів аналізу. Якщо відібрані проби не можна зразу ж доставити в лабораторію як виключення їх дозволяється зберігати у холодильнику при температурі 6?2 °С не більше однієї доби. Такої ж температури слід дотримуватись і під час транспортування проб запобігаючи їх перегрів або заморожування. 21. У супроводжувальному документі до матеріалів від захворілих померлих вказують: прізвище ім'я по батькові вік адресу і місце роботи посаду для дитини – дитячий заклад дату захворювання діагноз або показання до обстеження дату і час відбору матеріалу прізвище і посаду особи що направила матеріал. 22. При направленні в лабораторію харчових продуктів у супроводжувальному документі вказують: а найменування підприємства або закладу де проведено відбір проб його адреса перелік проб із зазначенням їх ваги характеристики тари і упаковки стерильність посуду охолодження проб наявність печатки тощо дату і час години хвилини відбору і відправлення проб в лабораторію; б основні дані санітарно-епідеміологічного розслідування: дата харчового отруєння строк появи симптомів захворювання після вживання підозрюваної їжі описання клінічних проявів у захворілих число захворілих і госпіталізованих наявність випадків з летальним кінцем захворювання попередній діагноз; в продукт що підозрюється як фактор харчового отруєння; г мету дослідження; д посаду і підпис особи яка зробила відбір і направила проби в лабораторію. 23. Якщо в лабораторію направляється матеріал взятий від тварин необхідно вказати: найменування дату забору вид тварини і його вік молодняк дорослі назву і адресу господарства або підприємства із яких направляється матеріал і привід до його обстеження. 24. В лабораторії матеріал реєструють обов’язково вказуючи дату час година хвилини отримання проби. 25. Дослідження матеріалів що надійшли до лабораторії в процесі розслідування харчового отруєння починаються негайно після їх отримання та реєстрації. 26. Безпосередньо перед посівом оглядають стан упаковки всього матеріалу і кожної окремої проби звертаючи увагу на цілісність упаковки наявність пломб і печаток. При виявленні порушень роблять про це відмітку у реєстраційному журналі та на направленні. 27.Якщо зразки що надійшли для хіміко-токсикологічного і мікробіологічного дослідження упаковані чи затарені в загальну тару наприклад банкові консерви молочні продукти чи напої в пляшках і т.п. то спочатку зразки направляються в бактеріологічну вірусологічну лабораторію а потім після проведення посіву у санітарно-гігієнічну лабораторію для органолептичного і хімічного дослідження. 28. Продукти підлягають лабораторному дослідженню незалежно від ознак псування. 29. Напрямок лабораторних досліджень обумовлюється клінічною картиною захворювання даними епідеміологічного розслідування і характерними властивостями підозрюваного продукту. Бактеріологічне дослідження проб на перших етапах розслідування повинно бути комплексним з використанням максимального набору поживних середовищ для первинного посіву. Коли етіологічний фактор встановлений дослідження проводять цілеспрямовано. 30. Лабораторні дослідження отриманого матеріалу проводять у відповідності з вимогами нормативної та методичної документації затвердженої МОЗ України а також цієї інструкції. При відсутності затверджених Міністерством охорони здоров'я України методів у результаті протоколі дослідження обов'язково указується використаний метод. Якщо проводилося визначення якої-небудь речовини маловідомим методом необхідно привести в тексті протоколу принцип методу схему дослідження і вказати джерело літератури . 31. Бактеріологічні дослідження проби харчового продукту починають з підготовки наважки що характеризує всю доставлену пробу. Матеріал для наважки продуктів щільної консистенції м'ясо ковбаса й ін. беруть з різних місць доставленої проби з поверхні і з глибини. Якщо це тушка птиці – з місць що прилягають до кишечнику; якщо риба – поблизу зяберних дужок і анального отвору. Можливе використання для готування наважки всієї доставленої проби якщо навіть її вага досягає 500 – 800 г. Має визначене значення дослідження наважки що складається зі шматочків відібраних тільки з глибини доставленої проби. У цьому випадку при відборі матеріалу для наважки роблять стерилізацію поверхні металевим шпателем або ножем. Можливе дослідження наважки продукту зі шматочків відібраних тільки з поверхневих шарів проби тому що це дозволяє установити вторинне забруднення продукту. У цьому випадку невеликі шматочки харчових продуктів засівають безпосередньо при цьому поверхню проби не обпалюють розпеченим шпателем або ножем тому що це може привести до знищення патогенної флори. Наважка продукту повинне бути не менш 25 – 30 г. 32. Стерильно узяту наважку продукту щільної консистенції перед посівом гомогенізують з невеликою кількістю 0 1% пептонно-сольового розчину або поживного середовища в співвідношенні від 1:2 до 1:5 у залежності від консистенції досліджуваного продукту . Для одержання однорідного гомогенізованого посівного матеріалу рекомендується використовувати гомогенізатор. При відсутності гомогенізатора наважку продукту нарізають дрібними шматочками поміщають у стерильну банку додають необхідну кількість 0 1% пептонно-сольового розчину струшують протягом 10 – 15 хвилин в апараті для струшування. 33. Крем олія вершкове масло морозиво і т.п. перед посівом розплавлюють. Для цього наважку в кількості 25 – 30 г відбирають у стерильну скляну банку і поміщають в термостат при температурі 40 °С або у водяну баню при тій же температурі. Після розплавлювання роблять посів причому при посівах масла і вершкового крему необхідно використовувати нижній шар. 34. Кістковий мозок перед посівом витягають із трубчастих кісток і емульгують у підігрітому до 43 °С фізіологічному розчині. 35. Рідкі об'єкти молоко напої супи промивні води засівають без попередньої обробки. Харчові продукти що мають кислу реакцію а також блювотні маси перед посівом нейтралізують 10% стерильним розчином двовуглекислого натрію до слаболужної реакції рН 7 2 – 7 4 . Реакцію середовища перевіряють по універсальному індикаторному або лакмусовому папірці. 36. Нерозкриті консерви в банках перед посівом оглядають відзначають зовнішній вигляд наявність бомбажу іржі і т.п. потім обмивають теплою водою з милом і перевіряють на герметичність арбітражним способом ГОСТ 8756.18-70 “Консерви. Методи проверки герметичности” . Безпосередньо перед посівом банки протирають спиртом а кришки обпалюють. 37. Ватяні тампони на скляних чи дерев'яних паличках перед посівом мають бути ретельно відмиті в рідині що використовується для зволоження тампона у момент узяття змивів. Посівним матеріалом є вся відмита рідина. Крім того посів може бути зроблений безпосередньо тампоном на щільні чи рідкі диференційні середовища. При цьому істотне значення має ретельне розтирання матеріалу досуха по всій поверхні щільного середовища. 40. Якщо випорожнення були доставлені в лабораторію без консерванту то їх перед посівом суспендують у фізіологічному розчині в співвідношенні 1:10. 41. Для одержання гемокультури роблять посів згустку крові на відповідні поживні у середовища залежності від мети дослідження. Постановку серологічної реакції роблять із сироваткою крові. З метою кращого формування згустку кров витримують 30 – 40 хвилин при кімнатній температурі або в термостаті при 37?1 °С після чого стерильною пастеровською піпеткою або прожареною петлею відокремлюють згусток від стінок пробірки і поміщають у холодильник при температурі 6?2 °С для остаточного формування згустку; сироватку відсмоктують і використовують для постановки серологічних реакцій а кров'яний згусток використовують для посіву. 42. Викладена вище методика підготовки проб до посіву доповнюється окремими методичними прийомами зазначеними у відповідних розділах даної інструкції. Порядок поводження з залишками зразків що надійшли на дослідження до лабораторії 1. Залишки зразків в яких при дослідженні встановлена наявність недозволених чи шкідливих домішок а також залишки зразків що надійшли з підозрою на те що вони є причиною харчового отруєння – опечатуються і зберігаються в лабораторії протягом 20 днів із дня видачі результатів аналізу після чого залишки з дозволу завідувача лабораторією відповідним чином знищуються. У необхідних випадках зразки продуктів які швидко псуються можуть консервуватися речовинами що не перешкодять дослідженню на наявність шкідливих домішок. Залишки зразків харчових продуктів що надійшли для досліджень з лабораторії не видаються вони знищуються або використовуються для потреб лабораторії. Виключення може бути зроблено тільки для слідчих судових органів у відношенні зразків продуктів стійких до збереження якщо зразки в епідемічному відношенні безпечні для людей що оточують і є речовими доказами. У цих випадках видача зразків в упакованому й опечатаному виді відбувається тільки по письмовому проханню слідчих чи судових органів і під офіційну розписку у якій повинно бути зазначене що “отримано залишки продуктів у їжу не придатні і необхідні як речовинний доказ”. 2. Залишки зразків продуктів що швидко псуються зберігають в холодильнику. Зразки продуктів стійких до збереження крупа цукор борошно лікеро-горілчані вироби й ін. зберігають в сухому місті. Місця зберігання залишків продукції повинні бути опечатані. Додаток 12 Методи визначення коліціногенної активності та коліціноварів шигел Визначення коліціногенної активності основане на властивості шигел продукувати коліціни з неоднаковим спектром дії на чутливі до них бактерії. За його допомогою можуть бути диференційовані багато штамів шигел що мають здатність продукувати коліціни коліціногенність Чутливість до коліцинів залежить від наявності на поверхні бактеріальної клітки рецепторів на яких відбувається адсорбція коліцинів; властивість ця специфічна тому що адсорбція різних коліцинів відбувається на визначених рецепторах. В залежності від спектра дії на чутливі бактерії і фізико-хімічні властивості усі відомі в даний час коліцини розділені на 24 типи: А; В1; В2; С; Д; Е1; Е2; Е3; Е4; G; H; І; К; L; М; N; О; Р; Х; V1; VІ;V2; V3; V4; V5. Підрозділ бактерій за коліциногенними властивостями зветься “коліциногенотипування” і виявляється методом відстроченого антагонізму за допомогою спеціально підібраних індикаторних культур. У процесі росту коліциногенного штаму коліцин дифундує в поживне середовище де може бути виявлений за допомогою індикаторних культур чутливих або стійких до визначених коліцинів. Далі приводиться два методи типування шигел на основі феномена коліциногенії: 1. Модифікований метод визначення коліціногенної активності S.sonnei за Абботом і Шенноном; 2. Визначення коліциноварів по чутливості до коліцинів за методом Фредеріка типування неколіциногенних варіантів S.sonnei та інших видів шигел . Метод коліциногенотипування S.sonnei за Абботом і Шенноном заснований на визначенні за допомогою індикаторних культур типу коліцина що продукується досліджуваними штамами S.sonnei. Набір індикаторних культур складається з 15 штамів; з яких –13 S.sonnei 1-S. disenteriae 2 і 1- варіант Е.coli.К-12 ROW. Для практичного використання оригінальний метод був дещо модифікований. Зокрема рекомендовано брати меншу кількість індикаторних штамів. В цій модифікації метод прийнятий як офіційно діючий і передбачає постійне використання 10 штамів що включають 8 штамів S.sonnei один – S.dysenteriae 2 та один E.coli. За їх допомогою може бути встановлено 17 коліциногеноварів. Інші 5 індикаторних штамів S.sonnei використовують для уточнення характеристик якщо результати визначення коліциногеновару за основною схемою викликають сумніви або необхідно їх підтвердити. Типи стабільні як in vivo у вогнищі або при повторному висіві від одного хворого висівається 1 тип так і in vitro при збереженні в лабораторних умовах на середовищі Дорсе терміном до 2-х років і більше. Для періодичної перевірки стабільності індикаторних культур у набір входять 15 еталонних культур що належать до певних умовних коліциногенотипів таблиця 1 . Скорочена схема типування по коліциногенності представлена в таблиці 2. Таблиця 1 Еталонні типові коліциногенні штами Назва штамів Реєстраційний номер Коліциногенний номер 1 Sh.sonnei 100045 1а 2 « 100046 1в 3 « 100047 2 4 « 100034 3 5 « 100048 3а 6 « 100049 4 7 « 100050 5 8 « 100051 6 9 « 100052 7 10 « 100053 8 11 « 100054 9 12 « 100055 10 13 « 100056 11 14 « 100057 12 15 « 100058 13 Індикаторні і еталонні культури зберігають на середовищі Дорсе при кімнатній температурі під гумовими пробками для запобігання висихання середовища. Пересів еталонних культур проводять через 3-4 місяця а індикаторних через 30-35 днів із середовища Дорсе на середовище Дорсе без пасажів на рідких середовищах. Таблиця 2 Схема визначення коліціногенної активності S.sonnei за J.Abbot R. Shamon в модифікації М.А.Смирнової-Мутушевої 1968 Коліцино-геновар Індикаторні штами* для постійного використання для уточнення характеристик 31 32 33 37 39 8218 41 42 43 44 34 35 36 38 40 1А + + + + - + - - - + - - + - - 1В + + + + + + - - - + - - + - - 2 - + + - + - - - - + - - - - - 3 + + + + + + + + + + - + + + + 3а + + + + + - + + + + - + + + + 4 + + + - + - + + - + Х + - + + 5 + + + + + + + + - + Х + + + + 6 - + - + + - - - - + - - + - - 7 - - + - - - - - - - - - - - - 8 + - + - - - - + - + - + - + - 9 + + + + + - - + - + - Х + + - 10 + + + + + + - + - + - + + + - 11 - - - - - - - - - + - - - - - 12 + + - + + - - + - + - + + + - 13 - + + + + - - - - + - - + - - 14 + + + + + - + + + + + + + + 15 + - + - - - + + + + + + - + + Умовні позначення: + – гальмування росту індикаторного штаму; - – відсутність зони гальмування росту індикаторного штаму; Х – варіабельні результати * Позначення індикаторних штамів відповідають наступним назвам оригінальних штамів: 31 – S.sonnei 2 32 – S.sonnei 56 33 – S.sonnei 17 37 – S.sonnei 56/98 39 – S.sonnei R6 8218 – S.dysenteriae 2 M19 41 – S.sonnei 2/64 42 – S.sonnei 2/15 43 – S.sonnei R5 44 – E.coli k-12 ROW 34 – S.sonnei 2M 35 – S.sonnei 38 36 – S.sonnei 56/56 38 – S.sonnei R1 40 – S.sonnei 2/7. Для коліциногенотипування використовують 1 5% поживний агар на гідролізаті Хоттінгера що містить 130 – 150 мг % амінного азоту і рН-7 4. Агар Хоттінгера готують невеликими партіями в щільно закупорених флаконах запобігання від висихання і зміни щільності агару . Напередодні постановки досліду агар у флаконах розтоплюють на водяній бані додаючи на 100 см3 середовища 2 – 4 краплі 0 1% спиртового розчину генціанвіолета для пригнічення росту сапрофітної повітряної флори та стимуляції коліцинопродукції розливають по 20 см3 у чашки Петрі. У день досліду чашки із середовищем злегка 20-30 хвилин підсушують у термостаті при температурі 37?1 ?С. Коліциногенотипування проводять методом перехресних посівів. Перший день підготовчий Готують чашки Петрі з поживним агаром у кількості рівній досліджуваним культурам. Досліджувані культури засівають у пробірки з м’ясо-пептонним бульйоном і інкубують при 37?1 ?С 18 – 20 годин. Другий день На підсушені чашки наносять бактеріологічною петлею 18-годинні бульйонні культури штрихом по діаметру по одній культурі на чашку – мал. 1 . Посіви інкубують при 37±1 ?С протягом 48 годин. Третій день Індикаторні культури з середовища Дорсе пересівають на м’ясо-пептонний бульйон і поміщають в термостат 37±1 ?С на 18 – 20 годин. Четвертий день 48-годинні досліджувані культури що виросли на чашках з агаром у вигляді штриха обробляють у парах хлороформу для чого в кришку перекинутої догори дном чашки наливають близько 0 5 см3 хлороформу закривають чашки і залишають при кімнатній температурі на 50-60 хвилин. Якщо по закінченню цього терміну на кришці залишаються сліди хлороформу чашки відкривають і провітрюють 20-30 хвилин. Індикаторні бульйонні культури наносять перпендикулярно первинному штриху не торкаючись його по 5 індикаторних культур з кожної сторони або всі 10 з однієї мал. 2 . Індикаторні культури засівають у суворій послідовності і нумерують тільки перший індикаторний штам. Після посіву чашки інкубують при 37±1 ?С ще протягом 18-20 годин. П'ятий день Проводять облік результатів. Якщо досліджувана культура не коліциногенна ріст всіх індикаторних культур буде неперервним по всій довжині. Якщо випробовувані культури коліциногенні то спостерігається гальмування росту чутливих до коліцину що продукується індикаторних культур. Як правило ріст індикаторних штамів переривається за 3-6 мм до штриха досліджуваної культури. Величина зони інгібіції гальмування залежить від наступних причин: 1 концентрації коліцина в агарі. Тривале зберігання культур на простих середовищах тимчасово пригнічує продукцію коліцина; 2 швидкості дифузії у щільне поживне середовище. Швидкість дифузії залежить як від типу коліцина так і від щільності поживного агару не зберігати готові середовища у флаконах більш 2-х тижнів і завжди користуватися середовищем з однією і тією ж концентрацією ; 3 часу росту первинної смужки досліджуваної культури. Найкращий термін інкубації 48 годин але якщо в екстрених випадках він скорочується до 24 годин зона пригнічення росту може бути виражена в межах 1 5-2 мм що при відсутності належного досвіду ускладнить облік результатів. Збільшення інкубації понад 48 годин також небажано тому що може в зв'язку з виснаженням середовища і зміною вологості з'явитися неспецифічне пригнічення росту більшості індикаторних культур. У тих випадках коли по яких-небудь технічних причинах через 48 годин інкубації досліджуваної культури дослід не може бути продовжений потрібно як звичайно простерилізувати чашки парами хлороформу а потім поставити їх у холодильник. Зберігати такі чашки до нанесення індикаторних штамів без збитку для типування можна 2-3 доби; 4 зниження спектру чутливості окремих індикаторних культур. Необхідно проводити контроль стабільності індикаторних культур не рідше одного разу на місяць або принаймні після кожного пересіву із середовища Дорсе на середовище Дорсе. Використовувати бульйонні культури тільки для типування і однократно тобто не можна залишати на 1-2 дня для наступних дослідів . Для типування пересівати культури тільки із середовища Дорсе. Облік результатів проводять відповідно схеми що додається таблиця 2 . У випадках коли встановлений тип не співпадає з одним із відомих типів культуру розсівають на середовищі Ендо перевіряють на чистоту і типують декілька ізольованих колоній а також перевіряють на стабільність індикаторні штами. При отриманні після цього аналогічних результатів з субкультурами досліджуваного штаму такі культури позначають як ті що не типуються. У зв’язку з можливостю знаходження нових коліциногено-типів такі культури необхідно пересилати до обласних СЕС та Центральної СЕС МОЗ України у встановленому порядку. При достатньому досвіді і хороших технічних навичках можна проводити посіви 2-х смужок досліджуваних культур на одну чашку на відстані між ними біля 3 см. Індикаторні культури наносять паралельно штрихами між досліджуваними мал. 3 . Облік проводять за звичайною схемою. Форма реєстрації результатів у робочому журналі наведена нижче таблиця 3 . Визначення типу коліцина що продукується за методом Аббота і Шеннона дозволяє протипуватии до 90-95% штамів S.sonnei. Серед інших видів збудників дизентерії феномен коліциногенії зустрічається набагато рідше наприклад S.flexneri коліциногенні: підвид Флекснера 0 5 –1 0%; підвид Ньюкасл 20 0 – 25 0%; підвид Бойда 40 0 –50 0%. Таблиця 3 Форма робочого журналу для реєстрації визначення коліціногенної активності S.sonnei №№ досліджуваних культур Індикаторні штами Тип 31 32 33 36 38 39 8218 40 43 44 18 - - + - - - - - - - 7 271 - - - - - - - - - + 11 350 + - + - + - - - - + 8 367 - - - - - - - - - - 0 У зв'язку з цим особливого значення набуває метод визначення чутливості досліджуваних неколіциногених культур до визначених коліцинів що продукуються еталонними культурами з колекції Фредеріка тобто колицинотипування. Чутливість шигел до коліцинів специфічна і залежить від наявності на поверхні бактеріальної клітки рецепторів для фіксації коліцинів. Окремим коліцинам або групі їх наприклад коліцинам групи Е відповідають визначені рецептори. Крім того на чутливість бактерій впливають стійкість до коліцинів і імунітет до дії коліцина ідентичного тому що продукується самою клітиною. Коліциночутливість визначається в 90-95% шигел незалежно від видової приналежності але ця ознака не є такою стабільною як здатність продукувати коліцини. Зміна спектра коліциночутливості частіше відмічається серед культур схильних до дисоціації S.sonnei . У зв'язку з цим необхідно типувати свіжовиділені культури не залишаючи їх на тривале зберігання. Культури з вогнища досліджуються одночасно. Визначення чутливості проводиться на 15 еталонних культурах що продукують визначені коліцини таблиця 4 . Таблиця 4 Паспортні дані еталонних коліциногенних штамів з колекції Фредеріка №№ з/п Назва штаму Тип коліцина що продукується 1. E.coli Са-7 V+m 2. Е.coli Са-18 B 3. E.coli Са-23 D 4. Е.freundi Са-31 A 5. E.coli Са-38 E+1 6. E.coli Са-42 F 7. E.coli Са-53 I 8. E.coli Са-58 H 9. E.coli Са-62 J+I 10. E.coli К-235 K 11. S.boudii Р1 S1 12. S.sonnei Р9 S3+1 13. S.dispar Р14 S5 14. S.dispar Р15* S4 15. E.coli Са-46 G * Культури S.dispar P15 на поживних середовищах при зберіганні утворюють пігмент жовтого кольору інтенсивність якого збільшується до яскраво-апельсинового кольору При одержанні колекції еталонних культур Фредеріка необхідно раз 5-6 пропасирувати їх через звичайний МПБ. Після чого визначити біохімічну характеристику і біологічну гальмівну дію на універсальних коліциночутливих індикаторних культурах – Е.coli K-12 ROW її субкультурою є індикатор Аббота і Шеннона Е.coli ? і Е.coli B. Чутливість цих індикаторних культур приведена в таблиці 5. Перевірку еталонних Е.coli проводять не рідше 1 рази в 2-3 місяця. Таблиця 5 Паспортні дані індикаторних культур з колекції Фредеріка №№ з/п Назва штаму Примітка 1. E.coli К-12 ROW Чутливий до всіх коліцинів колекції Фредеріка 2. Е.coli ? Не чутливий до S1 і S4 3. Е.coli B Не чутливий до коліцинів F S1 і S5 Коліцинотипування як і коліциногенотипування засновано на використанні феномена відстроченого антагонізму що виявляється методом перехресних посівів який описаний у розділі “коліциногенотипування” з тією тільки різницею що спочатку смужкою наносять відому еталонну коліциногенну культуру а через 48 годин паралельними штрихами перпендикулярно еталонній підсівають 18-годинні бульйонні досліджувані культури або методом агарових шарів опис якого наведений нижче. Перший день Еталонні культури з колекції Фредеріка пересівають на м’ясо-пептонний бульйон і поміщають у термостат на 18 – 20 годин при 37±1 ?С. Агар Хоттингера з генціанвіолетом як зазначено вище в розділі “коліциногенотипування” розливають у чашки Петрі кількість яких перевищує число досліджуваних культур у два рази. Другий день Маркують чашки з агаром для посіву еталонних культур. На першій чашці для 8 культур на 2-ій – для 7 культур. Підписують на кожній чашці тільки одну культуру від якої стрілкою вказують напрямок і порядок посіву по периметру чашки ставлять крапки що відповідають кількості і місцю посіву наступних культур мал.4 . 1 Са – 7 Са 18 також Са 23 Са 31 Са 38 Са 42 Са 46 Са 53. 2 Са 58 Са 62 К- 2351 Р1 Р9 Р14 Р15. Наносити всі 15 культур на одну чашку не рекомендується тому що S.sonnei мають множинну чутливість до коліцинів і облік результатів досліду буде ускладнений. Еталонні 18-годинні бульйонні культури наносять уколом в агар відповідно маркуванню чашки і посіви інкубують при 37±1 ?С 48 годин. Третій день Досліджувані культури засівають у м’ясо-пептонний бульйон і витримують при 37±1 ?С протягом 18 – 20 годин. Четвертий день Чашки з посівами еталонних культур що виросли у вигляді макроколоній – бляшок виймають з термостата. Посіви обробляють за звичайною методикою 1–1 5 години у парах хлороформу. До розплавленого й охолодженого до 45?С 0 2% агару по 5-6 см3 у пробірці додають 4-5 краплі бульйонної досліджуваної культури і виливають по 2 5-3 см3 у кожну з 2-х чашок з макроколоніями еталонних культур. Чашки інкубують 18 – 20 годин при 37±1 ?С. П'ятий день Облік результатів типування проводять по зонах пригнічення росту досліджуваних культур. Навколо макроколоній мал. 5 розмір зони визначають міліметрівкою від краю колонії до початку росту досліджуваної культури. Зони розмір яких менш 1 5 – 2 мм не враховують тому що при повторних типуваннях досліджуваної культури чутливість до даного коліцину може бути цілком відсутня. Затримку росту відзначають плюсами: зона 2-4 мм ++ зона 5-10 мм +++ зона понад 10 мм ++++. Результати типування заносять у реєстраційний журнал у вигляді спектра чутливості до еталонних коліцинів таблиця 6 . Таблиця 6 Схема реєстрації результатів коліцинотипування культур у робочому журналі №№ культур Назва культур Чутливість 112 S.sonnei B D F S5 418 S.sonnei B F Е +J К Додаток13 Рецептура деяких поживних середовищ і спосіб їх приготування 1. Загальні вимоги 1.1. Загальні вимоги до приготування поживних середовищ ПС згідно ГОСТ 10444.1-84. “Консервы. Приготовление растворов реактивов красок индикаторов и питательных сред применяемых в микробиологическом анализе” 1.2. Контроль якості ПС здійснюють згідно ІЛ ЦСЕС МОЗ України №05.4.1/1670 від 15.11.2000 року “Бактеріологічний контроль поживних середовищ”. 1.3. Кожне приготування ПС і результати контролю якості реєструють в журналі за ф. 256/О “Журнал приготування та контролю поживних середовищ”. 2. Консерванти Гліцеринова суміш: Склад: Натрію хлорид NaCl 0 85% розчин Гліцерин нейтральний Натрію гідрофосфат безводний Na2HPO4 20% розчин – 1000 см3 – 500 см3 – 150 см3 Приготування: змішують перших два інгредієнти і додають розчин натрію гідрофосфата у такій кількості щоб довести рН до 7 8 – 8 0 розливають у пробірки або флакони по 10 см3 стерилізують в автоклаві при 112?1 ?С протягом 15 хв. або текучою парою 3 дні підряд. Після стерилізації рН 7 8 – 7 8. Фосфатно-буферна суміш: Склад: Калію дигідрофосфат KH2PO4 Натрію гідрофосфат безводний Na2HPO4 Вода дистильована – 0 45 г – 5 34 г – 1000 см3 Приготування: Інгредієнти змішують розливають по 10 см3 в пробірки або флакони стерилізують в автоклаві при 120?1 ?С 30 хв. Буферна гліцерино-сольова суміш: Склад: Натрію хлорид NaCl Калію гідрофосфат KHPO4 Калію дигідрофосфат KH2PO4 Гліцерин нейтральний Вода дистильована – 4 2 г – 3 1 г – 1 г – 300 см3 – 700 см3 Приготування: інгредієнти розчиняють перемішують суміш розливають в стерильні пробірки по 5 см3 автоклавують при 112?1 ?С 30 хв. Рекомендують з метою кращого перегляду розчин слабко підфарбовувати феноловим червоним. Розчини для приготування розведень 0 1% пептонна вода: Склад: Натрію хлорид NaCl Пептон Вода дистильована – 5 г – 1 г – 1000 см3 Приготування: натрію хлорид та пептон розчиняють у дистильованій воді при повільному нагріванні. Отриманий розчин при необхідності фільтрують через паперовий фільтр встановлюють рН 7 0 ?0 1 розливають в колби пробірки або інший посуд закривають і стерилізують при 121?1 ?С протягом 30 хв. Середовища збагачення та для первинного посіву Сухі середовища Плоскірева Ендо вісмут-сульфіт агар Олькеніцкого Кліглера селенітовий бульйон Лейфсона магнієве середовище промислового виготовлення готують за прописом зазначеним на етикетці. Середовище Раппопорт Склад: М’ясо-пептонний бульйон – 900 cм3 Стерильна бичача жовч – 100 cм3 Глюкоза – 20 г Розчин індикатора Андреде – 10 cм3 Приготування: інгредієнти змішують розливають у флакони з поплавками по 50 cм3. Стерилізують автоклавуванням при 112?1 ?С 20 хв. 6 5% 10% сольовий та 1% цукровий бульйони Склад: М’ясо-пептонний бульйон – 100 cм3 Натрію хлорид або глюкоза – 6 5 10 г або 1 г Приготування: сіль або глюкозу розчиняють у м’ясо-пептонному бульйоні встановлюють рН таким чином щоб після стерилізації рН становило 6 9?0 1. Бульйон розливають у колби або пробірки і стерилізують при 121?1 ?С протягом 15 хв. 1% пептонна вода з 3% NaCl Склад: Пептон – 10 0 г Хлористий натрій – 30 0 г Азотнокислий калій – 0 1 г Вуглекислий натрій – 2 5 г Дистильована вода – 1000 см3 рН 8 4-8 6 1% пептонна вода з 7% та 10% NaCl має ідентичний склад але вміст NaCl збільшується до 70 0 г та 100 0 г відповідно. 1% пептонна вода без NaCl повинна вміщувати тільки воду та пептон. При її виготовленні підлужування проводять дуже обережно так як у випадку додавання надлишкової кількості їдкого натру нейтралізація його соляною кислотою приведе до утворення NaCl і середовище буде непридатним для визначення галофільності. Пептонну воду без NaCl не готують з основного розчину пептону так як в ньому вже є хлористий натрій. Сухий лужний агар Склад: Пептон ферментативний – 22 0 г Екстракт дріжджів – 0 5 г Натрію хлорид – 12 3 г Натрію метабісульфіт – 1 0 г Натрію карбонат – 1 5 г Натрію фосфат двозаміщений – 1 5 г Агар – 11 3 г Дистильована вода – 1000 см3 рН 7 8?0 2 Приготування: наважку сухого препарату ретельно розмішують при нагріванні в 1000 см3 дистильованої води кип’ятять протягом 2 – 3 хвилин до повного розплавлення агару відстоюють протягом 30 хвилин при необхідності фільтрують через ватно-марлевий фільтр розливають у стерильні флакони стерилізують насиченою парою при 121?1 ? С протягом 20 хвилин у паровому стерилізаторі. Середовище Вагатцума Склад: Пептон – 10 0 г Дріжджовий екстракт сухий – 3 0 г Хлористий натрій – 70 0 г Двозаміщений фосфорнокислий калій – 5 0 г Агар-агар – 150 0 г Дистильована вода – 1000 см3 Приготування: перераховані інгредієнти розчинюють при нагріванні але не стерилізують. Потім додають 1 0 г маніту 0 1 см3 0 1% спиртового розчину кристалвіолету та 5 0 см3 дефібринованої крові людини. Середовище розливають в чашки після застигання підсушують і використовують за призначенням. Середовище Нікодемуса Склад: Стерильній 2% поживний агар – 1000 см3 Етанол – 80 см3 Емульсія двох жовтків Приготування: до розплавленого і охолодженого до 45-50 ?С агару додають етиловий спирт і після перемішування емульсію яєчних жовтків. Ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі які можна зберігати у холодильнику не більше 3 діб. Емульсію яєчних жовтків готують шляхом емульгування відділених від білка 2 жовтків в 10 см3 стерильного фізіологічного розчину. Сольовий-поліміксиновий агар з 2 3 5-трифеніл-тетразолій хлоридом ТТХ Склад: Стерильний 2% поживний агар – 1000 см3 Хлорид натрію NaCl – 60 г Поліміксин «М» – 200000 – 400000 од 2 3 5-трифеніл-тетразолій хлорид – 0 1 – 0 2 г Емульсія двох жовтків Приготування: в агар після розплавлення і охолодження до 45-50 ?С додають поліміксин 2 3 5-ТТХ та емульсію жовтків ретельно перемішують і розливають в чашки Петрі які можна зберігати у холодильнику не більше 7 – 10 діб. Кров’яний агар Склад: Стерильний 2% поживний агар – 1000 см3 Кров дефібринована – 5 см3 Приготування: до розплавленого і охолодженого поживного агару додають кров ретельно перемішують і розливають у стерильні чашки Петрі. Середовища для попередньої диференціації Трицукровий агар з сечовиною Олькеніцького Склад: Дистильована вода – 1000 cм3 Сухій поживний агар – 25 г Лактоза – 10 г Сахароза – 10 г Глюкоза – 1 г Сечовина – 10 г Амоній-залізо ІІ сульфат FeSO4· NH4 2 ?·6Н2О – 0 2 г Натрій тіосульфат Na2S2O3·5Н2О – 0 3 г 0 4% водній розчин фенол-рот – 4 см3 Приготування: солі попередньо розчиняють в невеликій кількості дистильованої води. Вуглеводи і сечовину розчиняють так само але підігріваючи на водяній бані. Сухий поживний агар розплавляють в решті води підігріваючи на вогні та помішуючи. Усі інгредієнти ретельно з’єднують змішують з розплавленим агаром фільтрують через марлевий фільтр встановлюють рН 7 2–7 4. Додають індикатор добре перемішують розливають у пробірки по 6-7 см3. Стерилізують при 112?1 ?С 15 хв. Після стерилізації середовище скошують. При скошуванні залишають в нижній частині пробірки нескошений стовпчик висотою біля 2 – 2 5 см. Готове середовище має блідо-рожевий колір. Агар Кліглера Склад: Бульйон м’ясний – 1000 см3 Пептон – 20 г Лактоза – 10 г Глюкоза – 1 г Натрію хлорид NaCl – 5 г Натрію сульфіт Na2SO3 – 0 4 г Натрію тіосульфат Na2S2O3·?5Н2О – 0 08 г Заліза ІІ сульфат FeSO4·? 7H2O – 0 5 г Агар – 20 г Феноловий червоний 0 2% розчин в 50% етанолі – 12 см3 Приготування: до м’ясної води додають послідовно пептон солі натрію агар і кип’ятять до повного розплавлення агару; встановлюють рН 7 8 знову кип’ятять фільтрують через вату і додають інші інгредієнти; сульфат заліза попередньо розчиняють у невеликої кількості води. Готове середовище розливають у пробірки по 6-7 см3 і стерилізують при 112?1 ?С 30 хв. Скошують залишаючи в ніжній частині пробірки стовпчики висотою 2-2 5 см. Середовища для подальшої ідентифікації Середовище Сімонса Склад: Натрію цитрат Na3C6Н5О7·5Н2О – 3 г Натрію хлорид NaCl – 5 г Магнію сульфат MgSO4·7Н2О – 0 2 г Амонію дигідрофосфат NН4 2HPO4 – 1 5 г Калію гідрофосфат КH2PO4 – 1 г Бромтимоловий синій – 0 08 г Агар-агар – 20 г Вода дистильована – 1000 см3 Приготування: Попередньо добре відмитий агар розплавляють при підігріванні у свіжо виготовленій дистильованій воді. Всі солі спочатку розчиняють у невеликій кількості води потім розчин додають до розплавленого агару і доводять до 1000 см3. Встановлюють рН 6 9 додають індикатор у вигляді 0 2% водного розчину в об’ємі 40 мл добре перемішують розливають у стерильні пробірки по 5-7 см3 стерилізують при 121?1 ?С 15 хв. або при 112?1 ?С 30 хв. Охолоджують у скошеному положенні. Середовище Крістенсена Склад: Дистильована вода – 1000 см3 Натрію цитрат Na3C6Н5О7·5Н2О – 3 г Глюкоза – 0 2 г Дріжджовий екстракт – 22 см3 Цистеіна гідрохлорид – 0 1 г Калію дигідрофосфат КH2PO4 – 1 г Натрію хлорид NaCl – 5 г Феноловий червоний 0 4% водний розчин – 3 см3 Агар-агар – 15 г Приготування: Попередньо всі інгредієнти розчиняють в невеликий об’ємах води далі все з’єднують додаючи решту води добре перемішують приєднуючи агар. Суміш нагрівають до повного розчинення агару фільтрують встановлюють рН який в готовому середовищі повинен бути 6 7 і додають індикатор. Розливають по 5 см3 в стерильні пробірки. Стерилізують при 112?1 ?С 15 хв. Охолоджують у напівскошеному положенні залишаючи стовпчик висотою 2 см. Дріжджовий екстракт для середовища Крістенсена Склад: Дріжджі пресовані хлібні краще маточні – 500 г Дистильована вода – 1000 см3 Приготування: В 1 дм3 води розчиняють 500 г хлібних дріжджів кип’ятять протягом 1 години після чого фільтрують через паперовий фільтр. Стерилізують при 112?1 ?С 30 хв. Додають 22 см3 екстракту на 1 дм3 середовища Кристенсена. Середовище Кларка для вирощування бактерій при постановці реакцій з метиловим червоним MR і Фогеса-Проскауера VP Склад: Пептон – 7 г Калію гідрофосфат K2HPO4 – 5 г Глюкоза – 5 г Вода дистильована – 1000 см3 Приготування: інгредієнти розчиняють у воді кип’ятять 2 – 3 хв. фільтрують через паперовий фільтр встановлюють рН 6 9 – 7 0 розливають у пробірки по 4-5 см3. Стерилізують при 112?1 ?С 20 хв. Реактив для тесту MR Склад: Метиловий червоний – 0 1 Спирт етиловий 96 ? – 300 см3 Приготування: розчинити в етанолі фарбник і довести об’єм до 500 см3 дистильованою водою. Реактив для тесту VP 1 5% розчин ?-нафтола в 96 ? етиловому спирті? 2 40% розчин калію гідроокису Середовище з сечовиною за Преусом Склад: Бульйон Хотингера – 1000 см3 Агар – 15 г Глюкоза – 5 г 50% розчин сечовини – 20 см3 0 2% розчин бромтимолового синього – 12 см3 Приготування: агар розплавляють у бульйоні при підігріванні фільтрують встановлюють рН 6 9-7 0. Стерилізують при 121?1 ?С 20 хв. До стерильного поживного агару додають глюкозу сечовину індикатор. Середовище розливають в стерильні пробірки по 5 – 7 см3 і стерилізують текучою парою 15 хв. після чого скошують. Колір готового середовища оливковий. Середовище з сечовиною за Крістенсеном Склад: Пептон – 1 г Натрію хлорид NaCl – 5 г Калію дигідрофосфат КH2PO4 – 2 г Агар – 20 г Глюкоза – 1 г Феноловий червоний 0 2% розчин – 6 см3 Сечовина 20% водний розчин – 100 см3 Вода дистильована – 1000 см3 Приготування: пептон солі та агар розчиняють при нагріванні встановлюють рН фільтрують стерилізують при 112?1 ?С 20 хв. додають глюкозу та індикатор стерилізують текучою парою 1 год. охолоджують до 50-55 ?С. Розчин сечовини після стерилізуючої фільтрації асептично додають до основи. Готове середовище асептично розливають в стерильні пробірки і охолоджують у скошеному стані. Рідке середовище з сечовиною Склад: Пептон – 1 г Натрію хлорид NaCl – 5 г Калію дигідрофосфат КH2PO4 – 2 г Глюкоза – 1 г Феноловий червоний 0 2% розчин – 6 см3 Сечовина 50% водний розчин – 40 см3 Вода дистильована – 1000 см3 Приготування: до води додають пептон солі і кип’ятять 2-3 хв. вносять глюкозу. Встановлюють рН 6 8-6 9 особливо точно додають індикатор фільтрують через паперовий фільтр розливають у флакони по 150 – 200 см3 і стерилізують при 112?1 ?С 30 хв. Асептично додають сечовину 50% водний розчин витриманий 2 – 3 доби для “самостерилізації” із розрахунку кінцевого вмісту сечовини в середовищі 2%. Розливають у стерильні пробірки асептично. Середовище з фенілаланіном Склад: Дріжджовий екстракт рідкий – 100 см3 Сухий – 3 г DL L -фенілаланін – 2 г 1 г Натрію гідрофосфат Na2HPO4 – 1 г Натрію хлорид NaCl – 5 г Агар-агар – 12 г Вода дистильована – 1000 см3 Приготування: дріжджовий екстракт внести у холодну воду нагріти. Послідовно розчинити решту інгредієнтів кип’ятити до повного розчинення агару розлити по 2-3 см3 у пробірки стерилізувати при 112?1 ?С 10 хв. і зразу після стерилізації скошують. Тест-реактив – 10% водний розчин хлорного заліза FeCl3 . Зберігають при 6?2 ?С без доступу світла. Середовища для визначення індолоутворення Пептонна вода 2%? Склад: Триптон або бактопептон Натрію хлорид NaCl Вода дистильована – 20 0 г – 5 0 г – 1000 см3 Приготування: розчинити пептон та сіль у воді розлити у пробірки по 3-4 см3 стерилізувати при 121?1 ?С протягом 15 хв. Тест-реактив на індол Ковача Склад: Ізоаміловий спирт Пара-диметиламінобензальдегід Соляна кислота НСl концентрована – 150 см3 – 10 г – 50 см3 Приготування: розчинити альдегід у спирті при легкому нагріванні у водяній бані при 50-55 ?С і повільно прилити кислоту. Альдегід повинен бути світлим а готовий реактив – прозорим. Реактив Ковача готують невеликими партіями і зберігають у холодильнику при 6±2 ?С не більше 3-4 тижнів. Індикаторні папірці для визначення індолу Склад: Парадиметил-амінобензальдегід – 3 –5 г Етиловий спирт 96? – 50 см3 Фосфорна кислота очищена концентрована H3PO4 – 10 см3 Приготування: розчинити альдегід у спирті при легкому нагріванні у водяній бані при 50-55 ?С і повільно прилити кислоту. Альдегід повинен бути світлим а готовий реактив – прозорим. Отриманою теплуватою рідиною змочують смужки фільтрувального паперу висушують і нарізають вузькими смужками. Колір папірця жовтий. При наявності індолу колір папірця змінюється від бузково-рожевого до інтенсивного малинового. Поява інших кольорів на індикаторному папері не враховується. Середовища для визначення ферментації цукрів Склад: Пептон – 10 г Натрію хлорид NaCl – 5 г Індикатор Андреде – 10 см3 Вуглевод – 5 або 10 г Вода дистильована – 1000 см3 Приготування: пептон розчиняють у воді при нагріванні додають сіль та індикатор фільтрують встановлюють рН 7 1 – 7 2 стерилізують при 121?1 ?С протягом 15 хв. До стерильної основи додають вуглеводи: глюкозу лактозу сахарозу і маніт до кінцевої концентрації 1%; інші вуглеводи – до кінцевої концентрації 0 5 %. Глюкозу маніт дульцит саліцин адоніт і інозит можна додавати до поживної основи до стерилізації. Дисахариди такі як лактоза сахароза мальтоза мелобіоза трегалоза целобіоза у вигляді 10% робочого розчину стерилізувати при 121?1 ?С протягом 10 хв. або фільтрацією. Після стерилізації розчин асептично додати до поживної основи. Середовища з амінокислотами – лізином аргініном орнітином Склад: М’ясна вода – 400 см3 Пептон – 5 г Глюкоза – 1 г Бром-крезоловий пурпурний 1 6% спиртовий розчин – 0 6 см3 Крезоловий червоний 0 1% спиртовий розчин – 2 5 см3 L DL -амінокислота – 10 20 г Вода дистильована – 1000 см3 Приготування: розчинити у воді поживну основу і глюкозу встановити рН 6 0-6 1 додати індикатори розділити на 4 рівні частини. До першої частини додати L-лізин до другої – L-орнітин до третьої – L-аргінін. У четверту частину основи амінокислоти не додають контроль . Середовища розливають у пробірки по 3-4см3 і стерилізують при 121?1 ?С протягом 10 хв. Після стерилізації у середовищі з орнітином можливо утворення преципітату що не є перепоною до його використання. Гліцериново-фуксиновий бульйон Штерна Склад: Бульйон Хоттингера стерильний рН 8 0 – 1000 см3 Фуксин основний насичений 10% спиртовий розчин – 2 5 см3 Натрію сульфіт Na2SO3 10% водний розчин – 16 6 см3 Гліцерин нейтральний – 10 см3 Приготування: до бульйону додають спиртовий розчин фуксину свіжоприготовлений розчин сульфіту натрію і гліцерин ретельно перемішують розливають у пробірки по 6-7 см3 стерилізують при 112?1 ?С протягом 15 хв. Зберігати середовище можна у холодильнику не більше 14 діб. Середовище Дорсе Приготування: готується з дієтичних яєць. Шкарлупу яєць ретельно обробляють спиртом. Уміст яєць зливають у стерильну колбу з намистинами струшують до утворення гомогенної маси додають стерильний фізіологічний розчин з розрахунку 25 см3 на 1 яйце. Суміш розливають у стерильні пробірки по 4 – 5см3 і скошуючи прогрівають в апараті Коха при 80?С протягом 1 години 2 дні підряд. Середовище не підлягає стерилізації. Середовище з телуритом калію К2ТеО3 Склад: М’ясо-пептонний бульйон – 100 см3 Дріжджовій екстракт – 2 см3 Агар-агар – 1 5 г Телурит калію К2ТеО3 – 0 4 г Приготування: всі інгредієнти крім телуриту калію автоклавують при 121?1 ?С протягом 20 хв. Телурит калію розчиняють у невеликій кількості очищеної дистильованої води і стерилізують текучою парою протягом 30 хв. Телурит калію додають у середовище перед розливом її у чашки Петрі. Середовище зберігають у холодильнику не більше 7 – 10 діб. Середовище для визначення рухливості лістерій: Склад: Гідролізат казеїну ферментативний – 20 г Пептон м'ясний ферментативного – 6 г Агар – 5 г Дистильована вода – 1 дм3 Приготування: всі інгредієнти розчиняють у 1дм3 дистильованої води установлюють рН 7 3±0 2 розливають у пробірки по 5-7 см3 і автоклавують при 121±1 ?С 15 хвилин. Середовища Гіса з манітом рамнозою ксилозою для ідентифікації лістерій. 10 г пептону ферментативного і 5 г натрію хлористого розчиняють у 1 дм3 дистильованої води і додають 10 г відповідного вуглеводу. Встановлюють рН 7 1±0 1 вносять 10 см3 індикатора Андреде можливе використання індикатора бромкрезолового пурпурного “ВР” і ін. розливають у пробірки і стерилізують при 112±1 ?С 20 хвилин. Середовище для визначення лецитиназної активності лістерій. До середовища № 1 перед стерилізацією додають активоване вугілля розтерте до порошкоподібного стану до концентрації 0 5% вага/об’єм . Жовток курячого яйця розводять у 150 см3 фізіологічного розчину і додають 5 % за об’ємом до стерилізованого й охолодженого до 40-50 ?С поживного агару. Розливають у чашки Петрі по 20 см3 і підсушують при 37±1 ?С. Аналогічно готують середовище з жовтком але без активованого вугілля. Додаток 14 Нормативні посилання 2.1.Основи законодавства України про охорону здоров’я. 2.2. Закон України “Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення” від 24.12.1994р № 4004-ХІІ 2.3. Закон України “Про якість та безпеку харчових продуктів і продовольчої сировини” від 23.12.1997 р. № 771/97-ВР 2.4. Закон України “Про вилучення з обігу переробку утилізацію знищення або подальше використання неякісної та небезпечної продукції” від 14 січня 2000р. N 1393-XIV 2.5. Закон України “Про захист населення від інфекційних хвороб” від 06.04.2000р № 1645-ІІІ. 2.6. Положення “Про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні” затв. постановою Кабінету Міністрів України від 22.06.1999р. № 1109 2.7.Постанова Кабінету Міністрів України від 21.02.01. №157 “Деякі питання реєстрації обліку та звітності щодо інфекційних хвороб” 2.8. Наказ МОЗ України від 23.05.2002 № 190 “Про надання позачергових повідомлень Міністерству охорони здоров’я України”. 2.9. Міжнародна статистична класифікація хвороб та споріднених проблем. Десятий перегляд МКХ-10 ВООЗ Женева 1998 р. 2.10. ДСТУ 3038-95 “Гігієна. Терміни та визначення основних понять”. Додаток 15 Характеристика та класифікація харчових отруєнь 1. Класифікація харчових отруєнь розроблена з метою упорядкування номенклатури обліку і порядку розслідування харчових отруєнь та удосконалення лікувально-профілактичних заходів в системі охорони здоров’я. 2. За основу класифікації харчових отруєнь покладено етіологічний принцип. При її складанні враховано сучасні наукові та практичні дані стосовно етіології патогенезу клініки епідеміології і профілактики харчових отруєнь досвід попередніх класифікацій харчових отруєнь міжнародну статистичну класифікацію хвороб десятого перегляду МКХ-10 Державний стандарт України: “Гігієна. Терміни та визначення основних понять” ДСТУ 3038-95 а також нагальні потреби санітарно-епідеміологічної та лікувально-профілактичної служб. 3. Харчові отруєння – гострі неконтагіозні захворювання які виникають після вживання їжі де відбулося масивне 106 – 107 КОУ в 1 г/см3 розмноження певних штамів мікроорганізмів та/чи накопичення їх метаболітів або накопичення токсичних речовин немікробної природи до рівня патогенної дози а також захворювання що виникають внаслідок вживання отруйних рослин і тканин тварин. 4. До харчових отруєнь не відносять гострі кишкові інфекції ГКІ окрім тих що мають перебіг притаманний харчовим отруєнням харчові алергії кишкові ферментопатії розлади травлення у зв’язку з грубими порушеннями умов харчування вживання надмірної кількості харчових продуктів або окремих харчових речовин незрілих плодів несумісних продуктів тощо психогенні реакції алкогольні сп‘яніння а також отруєння пов'язані з навмисним внесенням в їжу токсичних речовин з метою самогубства вбивства або помилковим використанням отруйних речовин. 5. За етіологічним принципом виділяють чотири групи харчових отруєнь: * мікробної природи * немікробної природи * змішаної природи * невідомої природи 5.1. Харчові отруєння мікробної природи Етіологічними чинниками харчових отруєнь мікробної природи є потенційно патогенні мікроорганізми здатні продукувати ентеротоксини чи інші метаболіти в певних дозах токсичні для людини а також слабовірулентні штами патогенних кишкових бактерій. Підставою до включення слабовірулентних штамів патогенних ентеробактерій до складу чинників харчових отруєнь є сучасне положення про гетерогенність мікробних популяцій окремим клонам яких властивий різний рівень вірулентності що зумовлює різницю потенціалу патогенності не тільки між окремими видами мікроорганізмів але й між окремими штамами одного виду. Характерною рисою мікробних чинників харчових отруєнь є зумовлена їх низькою вірулентністю нездатність до розмноження в організмі практично здорової людини. Основною передумовою для виникнення харчових отруєнь мікробної природи є попереднє накопичення в їжі специфічних збудників та/або токсичних продуктів їх життєдіяльності. Патогенна доза збудників 1 ? 106 і більше КУО в 1 г/см3 чи ентеротоксинів при цьому формується безпосередньо у харчовому продукті що визначає специфіку клініки діагностики і профілактики харчових отруєнь. Характерними ознаками харчових отруєнь мікробної природи є: * короткий інкубаційний латентний період; в середньому 2 – 8 годин ?; * у разі масових спалахів практично одночасний вибуховий початок захворювань у всіх потерпілих; * швидкий перебіг захворювання від декількох годин до 3 діб ? * у разі масових спалахів дружнє одужання потерпілих після гострого клінічного періоду обривисте завершення спалаху ; * відсутність контагіозності припинення нових випадків захворювання після вилучення з раціону харчування інкримінованого продукту ; * неефективність і навіть шкідливість етіотропної терапії та позитивний клінічний результат патогенетичної терапії спрямованої на детоксикацію організму що зумовлено провідним значенням у перебігу захворювання ентеротоксикозу спричиненого мікробними метаболітами; * тотожність основних напрямків профілактики а саме: запобігання контамінації їжі запобігання розмноження збудників в їжі знищення збудників в їжі санітарно-освітня робота. Зважаючи на викладене вище до харчових отруєнь мікробної природи слід відносити неконтагіозні захворювання обумовлені порушеннями санітарних і технологічних режимів виготовлення зберігання і реалізації харчових продуктів які сприяють масивному розмноженню в їжі ентеротоксигенних штамів мікроорганізмів. Виходячи з цього положення у профілактиці харчових отруєнь мікробної природи вирішальне значення слід надавати запобіганню створення сприятливих умов для розмноження збудників у харчових продуктах тобто дотриманню встановлених технологій виготовлення продуктів умов та термінів придатності їх до споживання а також рецептур харчових продуктів вологості рН вмісту солі цукру консервантів тощо . Під час розслідування спалахів таких захворювань необхідно виявляти наявність зазначених умов виходячи з того що за їх відсутності виникнення харчового отруєння мікробної природи неможливе. Дане визначення формує тактику розслідування харчових отруєнь та оптимізує вибір лабораторних методів дослідження. Ґрунтуючись на особливостях патогенезу клініко-епідеміологічного перебігу та біологічних властивостей збудників. розрізняють п'ять підгруп харчових отруєнь мікробної природи: * бактеріальні харчові інтоксикації класичні спричинені токсинами ентеротоксигенних штамів Staphylococcus i Clostridium botulinum; * бактеріальні харчові токсикоінфекції спричинені ентеротоксигенними штамами та метаболітами потенційно патогенних бактерій; * інфекції з перебігом хвороби притаманним для харчових отруєнь спричинені слабовірулентними штамами патогенних кишкових бактерій; * грибкові харчові отруєння мікотоксикози ; * скомбротоксикози. Бактеріальні харчові інтоксикації класичні спричинені токсинами ентеротоксигенних штамів Staphylococcus i Clostridium botulinum – гострі неконтагіозні захворювання які виникають внаслідок вживання продуктів харчування що містять в собі бактеріальні токсини які накопичились в їжі внаслідок розвитку специфічного збудника інтрадієтичні токсини . При цьому життєздатні клітини самого збудника в їжі можуть бути відсутні або знаходитись в ній у незначній кількості і не беруть участі у патогенезі. Для харчової стафілококової інтоксикації найбільш властивими є короткочасний досить бурхливий перебіг з клінічними проявами гострого гастриту та розвитком загальноінтоксикаційного синдрому тоді як діарейний синдром частіше буває досить помірним або зовсім відсутнім. Основні клінічні прояви харчового ботулізму зводяться до розладу нервової системи і розвитку загальної гіпоксії хоча у перші години захворювання можлива диспепсія. Бактеріальні харчові токсикоінфекції спричинені ентеротоксигенними штамами та метаболітами потенційно патогенних бактерій – загальна назва гострих неконтагіозних захворювань які виникають внаслідок вживання продуктів харчування що містять в собі надмірну кількість живих ентеротоксигенних штамів потенційно патогенних мікроорганізмів та деяку кількість мікробних метаболітів і токсичних продуктів білкового розпаду токсамінів . При цьому вирішальне значення у патогенезі мають мікробні метаболіти ендотоксини інтравітальні екзотоксини ферменти тощо які звільняються з мікробних клітин внаслідок руйнування збудників у шлунково-кишковому тракті. Клінічні прояви харчових інтокскацій різної етіології в основному зводяться до розвитку короткочасного гастроентериту та нерідко вираженого загальноінтоксикаційного синдрому. Найбільш постійним місцем ураження при цьому є шлунок і проксимальні відділи тонкого кишечника. інфекції з перебігом хвороби притаманним для харчових отруєнь спричинені слабовірулентними штамами патогенних кишкових бактерій. В дану підгрупу віднесені захворювання що мають перебіг хвороби притаманний харчовим отруєнням. Клініко-епідеміологічні прояви цих отруєнь відрізняються від класичного інфекційного захворювання сальмонельозу шигельозу ешеріхіозу ієрсініозу тощо значним скороченням інкубаційного періоду до 2 – 20 годин та тривалості клінічного перебігу до 1-3 діб ; відсутністю патологічних домішок у випорожненнях та виражених симптомів ураження дистальних відділів кишкового тракту; незначною температурною реакцією тощо. У разі масових отруєнь такого типу спостерігають обривисте закінчення спалаху і відсутність контагіозних випадків захворювань у осіб які спілкувались з потерпілими. Під час бактеріологічних досліджень в таких випадках помічають масивну контамінацію інкримінованого продукту збудниками що не характерно для класичного інфекційного захворювання. До того ж виділені культури збудника втрачають спроможність викликати кератокон’юнктивіт у експериментальних тварин. Наведені дані практичних та експериментальних спостережень свідчать про необхідність диференційованого підходу до діагностики терапії профілактики і розслідування випадків харчових отруєнь мікробної природи і гострих кишкових інфекцій з харчовим фактором передачі. Ротавірусні інфекції на відміну від бактеріальних є висококонтагіозним захворюванням з низькою інфікуючою дозою – до 10-100 вірусних частинок. Для даної інфекції характерно: інкубаційний період від 15 годин до 7 діб найчастіше 1-3 доби підвищення температури тіла до 39 ?С багаторазова блювота а також водянисті пінисті випорожнення з характерним кислуватим запахом та зеленуватим відтінком. Під час диференціальної діагностики необхідно враховувати гастроентерити спричинені іншими вірусами адено- ентеро- астровірусами вірусами Норфолк тощо . Харчові мікотоксикози – отруєння що виникають внаслідок вживання продуктів харчування в яких накопичились токсичні метаболіти мікроскопічних грибів. Кожний з мікотоксикозів має свої специфічні клінічні прояви але механізм виникнення захворювань і профілактичні заходи є аналогічними таким що стосуються харчових інтоксикацій. Скомбротоксикози – гострі харчові отруєння що виникають внаслідок вживання продуктів харчування які містять велику кількість гістаміну більше 100 мг% або інших токсичних амінів. Скомбротоксикози віднесені до групи харчових отруєнь мікробної природи на тій підставі що обов’язковою передумовою для інтенсивного декарбоксилювання гістидіну з утворенням надлишку гістаміну в харчовому продукті є попереднє розмноження і ферментативна активність протеолітичних бактерій що відбувається у разі порушення умов зберігання і термінів придатності до споживання продукції. 5.2. Харчові отруєння немікробної природи включають до свого складу три підгрупи: * отруєння домішками хімічних речовин; * отруєння отруйними речовинами тваринного походження; * отруєння отруйними речовинами рослинного походження. Такий склад і порядок розташування підгруп обумовлений структурою рубрифікації МКХ-10 та практичною доцільністю. 5.3. Харчові отруєння змішаної природи мікст включають до свого складу три можливих варіанти міксту що мають місце в реальних умовах: * мікст мікробної природи; * мікст немікробної природи; * мікст мікробної і немікробної природи. 5.4. До харчових отруєнь невідомої природи віднесена аліментарна пароксизмально-токсична міоглобінурія яка в окремі роки зустрічається в Україні. Захворювання виникає після вживання озерної риби яка у цих випадках містить надзвичайно стійку невідому токсичну субстанцію певно у жировій фракції організму. Отруєння людини клінічно супроводжується спочатку симптомами ураження скелетних м’язів з подальшими проявами порушення функції нирок. Класифікація харчових отруєнь Природа харчового отруєння Клас/блок за МКХ-10 Рубрика/ підрубрика за МКХ-10 Нозологічна форма захворювання та етіологічний фактор 1 2 3 4 Мікробна І/А00-А09 А05 1. Бактеріальні харчові інтоксикації класичні : А05.0 спричинені токсинами які виробляють ентеротоксигенні штами Staphylococcus А05.1 спричинені токсинами які виробляють Сlostridium botulinum А05 2. Бактеріальні харчові токсикоінфекції спричинені ентеротоксигенними штамами та метаболітами потенційно-патогенних бактерій: А05.2 Сlostridium perfringens А05.3 Vibrio parahaemolyticus А05.4 Bacillus cereus А05.8 Echerichia coli Proteus mirabilis & vulgaris Edwardsiella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Hafnia Providencia Alcaligenes Pseudomonas Aeromonas тощо А02-А05 3. Інфекції з перебігом хвороби притаманним для харчових отруєнь спричинені слабовірулентними штамами патогенних кишкових бактерій та вірусів: А02.- Salmonella крім S. typhi А03.8 Shigella sonnei А04.0 А04.1 Escherichia coli ЕРЕС ЕТЕС * А04.6 Jersinia entrerocolitica А32 Listeria monocitogenes А08.1 Ротавірусний ентерит А05.9 Бактеріальні харчові отруєння неуточнені Продовження класифікації харчових отруєнь 1 2 3 4 Мікробна XIX/T64 T64.- 4. Грибкові харчові отруєння мікотоксикози спричинені: афлатоксинами охратоксинами зеараленоном Т-2 токсином вомітоксином патуліном та іншими мікотоксинами які виробляють токсигенні гриби із роду Аspergillus Fusarium Penicillium Alternaria Claviceps purpurea тощо XIX/T61 T61.1 5. Скомбротоксикози: Отруєння токсичними амінами гістаміном тіраміном путресцином кадаверином тощо які утворюються і накопичуються в харчових продуктах до рівня патогенної дози внаслідок розвитку протеолітичних мікроорганізмів таких як: Proteus Providencia Pseudomonas Clostridium тощо Немікробна XIX/T56-Т60 1. Отруєння домішками хімічних речовин: Т56.0-Т56.9 Токсична дія металів Т57.0-Т57.9 Токсична дія інших неорганічних речовин в т.ч. арсену Т60.0-Т60.9 Токсична дія пестицидів XX/Х49 Х49.- Отруєння добривами та засобами підживлення рослин стимуляторами росту тварин харчовими добавками застосованими в надмірній кількості токсичними речовинами що мігрують в харчові продукти з технологічного обладнання посуду тари паківки тощо Продовження класифікації харчових отруєнь 1 2 3 4 Немікробна XIX/T61 Т61 2. Отруєння отруйними речовинами тваринного походження: Т61.0 Т61.2-Т61.9 Токсична дія отруйних речовин внаслідок вживання продуктів моря: сигові риби молюски водорості сакситоксин галюциногени іхтіотоксини сігуатерін альготоксини тощо . Виключено: алергічну реакцію на їжу бактеріальне харчове отруєння токсичну дію таких забруднювачів як мікотоксини ціаніди ртуть тощо ХХ Т61.2 Х49.- Отруєння іншими отруйними речовинами що містяться у спожитих залозах внутрішньої секреції тварин печінці молоці ікрі риб в період нересту у меді бджолиному при зборі нектару квітів родини верескових тощо XIX/T62 Т62 3. Отруєння отруйними речовинами рослинного походження: Т62.0 Токсична дія отруйних речовин що містяться у спожитих грибах Т62.1 Токсична дія отруйних речовин що містяться у спожитих ягодах Т62.2 Токсична дія отруйних речовин що містяться в інших отруйних рослинах: дурмані блекоті болиголові матригані віху бузині насіннях бур’янів злакових культур тощо Т62.8 Отруєння іншими отруйними речовинами що містяться в спожитих харчових продуктах: ціаногенні глікозиди кісточкових плодів фітотоксини сирої квасолі букових горіхів зеленої картоплі тощо. Продовження класифікації харчових отруєнь 1 2 3 4 Змішана міксти І/А ХІХ/А ХХ/Т А00-А09 Т61.1 Міксти мікробної природи: певні асоціації збудників харчових отруєнь мікробної природи та їх токсинів ХІХ/Т ХХ/Х Т56-Т62 Х49 Міксти немікробної природи: різноманітні комбінації отруйних речовин хімічного рослинного і тваринного походження І/А ХІХ/Т ХХ/Х А00-А09 Т56-Т62 Х49 Міксти мікробного і немікробного походження: комбінації збудників або їх токсинів мікробного походження разом з отруйними неорганічними і органічними речовинами Невідома ХІХ/Т U00-U49 T- Аліментарна пароксизмально-токсична міоглобінурія гафська юксовська сартландська хвороба : токсична субстанція озерної риби невизначеної природи * ЕРЕС – ентеропатогенні ешеріхії колі ЕТЕС – ентеротоксигенні ешеріхії колі. Додаток 16 Бібліографічні дані 1. Энтеробактерии. Руководство для врачей . Под ред. В.И. Покровского. – М.: Медицина 1985. 2. Определитель бактерий Берджи. Перевод 9-го американского издания 1994г . Под ред. Дж. Хоулта Н. Крига П. Снита Дж. Стейли С. Уильямса. – М.: Мир 1997. 3. Медицинская микробиология. Под ред акад. РАМН В.И. Покровского и проф. О.К. Поздеева. – М.: ГООСТАР 1998 4. Инструкция “О порядке расследования учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-эпидемиологической службы при пищевых отравлениях”. №1135-73 від 20.12.1973. 5. Инструкция по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза №15-6/23. 6. Беляков В.Д. Яфаєв Р.Х. Епидемиология. – М.:Медицина 1989. – 416 с. 7. Інфекційні хвороби /М.Б. Тітов Б.А.Герсун Л.Ю. Шевченко та ін.; 3-я ред.. М.Б.Тітова. – К: Вища шк. 1995. – 567 с. 8. Слободкин В.И. О современном подходе к составлению классификации пищевых отравлений. // Проблеми харчування – 2003. – №1. – С. 55-63. 9. Слободкін В.І. Шелкова Н.Г. Волянський А.Ю. Копича В.С. Волков Г.А. Кучма І.Ю. Волянський Ю.Л. Актуальні проблеми бактеріальних кишкових інфекцій що перебігають на кшталт харчових отруєнь. // Інфекційні хвороби – 2003. – № 2. – С. 96-100. 10. Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції в умовах практичної вірусологічної лабораторії методичні рекомендації . – Київ 2003. 11. Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде методические рекомендации . – Киев 1986. 12. Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды утв. МЗ СССР 7.04.81 г. – Москва 1982. ?Наявність на середовищі Ендо або Левіна повзучого росту є підставою визначити в досліджуваному матеріалі бактерії роду Proteus. Однак для біохімічного типування необхідно вивчення окремих ізольованих колоній. Для отримання ізольованих колоній з зазначених середовищ проводиться пересів в пробірки з бульйоном і після 4–5 годинної інкубації при 37±1 ?С - повторний пересів на слаболужний агар з 0 4% карболовою кислотою або на середовище Плоскірева. Наступного дня ізольовані колонії підлягають подальшому вивченню за звичайною схемою. ? В якості рідких середовищ можна застосовувати середовище Кітт – Тароцци тіогліколеве тощо. ? Сироватка типу В нейтралізує токсини типу В і типу С. ? При виникненні групового харчового отруєння в колективі і опитуванні усіх членів колективу захворілих і не захворілих які харчувались разом результати опитування оформляються відповідно з додатком 6. ?? У разі підозри на отруєння грибами або за наявності очевидного зв‘язку захворювання із вживанням грибів слід додатково з’ясувати такі питання: * місце і час збирання грибів або місце їх придбання; * ботанічний вид грибів; * спосіб кулінарної обробки грибів варення смаження соління маринування сушіння тощо ; * місце і дата вживання грибів; * кількість осіб що вживали гриби. * ботанічний вид грибів; * спосіб кулінарної обробки грибів варення смаження соління маринування сушіння тощо ; * місце і дата вживання грибів; * кількість осіб що вживали гриби. ? При 4 ?С розчин зберігає стабільність протягом 1 року. ? для підвищення чутливості і прискорення тесту у середовище можна додати L-триптофан до 0 5% ? Примітка: окрім ботулізму та мікотоксикозів ?? ?? ?? ?? 2 109 114 147