МВ 9.9.5-128-2006

МВ 9.9.5-128-2006 Організація і проведення імунологічного моніторингу за інфекціями, які контролюються засобами специфічної профілактики (дифтерія, правець, кашлюк та кір). Методичні вказівки

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ДЕРЖАВНА САНІТАРНО-ЕПІДЕМІОЛОГІЧНА СЛУЖБА ОРГАНІЗАЦІЯ І ПРОВЕДЕННЯ ІМУНОЛОГІЧНОГО МОНІТОРИНГУ ЗА ІНФЕКЦІЯМИ ЯКІ КОНТРОЛЮЮТЬСЯ ЗАСОБАМИ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ ДИФТЕРІЯ ПРАВЕЦЬ КАШЛЮК ТА КІР Методичні вказівки МВ 9.9.5 - 128 - 2006 Видання офіційне Київ - 2006 МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ДЕРЖАВНА САНІТАРНО-ЕПІДЕМІОЛОГІЧНА СЛУЖБА 9. Епідеміологія 9.5. Стан здоров'я населення у зв'язку з впливом мікробіологічного фактора ОРГАНІЗАЦІЯ І ПРОВЕДЕННЯ ІМУНОЛОГІЧНОГО МОНІТОРИНГУ ЗА ІНФЕКЦІЯМИ ЯКІ КОНТРОЛЮЮТЬСЯ ЗАСОБАМИ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ ДИФТЕРІЯ ПРАВЕЦЬ КАШЛЮК ТА КІР Методичні вказівки МВ 9.9.5 - 128 - 2006 Видання офіційне Київ - 2006 Передмова 1. Методичні вказівки розроблені на підставі Законів України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" "Про захист населення від інфекційних хвороб" Постанови Кабінету Міністрів України від 22.06.99 №1109 "Про затвердження Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні" 2. Методичні вказівки встановлюють порядок організації та проведення моніторингу за керованими інфекціями: формування контингентів для забору крові її транспортування та проведення серологічних та вірусологічних досліджень з метою вивчення рівня імунітету проти дифтерії правця кашлюку та кору. 3. Введені в дію вперше. 4. Методичні вказівки призначені для використання закладами та установами охорони здоров'я системи МОЗ України що проводять забір матеріалу та лабораторні дослідження з метою діагностики та вивчення стану імунітету у відношенні інфекцій які контролюються засобами імунопрофілактики. Методичні вказівки "Організація і проведення імунологічного моніторингу за інфекціями які контролюються засобами специфічної профілактики дифтерія правець кашлюк та кір " розроблені: - Т.О.Чумаченко - Харківський державний медичний університет 61022 м. Харків пр. Леніна 4 - О.Б.Колоколова Л.Г.Верезуб - Інститут імунології та мікробіології ім. І.І. Мечникова АМН України 61057 м. Харків вул. Пушкінська 14 - М.М.Колесников - Національний медичний університет ім. акад. А.А. Богомольця 01024 м. Київ бул. Шевченко 13 . Видання офіційне c Міністерство охорони здоров'я України Державна санітарно-епідеміологічна служба Ці методичні вказівки не можуть бути повністю або частково відтворені тиражовані і поширені без дозволу Головного державного санітарного лікаря України ЗМІСТ Стор. 1. Загальні положення 6 2. Основні закономірності розвитку імунних реакцій в організмі 7 2.1. Етапи формування імунних реакцій 7 2.2. Характеристика імунної відповіді 8 2.3. Фази розвитку поствакцинального імунітету 8 3. Принципи та організація проведення серологічних досліджень 11 3.1. Показання до проведення серологічних досліджень 12 3.2. Характеристика індикаторних груп 14 3.3. Реєстрація результатів серологічних досліджень 17 3.4. Оцінка імунологічної ефективності вакцин 17 4. Моніторинг за популяційним імунітетом населення 18 4.1. Організаційні принципи здійснення моніторингу 19 4.2. Техніка забору матеріалу для оцінки імунітету та підготовка його для дослідження 21 5. Методи вивчення та оцінки імунітету 24 5.1. Оцінка протидифтерійного імунітету 24 5.2. Оцінка протиправцевого імунітету 26 5.3. Оцінка протикашлюкового імунітету 28 5.4. Оцінка імунітету проти кору 30 6. Висновки 39 7. Вимоги безпеки 39 Література 40 МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ НАКАЗ "04" липня 2006 м. Київ № 441 Про затвердження методичних вказівок "Організація і проведення імунологічного моніторингу за інфекціями які контролюються засобами специфічної профілактики дифтерія правець кашлюк та кір " Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" НАКАЗУЮ: 1. Затвердити методичні вказівки "Організація і проведення імунологічного моніторингу за інфекціями які контролюються засобами специфічної профілактики дифтерія правець кашлюк та кір " що додаються. 2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України методичні вказівки довести до установ та закладів державної санітарно-епідеміологічної служби міністерств інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку. 3. Контроль за виконанням цього наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України Пономаренка А.М. Перший заступник Міністра головний державний санітарний лікар України С.П. Бережнов ЗАТВЕРДЖЕНО Наказ МОЗ України від 04 липня 2006 року № 441 МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ "ОРГАНІЗАЦІЯ І ПРОВЕДЕННЯ ІМУНОЛОГІЧНОГО МОНІТОРИНГУ ЗА ІНФЕКЦІЯМИ ЯКІ КОНТРОЛЮЮТЬСЯ ЗАСОБАМИ СПЕЦИФІЧНОЇ ПРОФІЛАКТИКИ ДИФТЕРІЯ ПРАВЕЦЬ КАШЛЮК ТА КІР " 1. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ 1.1. Методичні вказівки встановлюють порядок організації та проведення моніторингу за керованими інфекціями: формування контингентів для забору зразків крові їх транспортування та проведення лабораторних досліджень з метою вивчення рівня імунітету проти дифтерії правця кашлюку та кору. 1.2. Методичні вказівки призначені для спеціалістів установ та закладів охорони здоров'я що підпорядковані МОЗ України та проводять забір матеріалу і лабораторні дослідження з метою діагностики та вивчення стану імунітету у відношенні інфекцій які контролюються засобами імунопрофілактики. 1.3. Імунологічний моніторинг за станом колективного імунітету проти інфекцій які контролюються засобами імунопрофілактики є одним з основних інструментів епідеміологічного нагляду за інфекціями. Метою імунологічного моніторингу є оцінка стану індивідуального популяційного імунітету на конкретній території; визначення рівня фактичної захищеності від інфекцій в певних вікових групах населення а також оцінка якості профілактичних щеплень. 1.4. Приведена порівняльна характеристика сучасних серологічних методів оцінки рівня імунітету проти інфекцій які контролюються засобами імунопрофілактики. Значне місце відведено найбільш інформативному методу - імуноферментному аналізу ІФА рекомендованому ВООЗ. 1.5. Методичні рекомендації щодо проведення моніторингу стану популяційного імунітету проти дифтерії правця кашлюку та кору в системі епідеміологічного нагляду за цими інфекціями розроблені в Україні вперше. 2. ОСНОВНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ РОЗВИТКУ ІМУННИХ РЕАКЦІЙ В ОРГАНІЗМІ 2.1. Етапи формування імунних реакцій У розвитку імунних реакцій як гуморального так і клітинного типу можна виділити 3 етапи: аферентний центральний еферентний. На аферентному етапі здійснюється розпізнавання антигену далі - АГ антигенпрезентуючими клітинами макрофагами дендритними клітинами В- лімфоцитами ; його поглинання; процесінг та презентація в імуногенній формі. На цьому етапі відмічається підсилення міграції імунокомпетентних клітин у зоні концентрації антигену. Центральний етап характеризується розвитком реакцій міжклітинних взаємодій проліферацією та диференціюванням клоноспецифічних Т- та В- лімфоцитів формуванням ефекторних клітин та клітин імунологічної "пам'яті". В процесі розвитку гуморальної імунної реакції утворюються плазматичні клітини-продуценти антитіл при клітинній - цитотоксичні ефекторні клітини. На ефекторному етапі здійснюється реалізація імунної реакції що полягає в елімінації антигену цитотоксичними лімфоцитами та макрофагами або в нейтралізації розчиненого антигену лізисі позаклітинних бактерій специфічними антитілами. 2.2. Характеристика імунної відповіді На первинний контакт з антигеном розвивається первинна імунна відповідь на повторне потрапляння того ж антигену розвивається вторинна імунна відповідь що характеризується більш ранньою та більш сильною імунною реакцією. Так при розвитку первинної імунної відповіді максимальне накопичення антитіл спостерігається на 10-12 добу; при вторинній імунній відповіді пік імунних реакцій розвивається на 5-7 добу при цьому утворення антитіл та цитотоксичних клітин відбувається в значно більших кількостях. Провідна роль у розвитку вторинної імунної відповіді належить імунологічній "пам'яті" - Т- і В - лімфоцитам "пам'яті" які формуються у процесі первинної імунної відповіді відповідно із антигенстимульованих попередників цитотоксичних Т-лімфоцитів антигенстимульованих Т-хелперів та антигеніндукованих IgG+ - В-лімфоцитів. Вторинна імунна відповідь на відміну від первинної не посилюється макрофагами а напроти може бути навіть причиною надмірної активності фагоцитів. При повторному антигенному стимулі більш імовірна стимуляція В-лімфоцитів що утворюють високоафінні антитіла. Високоафінні антитіла в значно більшій мірі нейтралізують віруси або бактеріальні токсини ніж антитіла з низьким афінітетом. 2.3. Фази розвитку післявакцинального імунітету В основі штучного імунітету що формується при вакцинації полягають ті ж самі закономірності що й при розвитку природного імунітету. 2.3.1. Характеристика фаз розвитку післявакцинального імунітету. Перша латентна лаг-фаза являє собою інтервал між введенням антигену в складі вакцини та появою антитіл та цитотоксичних Т-лімфоцитів. Вона триває декілька діб. Друга фаза фаза росту характеризується експоненціальним збільшенням кількості антитіл та цитотоксичних Т-лімфоцитів у крові. Її тривалість для різних антигенів становить від чотирьох днів до чотирьох тижнів. Так швидке підвищення рівня антитіл на корову вакцину дозволяє використовувати її для профілактики кору протягом трьох днів після зустрічі з джерелом інфекції. В інших випадках коли період зростання інтенсивності імунітету до рівня захисного фаза росту перевищує тривалість інкубаційного періоду хвороби післяекспозіційна профілактика виявляється неефективною. Наприклад при кашлюку та дифтерії фази росту тривають відповідно 2 та 3 тижні. Третя фаза фаза зниження імунітету здійснюється спочатку швидко а потім повільно протягом декількох років або десятиріч. 2.3.2. Тривалість захисного рівня антитіл. Рівень антитіл класів IgM та IgA спадає швидше ніж титри антитіл класу IgG. Чим швидше знижується рівень захисних антитіл тим частіше потрібно вводити бустерні дози вакцини для підтримки напруженого імунітету. Так інтервал між щепленнями при вакцинації адсорбованою кашлюково-дифтерійно-правцевою вакциною далі - АКДП-вакцина не повинен бути менш ніж 1 місяць в протилежному разі антитіла що залишились після попереднього введення вакцини будуть інактивувати антиген що вводиться знову і знижувати вторинну імунну відповідь. Навпаки деяке збільшення 4-хтижневого інтервалу може посилити вторинну імунну відповідь. Тривалість імунітету проти дифтерії та правця після 4-х доз АКДП-вакцини складає 4-8 років. Надто важливі подальші бустерні дози анатоксину. Кожна додаткова доза що вводиться після 3-ї дози вакцини з не менш ніж річним інтервалом підвищує титри протиправцевих антитіл та збільшує тривалість імунітету до 10 років після четвертої дози до 20 та більше років - після п'ятої. 2.3.3. Напруженість імунітету при використанні вакцин різного типу. Напруженість імунітету після щеплення коровою вакциною може варіювати від повного тривалого захисту часткового або тимчасового захисту до повної його відсутності. Деякі особи що після щеплення мали низькі титри антитіл можуть опинитися незахищеними проти кору. Однак у випадку захворювання на кір щеплених осіб хвороба протікає більш легко ніж у нещеплених. Коли титри антитіл до вірусу кору знижуються до найнижчого рівня повторне зараження диким чи вакцинним вірусом стимулює клітини пам'яті. Виникає "анамнестична" вторинна імунна реакція коли рівні антитіл ІgG швидко зростають і досягають свого піку приблизно через 12 днів після повторного контакту з вірусом. При формуванні імунітету проти бактерій які утворюють екзотоксин першорядну роль відіграють антитоксини що нейтралізують бактеріальний токсин та попереджають пошкодження тканин. Антитоксичний імунітет розвивається при дифтерії та правці в меншій мірі - при кашлюку. Про високу ефективність антитоксинів в антиінфекційному захисті свідчить ефективність застосування антитоксичних сироваток для профілактики та лікування цих захворювань. Однак напружений антитоксичний імунітет сам по собі не забезпечує повний захист від інфікування та не попереджує бактеріоносійства. Напруженість та генетична рестрикція антибактеріального імунітету залежить від продуктів головного комплексу гістосумісності далі - ГКГ переважно від антигенів ГКГ ІІ класу. Деякі субпопуляції імунокомпетентних клітин Т-хелпери Т-ефектори надчутливості сповільненого типу розпізнають комплекси що складені із продуктів процесінгу бактеріальних антигенів та антигенів гістосумісності класу ІІ. Інші групи клітин В-лімфоцити Т-супресори можуть реагувати на непроцесований бактерійний антиген. Так кашлюкові бактерії діють безпосередньо на нормальні макрофаги змінюючи їх функціональні властивості: рухомість адгезивні властивості фагоцитарну функцію. Ці закономірності покладені в основу існуючого календаря профілактичних щеплень. 3. ПРИНЦИПИ ТА ОРГАНІЗАЦІЯ ПРОВЕДЕННЯ СЕРОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ При проведенні серологічних досліджень слід враховувати ряд положень. Відсутність антитіл у крові не завжди свідчить про відсутність імунітету. При наявності імунологічної пам'яті організм реагує на одноразову антигенну стимуляцію за вторинним типом імунної відповіді. Однак під впливом додаткових антигенних подразнень інфекційні та соматичні захворювання надбаний активний штучний імунітет може втрачатися. Ревакцинація яка імітує проникнення в організм збудника з одного боку дозволяє визначити наявність імунологічної пам'яті з іншого боку дає можливість виявити фазу тимчасової імунологічної рефрактерності яка зумовлена різними причинами а саме: впливом несприятливих чинників зовнішнього середовища генетичними особливостями організму кількістю попередніх імунізацій. Окрім цього надмірне подразнення імунної системи великою кількістю антигенів які потрапляють до організму може спричинити втрату специфічних антитіл. Тому аналіз стану напруженості імунітету в довільні терміни не дозволяє виявити усіх щеплених осіб які залишаються сприйнятливими до захворювання. Додатково для оцінки можливості виникнення захворювання а також прогнозування епідемій та спалахів у колективах необхідно при здійсненні ревакцинацій досліджувати сироватку крові пацієнта в терміни середнього інкубаційного періоду після введення вакцини і якщо вміст в ній специфічних антитіл перевищує захисний рівень титр антитоксинів 1:40 при дифтерії 1:20 при правці титр антитіл 1:10 при кору титр аглютинінів 1:160 при кашлюку то людину слід вважати захищеною від інфекції. Терміни дослідження напруженості специфічного імунітету складає: 5-7 днів після ревакцинації адсорбованим дифтерійно-правцевим анатоксином далі - АДП адсорбованим дифтерійно-правцевим анатоксином зі зменшеним вмістом антигену далі - АДП-М адсорбованим дифтерійним анатоксином далі - АД адсорбованим правцевим анатоксином далі - АП ; 14-15 днів після ревакцинації живою коровою вакциною далі - ЖКВ та комбінованими вакцинами у склад яких входить корова вакцина; 13-15 днів після ревакцинації АКДП. 3.1. Показання до проведення серологічних досліджень Серологічні дослідження проводяться: 1 з діагностичною метою; 2 за епідемічними показаннями екстрений серологічний контроль ; 3 з метою реабілітації щеплювального анамнезу; 4 при плановому контролі для оцінки ефективності та якості щеплювальної роботи 5 при здійсненні імунологічного моніторингу за станом колективного та популяційного імунітету з метою вивчення імуноструктури населення регіонів міст сіл тощо . З діагностичною метою серологічні дослідження імунітету у хворих або підозрілих на ту чи іншу інфекцію проводяться в динаміці з інтервалом 10-14 днів. За епідемічними показаннями обстежують серологічними методами осіб які знаходились в осередках дифтерійної або корової інфекції. Взяття крові у тих що спілкувались з джерелом інфекції здійснюють протягом перших двох діб з моменту виявлення спілкування з джерелом інфекції . В першу чергу серологічному обстеженню підлягають такі категорії осіб що спілкувались з джерелом інфекції: щеплені діти для визначення захисного рівня антитіл ; підлітки з невідомим щеплювальним анамнезом; а в осередках дифтерійної інфекції - також дорослі у віці до 26 років які отримали ревакцинацію у 16 років. Серологічне обстеження в осередках дифтерійної або корової інфекції призначає лікар-епідеміолог. З метою реабілітації щеплювального анамнезу при необхідності уточнення щеплювального анамнезу дитини у відношенні дифтерії та правця щоб вірно здійснити подальшу імунізацію проти цих інфекцій проводять серологічне обстеження з визначенням титрів антитіл проти дифтерійних і правцевих токсинів. Щеплювальний анамнез уточнюють при відсутності документованих даних про щеплення або при порушенні календаря щеплень. Діти з невідомим щеплювальним анамнезом при наявності титрів дифтерійного антитоксину 1:40 та вище і правцевого 1:20 та вище повинні в подальшому щеплюватись згідно календарю профілактичних щеплень. При наявності титрів дифтерійного антитоксину 1:20 і правцевого 1:10 необхідно провести додаткове щеплення АКДП АДП або АДП-М анатоксинами у залежності від віку . Через 1 5-2 міс. після додаткового щеплення необхідно повторити серологічне обстеження з визначенням титрів антитіл. Якщо титр протидифтерійних антитоксинів 1:160 і вищий подальші щеплення проводять таким дітям згідно віку. Якщо дитина з невідомим щеплювальним анамнезом не може бути обстежена серологічно слід вважати її не щепленою і провести повний курс щеплень вакцинація +ревакцинація одним з препаратів АКДП АДП АДП-М в залежності від віку і стану здоров'я і в подальшому проводити ревакцинації. Планові серологічні обстеження проводять серед певних індикаторних груп населення які формуються з осіб що мають документальне підтвердження щеплювального анамнезу за формою №63/о або №112/о і які отримали останнє щеплення за 6-18 міс. до обстеження. При вивченні специфічного імунітету не підлягають плановому обстеженню особи: - які перехворіли на дифтерійну корову та кашлюкову інфекції; - у яких відсутні щеплювальні документи; - у яких є грубі порушення календаря профілактичних щеплень які отримали неповний курс щеплень або нещеплені зовсім; - які спілкувались з хворим на дифтерійну корову та кашлюкову інфекцію або носієм дифтерійної палички протягом останніх 12 міс.; - нещеплені дорослі. Планові серологічні дослідження доцільно проводити в організованих колективах: дитячих дошкільних закладах школах училищах технікумах вузах а також у виробничих колективах. Виняток складають спеціалізовані заклади дитячі будинки будинки дитини школи-інтернати тощо у яких обстеження проводиться окремо за спеціальним завданням. 3.2. Характеристика індикаторних груп 3.2.1. Для дифтерійної інфекції та правця індикаторними групами є такі: - І група - діти 3-річного віку які отримали комплекс щеплень проти дифтерії та правця вакцинація + 1-я ревакцинація ; - ІІ група - діти 6-7 років які отримали первинний щеплювальний комплекс проти дифтерії та правця вакцинація + 1-я ревакцинація та 2-у ревакцинацію проти дифтерії; - ІІІ група - діти 11-12 років які отримали 3-ю ревакцинацію проти дифтерії; - ІV група - підлітки 14-15 років які отримали 4-ю ревакцинацію проти дифтерії та правця; -V група - дорослі 25-26 років які були щеплені у 14-15 років проти дифтерії та правця і отримали 5-ю ревакцинацію; - дорослі у вікових групах 28 - 37 років 38 - 47 років 48 - 57 років 58 і старіші. У кожній вікової групі необхідно досліджувати 50-100 зразків крові. Результати серологічних досліджень дозволяють виявити відсоток серонегативних осіб і осіб з низьким рівнем імунітету. Виявлення у кожній вікової групі до 10 % серонегативних осіб і осіб з низьким рівнем протиправцевого імунітету свідчить про задовільне проведення імунопрофілактики. У випадках збільшення цього показника в тої чи іншої вікової групі вище за 10 % необхідно провести серологічне обстеження всіх осіб цієї вікової групи. Виявлені серонегативні особи та особи з низьким рівнем імунітету підлягають імунізації відповідним імунобіологічними препаратами ІБП в залежності від віку щеплювального анамнезу та стану протидифтерійного імунітету. Результати серологічних досліджень при обстеженні дітей характеризують ефективність повторних ревакцинацій проти дифтерії та правця. Дослідження напруженості специфічного імунітету у дорослого населення дозволяє встановити ефективність та якість щеплень проти дифтерії а також вирішити питання про додаткову імунізацію. Рівень колективного імунітету вважається високим якщо у 90 % обстежених з профілактичною метою виявляється протективний імунітет проти дифтерії. 4.3.2.2. Для кашлюкової інфекції індикаторні групи є такі ж як І та ІІ групи для дифтерії і правця. 4.3.2.3. Для кору індикаторними групами є такі: діти 3-4 років дитячі дошкільні заклади діти 9-10 років школяри 3-4 класів підлітки 16-17 років учні шкіл середніх учбових закладів дорослі 23-25 років студенти останніх курсів ВУЗів донори без урахування даних щеплювального анамнезу . Для обстеження слід вибирати колективи в яких випадки захворювання на кір не реєструвалися протягом року. У кожній індикаторній групі обстежують 50-100 осіб. За рішенням епідеміолога серологічне обстеження може бути проведено і у других вікових групах. Результати серологічного обстеження дітей 3-4 років і школярів 9-10 років свідчать про рівень та напруженість протикорового імунітету в найближчі терміни відповідно після вакцинації та ревакцинації ЖКВ а результати обстеження підлітків 16-17 років - у віддалені терміни після ревакцинації ЖКВ при закінченні школи а також про рівень імунного прошарку до кору у нових колективах які створюються у середніх та вищих учбових закладах. Результати обстеження осіб 23-25 років характеризують стан специфічного імунітету до кору серед молодого дорослого населення. При аналізі результатів вивчення популяційного імунітету слід керуватися рекомендаціями ВООЗ щодо допустимого відсотка сприйнятливих до кору осіб у різних вікових групах населення. Про епідемічне благополуччя свідчать показники сприйнятливих до кору осіб у різних вікових групах а саме: 1-4 роки - 15 %; 5-9 років - 10 %; 10-14 років - 5 %; 15-17 років - 5 %. При виявленні у будь-якій групі перевищування цього показника слід виявити причини низького рівня імунітету провести аналіз щеплювальної документації зіставити дані про щеплення в усіх облікових формах на виявлених серонегативних осіб для встановлення факту наявності щеплень вияснити наявність в анамнезі у обстежених гострих захворювань одразу після щеплення ЖКВ або за 1-1 5 місяця перед обстеженням тощо оцінити умови зберігання вакцини серію препарату та ін. . Додатково необхідно перевірити стан імунітету проти кору у осіб того ж віку не менш 50 осіб але в 2-х інших колективах що знаходяться під наглядом лікувально-профілактичного закладу далі - ЛПЗ де виявлений високий відсоток серонегативних осіб. Якщо після додаткового обстеження кількість незахищених до кору буде перевищувати цей критерій слід вирішувати питання про тактику імунопрофілактики у цих колективах. Для цього на погляд епідеміолога необхідно обстежити дітей підлітків інших вікових груп. Якщо серед них частка серонегативних до вірусу кору не буде перевищувати вищенаведеного показника то додатковим щепленням в обстежених колективах та ЛПЗ підлягають лише діти підлітки того віку в якому була значна доля серонегативних осіб. Якщо відсоток серонегативних серед обстежених осіб буде значно вищий за 10 % то слід вирішувати питання про додаткове щеплення усім дітям підліткам цього ЛПЗ. Якщо значна доля серонегативних осіб виявлена у колективах дітей підлітків у двох ЛПЗ району то для оцінки щеплювальної роботи у цьому районі необхідно провести серологічне дослідження індикаторних груп в інших ЛПЗ району. 3.3. Реєстрація результатів серологічних досліджень Результати серологічних досліджень вносяться до журналу серологічних досліджень у ф.63/о облік профілактичних щеплень до історії розвитку дитини ф.112/о або амбулаторної карти дорослого сертифікату профілактичних щеплень ф.156/о - при наявності в регіоні . Результати серологічних досліджень передаються в поліклініку для вирішення питань щодо необхідності та тактики проведення імунокорекції. 3.4. Оцінка імунологічної ефективності вакцин Оцінка імунологічної ефективності вакцин проводиться тільки згідно нормативних документів при впровадженні в практику охорони здоров'я нових профілактичних препаратів або згідно рішень Державного підприємства "Центр імунобіологічних препаратів". Необхідність проведення подібних досліджень визначена неоднозначністю понять "щеплений" і "захищений". Наявний досвід свідчить що ці поняття далеко не завжди збігаються. Це було відзначено при дифтерії кору кашлюку та інших інфекціях які контролюються засобами імунопрофілактики. Для кожної інфекції встановлено свій захисний титр антитіл: для кору він дорівнює 1:10 правця - 1:20 дифтерії - 1:40 за даними РПГА; для кашлюку - 1:160 в РА и 0 01 МО/мл за даними ІФА. Найбільш об'єктивну оцінку імунологічної ефективності вакцин можна одержати при вакцинації серонегативних до специфічних антигенів людей. З таких осіб формують дві групи для дослідження з яких одна група одержує досліджуваний препарат друга - одержує в якості вакцинного препарату placebo. Оцінку імуногенності вакцинного препарату здійснюють на основі визначення різниці в числі осіб що мають антитіла в цих двох групах. Імунологічні зрушення що виникають при вакцинації оцінюють також по відсотку сероконверсії. Вакцина вважається високоефективною якщо сероконверсія складає 90% і вище. Крім того важливе значення має тривалість збереження поіслявакцинального протективного імунітету. 4. МОНІТОРИНГ ЗА ПОПУЛЯЦІЙНИМ ІМУНІТЕТОМ НАСЕЛЕННЯ Популяційний імунітет - це набутий стан специфічної захищеності популяції всього населення окремих його груп який складається із імунітету осіб котрі входять до цієї популяції. Таким чином рівень популяційного імунітету складається з сукупності захищених осіб та характеризується їх питомою вагою у популяції що вивчається. Значущість популяційного імунітету для обмеження розвитку епідемічного процесу залежить від механізму передавання інфекції вірулентності збудника окремих соціальних факторів насамперед від інтенсивності спілкування тих чи інших контингентів людей величини популяції тощо. Стан популяційного імунітету відіграє вирішальну роль в стримуванні розвитку епідемічного процесу при аерозольних інфекціях. Досвід показує що гальмуючий вплив популяційного імунітету при цьому виявляється при захищеності певної інколи - досить великої його долі. Так вважається що відбувається обмеження циркуляції збудника дифтерії при наявності 90 % захищених серед дітей і 75 % - серед дорослих. Серед соціальних факторів які також впливають на значущість популяційного імунітету важливе значення має величина популяції місто село . Високий рівень популяційного імунітету може бути досягнуто тільки за умови ретельного виконання всіх вимог наказів інструкцій котрі створюються на підставі останніх досягнень науки і практики дотримання правил зберігання імунобіологічних препаратів дозування та термінів вакцинацій та ревакцинацій та ін. а також зведення до мінімуму кількості осіб яких звільнюють від щеплень за медичними показаннями. В системі епідеміологічного нагляду за інфекціями які контролюються засобами імунопрофілактики важливими є оцінка ефективності вакцинації якості проведення щеплювальної роботи стеження за напруженістю та рівнем популяційного імунітету епідеміологічна діагностика і прогнозування розвитку перед епідемічної ситуації. Для вирішення цих задач здійснюється контроль за станом специфічного імунітету осіб різних вікових професійних і соціальних груп населення. Формування вибірки визначається лікарем-епідеміологом. Кількість обстежених залежить від загальної кількості населення відсоток обстежених повинен складати не менш 1 від 10000 осіб. При цьому важливим організаційним принципом є постійне у режимі моніторингу стеження за імунологічними показниками в індикаторних групах див.4.3.2 . 4.1. Організаційні принципи здійснення моніторингу Головними методичними Центрами в Україні по контролю за станом колективного імунітету населення є: - проти кору та кашлюку - Центральна санепідстанція МОЗ України - проти дифтерії та правця - Львівській Інститут епідеміології та гігієни. Узагальнені результати вивчення напруженості імунітету проти інфекцій які контролюються засобами імунопрофілактики Кримська республіканська обласні Київська та Севастопольська міські Центральні на водному повітряному та залізничному транспорті надсилають до відповідних методичних центрів України з проблем вивчення імунітету які працюють на базі: Центральної санепідстанції МОЗ України та Львівського інституту епідеміології та гігієни в терміни подання річних звітів. Методичні Центри подають узагальнену статистичну інформацію щодо стану колективного імунітету населення України проти дифтерії правця кашлюку та кору та її аналіз з конкретними пропозиціями до 1 травня поточного року до Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України та Центральної санепідстанції МОЗ України. Імунологічне обстеження забір крові та дослідження сироваток в ІФА РПГА РА та ін. проводиться серед населення різних вікових груп та контингентів міст та сільського населення з різним рівнем захворюваності максимальна мінімальна захворюваність; відсутність захворюваності що реєструється протягом тривалого часу . Відбір груп населення для серологічних досліджень здійснюється шляхом випадкової вибірки або кластерним методом. При цьому слід додержуватись таких принципів: - дослідження повинні бути проведені окремо як серед сільського так і міського населення; - обстеження імунітету необхідно проводити у вікових групах які наведені в формі про віковий склад населення; - вікові групи мають бути однакові за кількістю обстежених тобто репрезентативні по 20 осіб у кожній віковій групі - усього 520 осіб в області; відповідно по 10 осіб 260 осіб сільського та по 10 осіб 260 осіб міського населення області ; - кожна сироватка 1 0 мл пальцевої крові - 0 5 мл сироватки паралельно досліджується на наявність антитіл до антигенів збудників усіх 3-х інфекцій що вивчаються дифтерії правця кору а при наявності кашлюкового діагностикума - і кашлюку ; - при проведенні серологічних досліджень бажано користуватися найбільш сучасним методом ІФА який рекомендовано ВООЗ але при неможливості використання ІФА застосовують РПГА; - результати вивчення імунітету проти дифтерії правця та кору по кожній області по вікових групах надають у відповідні методичні центри . Відбір контингентів для обстеження може проводитися також методом гніздової вибірки кластерний метод . Цей метод заснований на обстеженні кластерів тобто груп населення відібраних шляхом випадкової вибірки. Для цілей Розширеною програмою імунізації ВООЗ РПІ теоретично і практично обґрунтована формула мінімальної вибірки: 30?7 30 кластерів по 7 дітей у кожнім . При цієї кількості обстежених 210 вірогідність отриманої оцінки складає 95 %. Слід зазначити що усі відібрані кластери повинні бути обстежені протягом обмеженого періоду часу переважно протягом 1 мес. що забезпечує велику репрезентативність зібраних даних. Метод гніздової вибірки містить у собі наступні етапи: вибір категорії населення що підлягає обстеженню; вибір території для обстеження: визначення місцезнаходження кластерів на обраній території і типу об'єктів у середині кластера у яких буде проводиться збір інформації родина двір школа і т.п. ; збір даних; обробка й аналіз зібраних у кластері даних; оцінка отриманих результатів. Після визначення території на якій планується провести обстеження спочатку необхідне визначити кластери і скласти список. Вибір кластерів з наявного списку може бути здійснений різними шляхами але при цьому повинна бути відома чи по крайньої мер піддаватися оцінці імовірність включення кожної одиниці вибору в число обстежуваних кластерів. Найбільш простим варіантом є рівноімовірний вибір що дає кожній одиниці рівний шанс потрапити в групу кластерів. 4.2. Техніка забору матеріалу для оцінки імунітету та підготовка його для дослідження 4.2.1. Забір матеріалу для імунологічного моніторингу. Для імунологічного моніторингу широко використовуються різні методи виявлення в сироватці крові специфічних антитіл до збудників інфекцій. Незважаючи на те що ці методи не є досконалими так як наявність тільки антитіл не відображує повністю стан макроорганізму але серологічні методи конче потрібні для вирішення цілого ряду питань що стосуються епідеміології тієї чи іншої інфекції. Забір крові з пальця здійснюють співробітники лікувально-профілактичних закладів. Кров відбирають в гумових рукавичках дотримуючись правил асептики оброблюючи рукавички 70 % спиртом перед кожним взяттям. Шкіру пальця обробляють стерильним ватним тампоном змоченим 70 % спиртом проколюють стерильним скарифікатором одноразового використання. Проби крові беруть з кінцевої фаланги безіменного пальця лівої руки. Індивідуальним стерильним скарифікатором одноразового використання роблять один або два проколи шкіри на відстані 1 5-2 5 мм в м'якуш пальця в напрямку перпендикулярному дактилоскопічним лініям пальця. Кров збирають в стерильні капіляри Панченкова та грушею видувають в стерильні центрифужні пробірки які нумерують. Об'єм крови повинен становити 0 8-1 0 мл. При обстеженні дітей першого року життя а також у випадках коли не вдається взяти кров в належній кількості її беруть в об'ємі 0 2 мл або 0 5 мл у центрифужну пробірку з 1 8 мл фізіологічного розчину. У такому разі початкове розведення сироватки становить 1:20-1:10. Після взяття крові до місця проколу шкіри прикладають ватний тампон з 70 % спиртом. Пробірку закривають ватою і залишають під кутом 10-15о на 10-15 хвилин для утворення згустку крові. Після цього пробірки ставлять у штатив і в той же день доставляють в лабораторію. В супроводжуючому документі вказують прізвище ім'я вік установу № дитячого закладу групу школу клас дату забору крові щеплювальний анамнез. В лабораторії центрифужні пробірки з кров'ю обводять запаяною пастерівською піпеткою або петлею та ставлять у холодильник на 18-24 години. Через добу обережно відокремлюють сироватку від згустку пастерівською піпеткою за допомогою гумової груші сироватка повинна бути прозорою без ознак гемолізу . Потім сироватку відсмоктують в одноразову стерильну пластикову пробірку епіндорф або стерильні ампули з обов'язковим переносом на них етикеток з попередніх пробірок і в термоконтейнері з супроводжуючими списками в двох екземплярах які в целофанових пакетах закріплюють під кришкою термоконтейнеру направляють на дослідження у відповідну лабораторію. Далі їх використовують у серологічних реакціях. Ампульовану сироватку зберігають у холодильнику при температурі + 4-6 оС не більш одного тижня при необхідності більш тривалого збереження - у морозильній камері. При температурі -15оС сироватки можна зберігати до 1 року але не допускається багаторазове заморожування та розморожування сироватки для цього сироватку розливають в декілька епіндорфів або стерильних ампул по 0 25 мл а потім вже заморожують. Одержані сироватки зібрані у різні строки досліджують одночасно. 4.2.2. Забір матеріалу для діагностики кору. Згідно рекомендацій ВООЗ для одержання коректних результатів і їх інтерпретації велике значення має правильно вибраний час відбору зразка крові відносно появи клінічних симптомів. Кров у хворого відбирають в проміжку між 4 та 28 днями від моменту появи висипки: * Стерильним шприцом відбирають 5 0 мл венозної крові пацієнта в стерильну пробірку з етикеткою на якій зазначена інформація про хворого та дата відбору крові. * Цільну кров центрифугують при 1000 g 3000 об/хв. протягом 10 хв. для одержання сироватки. * За відсутності центрифуги кров залишають на 24 год. в холодильнику при +4?С - +8?С для ретракції згустку а потім обережно переносять сироватку в другу стерильну пробірку для транспортування з інформацією про хворого епідномер ПІБ дата відбору . * Стерильну сироватку зберігають до проведення дослідження в холодильнику при +4?С - +8?С але не більше 7 діб. * Для тривалого зберігання сироватку заморожують при -20?С і транспортують в лабораторію в замороженому стані. Повторне заморожування та відтаювання сироватки не доцільне так як при цьому руйнуються специфічні антитіла. * В направленні на лабораторне дослідження обов'язково вказують: епідномер дату останньої вакцинації проти кору дату появи висипу та дату відбору зразка. 5. МЕТОДИ ВИВЧЕННЯ ТА ОЦІНКИ ІМУНІТЕТУ 5.1. Оцінка протидифтерійного імунітету Вивчення специфічного імунітету проводиться за даними реакції пасивної гемаглютинації РПГА та імуноферментного аналізу ІФА . Ці методи є найбільш простими дешевими та дозволяють досить швидко одержати результати досліджень. Крім того цілий ряд досліджень свідчить про значну кореляцію метода ІФА з методом нейтралізації антитіл сироваток в культурі клітин Vero при вивченні рівня антитоксичного імунітету що підтверджує адекватність цих методів. Але "золотим" стандартом визначення кількості антитіл в сироватці крові все ж є реакція нейтралізації на морських свинках та кролях яка дозволяє порівняти кількість антитіл в досліджуваній сироватці зі стандартною дозою протидифтерійних антитіл яка нейтралізує еритрогенний ефект гіперемію та запалення в ділянці введення стандартної дози дифтерійного токсину. Цей метод дуже трудомісткий складний та дорогий. Тому він використовується лише як національний та міжнародний стандарт. 5.1.1. Реакція пасивної гемаглютинації. Для визначення рівня дифтерійного антитоксину в сироватках людини використовують тільки сертифіковані діагностикуми. Перед використанням кожної нової серії ерітроцитарного діагностикума необхідно провести перевірку активності препарату яка вказана на пробірці антигену. Діагностикум який виявляє в сироватці антитіла в концентрації на 3 розведення нижче вказаного на етикетці стандартної сироватки не придатний для використання. Методика дослідження сироваток та облік результатів РПГА викладені в інструкції щодо використання еритроцитарного дифтерійного антигенного діагностикума. Стан вакцинального імунітету оцінюється за титрами антитіл або по вмісту антитоксичних антитіл в МО/мл. Для перерахування титрів антитоксинів в МО/мл проводять титрацію стандартної протидифтерійної сироватки титр якої визначений в міжнародних одиницях МО/мл . Це дає змогу додержуватися єдиних рекомендованих ВООЗ кількісних критеріїв які характеризують ступень сприйнятливості людей до дифтерії якими користуються в усьому світі таб. . Однак слід враховувати що результати перерахунку є орієнтовними. Таблиця Критерії сприйнятливості до дифтерії що рекомендовані ВООЗ Efstratiou Maple -1994 Вміст рівень антитоксичних антитіл Інтерпретація результатів <0 01 МО/мл Людина сприйнятлива до дифтерії 0 01 МО/мл Мінімальний рівень циркулюючих антитіл що забезпечує деякий ступень захисту 0 01-0 09 МО/мл Рівень циркулюючих антитоксичних антитіл що забезпечує певну ступень захисту 0 1 МО/мл Захисний рівень циркулюючих антитіл ?1 0 МО/мл Рівень антитоксичних антитіл що забезпечує стійку тривалу несприйнятливість до дифтерії 5.1.2. Імуноферментний аналіз. В зв'язку з тим що при постановці РПГА інколи спостерігаються псевдонегативні результати які обумовлені низьким рівнем протидифтерійних антитіл <0 01 МО/мл доцільним є використання ІФА з набором реагентів антибактеріальних та антитоксичних імуноглобулінів A M G людини. В основу ІФА покладено принцип утворення специфічного комплексу антиген-антитіло який виявляється за допомогою іншого антитіла міченого пероксидазою хрону. Після додання субстратної суміші розвивається ферментативна реакція яка виявляється по наявності кольору та реєструється за допомогою імуноферментного аналізатора при довжині хвилі 492 нм. Проведення досліджень здійснюється згідно інструкції що додається до тест-систем. 5.2. Оцінка протиправцевого імунітету Для вивчення рівня протиправцевого імунітету використовують різні методи як in vivo так і in vitro. Найбільш чутливим та точним методом є реакція нейтралізації стандартного правцевого токсину антитілами які містяться в досліджуваних сироватках імунізованих людей та виявляються в організмі лабораторних тварин мишей . За допомогою цієї реакції визначаються в основному сироваточні антитіла класу IgG які виявляються навіть у титрах 0 001 МО/мл. Однак цей метод є досить дорогим так як потребує значних затрат часу наявності певної кількості лабораторних тварин кваліфікованих фахівців та більш великого об'єму досліджуваної сироватки тому він малопридатний для практичних робітників охорони здоров'я. Взаємодію між правцевим анатоксином та протиправцевими антитілами найбільш просто можна визначити in vitro за допомогою реакції непрямої гемаглютинації РНГА та імуноферментного ІФА аналізу. Ці методи достатньо чутливі дають змогу швидко одержати результати і мають невелику вартість. Між тим вони менш специфічні ніж реакція нейтралізації in vivo але більш чутливі при виявленні IgM ніж при дослідженні IgG особливо на ранній стадії первинної імунної відповіді. 5.2.1. Реакція непрямої гемаглютинації. Ця реакція все ще використовується в Україні для оцінки стану протиправцевого імунітету. Методика дослідження сироваток та облік реакції докладно наведені в інструкції щодо використання діагностикума. Основним недоліком РНГА є те що чутливість її пов'язана з наявністю переважно IgM-антитіл. Незважаючи на те що відмічається висока кореляція між результатами РНГА та РН при дослідженні цими двома методами окремих сироваток інколи може відмічатися дуже суттєва різниця. Особливо виражені такі відмінності при тестуванні сироваток з низьким вмістом протиправцевих антитіл. 5.2.2. Імуноферментний аналіз. Метод непрямого варіанту ІФА рекомендований ВООЗ як найбільш інформативний базується на тому що специфічні антитіла які містяться у досліджуваному матеріалі реагують з правцевим анатоксином котрий був попередньо адсорбований на поверхні планшету і утворюють комплекс "антиген-антитіло". Цей комплекс у подальшому виступає як антиген. Потім до утвореного комплексу "антиген-антитіло" додають кон'югат який являє собою імуноглобуліни людини мічені ферментом пероксідазою хрону котрий вступає в реакцію як антитіло. Після завершення цієї реакції відмивають лишки кон'югату а кон'югат що зв'язався виявляють за допомогою субстрату розчину-хромогену . Кількість зв'язаного кон'югата пропорційна концентрації антитіл в досліджуваній сироватці і вимірюється за допомогою визначення інтенсивності руйнування ферментом відповідного субстрату. Як правило субстрат підбирають таким чином щоб в результаті його взаємодії з ферментом змінювався колір рідини. Інтенсивність кольору рідини визначають за допомогою спектрофотометра. Ефективність вакцин що містять правцевий анатоксин коливається в межах 80 % - 100 %. В експериментах на тваринах в яких визначали кореляцію титрів антитіл з проявами симптомів правця або гибель тварин було встановлено що мінімальним "захисним" рівнем антитіл є концентрація 0 01 МО/мл сироватки крові. Між тим як вказано в рекомендаціях ВООЗ застосовувати термін "захисний рівень антитіл" інколи невірно тому що титр антитіл визначений в РНГА який відповідає 0 01 МО/мл в ІФА не є еквівалентним титру антитіл що визначається in vivo в реакції нейтралізації і тому є завищеним. Це особливо необхідно враховувати при оцінці протиправцевого імунітету у хворих з різними пораненнями або при визначенні природного імунітету у людей. При оцінці специфічного імунітету за допомогою РНГА та ІФА захисним титром вважають титр 0 1 МО/мл а мінімальним " захисним" титром 0 01 МО/мл. 5.3. Оцінка протикашлюкового імунітету Для визначення антибактеріальних антитіл проти кашлюку використовують в основному тести in vitro - реакцію аглютинації РА та ІФА а для визначення антитоксичного імунітету - реакцію нейтралізації РН на культурі оваріальних клітин китайського ховрашка ССНО . 5.3.1. Реакція аглютинації. В реакції аглютинації РА застосовують комерційні кашлюкові та паракашлюкові діагностикуми. РА можна ставити в аглютінаційних пробірках згідно інструкції до діагностикума або в планшетах. При застосуванні мікрометоду користуються 1 8 % розчином NaCl а для полегшення обліку реакції комерційний діагностикум підфарбовують розчином метиленової синьки. Для цього у 5 мл діагностикума додають 2-3 краплини 0 1 мл водно-лужного розчину метиленової синьки що готується таким чином: готують 10 % спиртовий розчин метиленової синьки на 96 % етиловому спирті; готують водно-лужний розчин метиленової синьки на 30 мл 10 % спиртового розчину синьки додають 1 мл 1% їдкий натр або йодний калій яким і користуються . При постановці РА з досліджуваної сироватки готують 9-10 двократних розведень від 1:10 до 1:5120. Ставлять два контролі: 1. Контроль діагностикума - 0 025 мл забарвленого діагностикума та 0 025 мл 1 8% розчину NaCl; 2. Контроль сироватки - 0 025 мл фізіологічного розчину та 0 025 мл сироватки. Після цього планшети енергійно струшують протягом 2-3 хвилин ставлять в термостат на 2 години при температурі 36±1 оС щоб запобігти висихання планшети закривають полістироловими кришками або склом після чого їх залишають при кімнатної температурі 20±2 оС ще на 18-20 годин. Облік РА проводять згідно інструкції по застосуванню кашлюкового діагностикума та по наявності "парасольок" в лунках планшету. За кінцевий титр в РА слід вважати розведення при якому відмічається чітка аглютинація на 2 хрести ++ . Однак реакція вважається позитивною лише при наявності у попередніх пробірках або лунках чіткої аглютинації на чотири або три хрести ++++ або +++ . Крім РА для визначення аглютинаційних антитіл використовується також РПГА. Схема постановки та обліку цієї реакції наведено в інструкції по застосуванню. У вакцинованих серологічні дослідження проводять через 1 5 місяця після третього щеплення або ревакцинації. Титр антитіл 1:160 та більше умовно прийнятий за захисний титр. Однак повної кореляції між рівнем аглютинінів і захищеністю від інфекції немає що пов'язано з нестандартністю та низькою чутливістю бактерійних діагностикумів. Найбільш доцільно РА а також ІФА використовувати для вивчення імуноструктури населення. Слід відмітити що більш чутливою ніж РА є реакція непрямої гемаглютинації РНГА але внаслідок її нестандартності вона майже не використовується в нашій країні та за кордоном. Найбільш чутливим із серологічних тестів є ІФА який є методом вибору при визначенні наявності антитіл до різних антигенів Bordetella pertussis. 5.3.2. Імуноферментний аналіз. Як антиген в ІФА використовується ліпополісахарид ЛПС протективні антигенні комплекси такі як кашлюковий токсин КТ філаментозний гемаглютинин ФГА аглютиноген АГ пертактін та безклітинний комплекс протективних антигенів B. pertussis який містіть кашлюковий токсин та аглютиноген БКПА . Використання цих антигенів в ІФА дає змогу визначити наявність імуноглобулінів G M та A при хворобі або внаслідок імунізації. Точність тесту залежить від ступеню очищення антигенів а також від набору антигенів який використовується у реакції. Хід дослідження та інтерпретацію результатів слід проводити згідно інструкції по застосуванню тієї чи іншої тест-системи. Слід відмітити що існують також інші серологічні реакції: імуноблотінг та реакція нейтралізації. Метод імуноблотінгу засновано на взаємодії антигенів розділених за допомогою електрофорезу з антитілами до яких потім приєднують мічені радіоактивним йодом антитіла до людських імуноглобулінів а потім здійснюють ауторадіографію. Визначення рівня токсин-нейтралізуючих антитіл в реакції нейтралізації in vitro проводиться на культурі оваріальних клітин китайських ховрашків. Однак цей метод занадто трудомісткий та дорогий тому не знайшов широкого використання в практиці і застосовується тільки в наукових лабораторіях. Примітка: на даний час в країні оцінка протикашлюкового імунітету не проводиться за відсутності відповідних комерційних препаратів. 5.4. Оцінка імунітету проти кору При оцінці імунної відповіді на вакцинацію проти кору дуже важливим є правильний вибір серологічної тест-системи. Це пов'язано з тим що рівень післявакцинальних антитіл може бути низьким тому для виявлення необхідні найбільш чутливі тести. Для вивчення рівня імунітету проти кору в сучасний період пропонуються різні методи: РПГА реакція гальмування гемаглютинації РГГА ІФА реакція нейтралізації РН для виявлення сумарних вірус специфічних імуноглобулінів реакція нейтралізації бляшок РНБ та ін. Вивчення появи та динаміки накопичення імуноглобулінів різних класів IgG и IgM має велике значення. При первинній корової інфекції спочатку з'являються IgM. Однак IgM зберігаються недовго не більше 4 тижнів. Максимальний рівень їх припадає на 7-10 день після появи висипу а потім різко знижується. Для діагностики кору ВООЗ рекомендує метод ІФА для виявлення IgM антитіл. Максимально чутливими IgM ІФА тести є в проміжку часу між четвертим та 28 днями від моменту появи висипки. Тому 1 зразок крови відібраний в цей період є адекватним для серологічної діагностики кору з метою епіднагляду. IgG-антитіла з'являються в крові майже зразу після появи висипу і зберігаються на максимальному рівні протягом майже 4 тижнів після чого титри антитіл поступово знижуються але потім зберігаються усе життя. У щеплених людей атенуйованими вакцинами проти кору максимальні значення титрів антитіл нижчі. По деяким даним у людей з невеликими значеннями післявакцинального імунітету швидше відбувається зниження рівня антитіл. При повторних контактах імунізованих людей з циркулюючим диким вірусом кору антитіла зберігаються довше до 16 років . 5.4.1. Реакція пасивної гемаглютинації. Суть реакції полягає в тому що еритроцити сенсибілізовані антигеном в присутності гомологічного антитіла склеюються тобто спостерігається феномен пасивної гемаглютинації. Переваги цієї реакції в тому що вона достатньо специфічна проста в постановці дешевше ніж інші тест-системи тому вона більш широко використовується при проведенні імунологічного моніторингу. Поряд з іншими серологічними реакціями РПГА може бути використана для диференційної та ретроспективної діагностики кору. Серологічна діагностика можлива лише при наявності чотирикратного та більше зростання титру антитіл при титруванні парних сироваток або при наявності сероконверсії тобто переходу негативної імунологічної реакції в позитивну. Першу сироватку беруть не пізніше 3-го дня з моменту появу висипань а другу - через 3 тижня після цього. Сироватки з титром 1:10 оцінюють як позитивні. 5.4.2. Імуноферментний аналіз. Серед різних модифікацій ІФА для визначення антитіл класу IgG та IgМ до вірусу кору застосовується метод подвійного зв'язування. Цей метод базується на тому що перша реакція зв'язування здійснюється між антигеном вірусу кору який адсорбований на поверхні лунок планшету та антитілами IgG або IgМ досліджуваних зразків сироваток які вносять до планшету. Після інкубації тобто завершення цієї реакції планшет відмивається з метою звільнення незв'язаних компонентів в суміші. На стінках лунок залишається лише комплекс антиген-антитіло. Для індикації цих комплексів проводять другу імунологічну реакцію в якій як антиген виступає комплекс антиген-антитіло а як антитіло - кон'югат антитіла проти імуноглобулінів людини мічених ферментом - пероксидазою хрону . Після завершення другої імунологічної реакції лунки відмивають від лишку кон'югату а кон'югат виявляють за допомогою субстрату розчин хромогену- ортофенілендіамін ОФД або тетраметилбензидин ТМБ . Ці безкольорові розчини в присутності перекису водню утворює кольорову речовину змінюють колір від блідо - жовтого до оранжево - коричневого. Інтенсивність забарвлення вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 450-650 нм 490-492 нм в залежності від тест-системи яка використовується по заміру оптичної щільності ОЩ . Чим вище ОЩ розчину у лунці тим більша кількість специфічних антитіл знаходиться у відповідному розведенні проби тобто вище титр сироватки що досліджується. При відсутності антитіл лунки залишаються незабарвленими. Далі з урахуванням значень ОЩ контрольних проб проводять математичну обробку отриманих результатів дослідження. Результат аналізу вважається позитивним якщо значення ОЩ у відповідній лунці дорівнює або перевищує критичне значення ОЩкрит. яке підраховують за формулою: ОЩкрит. = ОЩср.К- +0 2 де ОЩкрит - оптична щільність критична; ОЩср.К- - оптична щільність негативного контрольного зразка. Для диференційної діагностики кору необхідно провести аналіз парних сироваток. Якщо відсоток збільшення концентрації IgG у парних сироватках менш 30 % - захворювання на кір відсутнє перевищення цього показника більш ніж 30 % свідчить про статистичне достовірне збільшення концентрації IgG що підтверджує наявність гострої інфекції. Специфічність та чутливість ІФА досить висока і становить 95-90 % відповідно. 5.4.2.1. Варіанти проведення ІФА. ВООЗ рекомендує при виявленні специфічних антитіл до вірусу кору такі варіанти проведення методу ІФА: 5.4.2.1.1. "Подвійний сендвіч" або метод "захвату" ІgM антитіл до вірусу кору Принцип методу: При проведенні ІФА в цій модифікації ІgM антитіла що знаходяться в сироватці крові хворого зв'язуються з антитілами проти ІgM людини адсорбованими на твердій фазі. Цей етап реакції не є вірусоспецифічним Після цього планшет промивають щоб вилучити інші імуноглобуліни та білки сироватки. Після промивання антиген якій зв'язаний з ІgM антитілами виявляють за допомогою моноклональних антитіл до вірусу кору які входять до складу детекторного реагенту з хромогеном що виявляє наявність або відсутність специфічних ІgM антитіл до вірусу кору в досліджуваному зразку. Переваги методу: полегшується процедура відбору та дослідження проб оскільки в більшості випадків достатньо мати тільки одну пробу сироватки. Висока чутливість оскільки специфічні корові ІgG-антитіла видаляються промиванням вже на першому етапі проведення реакції а тому на етапі зв'язування антигену не можуть конкурувати з ІgM антитілами. Недоліки: при дослідженні сироваток відібраних в перші 3 дні після появи висипу в 20-30% випадків можуть бути одержані негативні результати. 5.4.2.1.2. Непрямий метод ІФА для виявлення ІgM антитіл Принцип методу: для виявлення ІgM антитіл використовують специфічний адсорбент ревматоідного фактору для видалення із сироваток антитіл класу ІgG на підготовчому етапі реакції. Першим етапом даної модифікації ІФА є сорбція специфічного коровго антигену на твердій фазі. Далі в планшети вносять досліджувані сироватки і специфічні антитіла до вірусу кору ІgM-антитіла так і ІgG-антитіла які залишилися зв'язуються з антигеном Специфічні антитіла класу ІgM виявляють або безпосередньо за допомогою мічених ферментом моноклональних антитіл проти ІgM людини прямий метод або непрямим методом за допомогою моноклональних антитіл проти ІgM людини плюс антимишині антитіла мічені ферментом. Для виявлення наявності специфічних антитіл до вірусу кору в досліджуваному зразку в реакцію додають субстрат- хромоген. Переваги: * Можливість аналізувати один зразок сироватки крові * Деякі комерційні набори не мають потенційної небезпеки перехресних реакцій з імуноглобулінами класу ІgG * Чутливість та специфічність даного тесту співпадають з аналогічними показниками для ІФА-тестів розроблених на основі варіанту ІФА "Подвійний сендвіч" Недоліки * При дослідженні сироваток відібраних в перші 3 дні після появи висипу в 20-30% випадків можуть бути одержані негативні результати * Некоректні результати можуть мати місце при недостатньому видаленні із сироватки імуноглобулінів класу ІgG 5.4.2.1.3. Непрямий метод ІФА виявлення протикорових ІgG антитіл Принцип методу * На твердій фазі адсорбований коровий антиген * В планшет вносять досліджувані проби сироватки; при наявності в них специфічних антитіл останні зв'язуються з коровим антигеном * ІgG антитіла до вірусу кору виявляють за допомогою коньюгату проти ІgG людини * Наявність специфічних ІgG антитіл виявляють за допомогою прямого чи непрямого методу використовуючи хромогенний субстрат Переваги: * Наявність протикорових ІgG-антитіл в одній пробі крові вказує на перенесене в минулому захворювання на кір або вакцинацію. * Метод може бути використаний для проведення сероепідеміологічних досліджень. * Разом з методами виявлення ІgМ-антитіл метод виявлення ІgG-антитіл може дати додаткову діагностичну інформацію. * Метод дає можливість кількісної оцінки результатів в МО/мл тобто кількісна характеристика в певний момент часу . Недоліки: * Для лабораторного підтвердження свіжого випадку кору за допомогою виявлення ІgМ-антитіл необхідні парні сироватки одержані в гострій стадії хвороби та під час реконвалесценції 5.4.2.1.4. Інтерпретація результатів лабораторного дослідження Заключна класифікація випадків підозрілих на кір в країнах де ця інфекція знаходиться у фазі попередження спалахів і елімінації мал.1 * Випадки кору вважають лабораторно підтвердженими якщо при використанні сертифікованих тест-систем ІФА в пробах сироватки крові хворих виявлені JgМ-антитіла позитивні результати або був підтверджений епідеміологічний зв'язок з хворими на кір * Випадок розцінюють як підозрілий якщо позитивні результати лабораторного обстеження були одержані іншими методами до його лабораторного підтвердження методом ІФА * Випадок при проведенні епіднагляду класифікується як клінічно підтверджений якщо сироватка крові хворого на кір не була досліджена на наявність JgМ-антитіл методом ІФА з використанням рекомендованих ВООЗ тестів * Для країн що знаходяться в фазі контролю боротьби з кором лабораторному підтвердженню підлягають тільки перші випадки під час спалаху. В цих умовах рекомендується використовувати клінічну класифікацію тобто реєструвати випадки які повністю відповідають стандартному визначенню * На стадії попередження спалахів і елімінації інфекції необхідне лабораторне обстеження і підтвердження кожного окремого випадку. Це дозволить знизити кількість випадків з клінічним діагнозом кору Мал. 1. Алгоритм оцінки випадків з підозрою на захворювання на кір. 5.4.2.1.5. Інтерпретація результатів лабораторного обстеження осіб які щойно щеплені проти кору Захворювання на кір і вакцинація проти кору стимулюють утворення в організмі специфічних антитіл класу JgМ. Викликає певні труднощі оцінка результатів лабораторного обстеження хворого з підозрою на кір який був щеплений проти кору в термін менший ніж 6 тижнів до появи висипу через те що: * Вакцинація проти кору може привести появи температурної реакції у 5% вакцинованих і появи висипу у 20% щеплених * Після першого введення вакцини у щеплених як правило присутні вірусспецифічні протикорові антитіла класу ІgМ. * У вакцинованого може з'явитися приблизно через тиждень після вакцинації корова висипка яка зберігається протягом 1-3 діб * За допомогою серологічних методів неможливо диференціювати імунну відповідь на класичне захворювання на кір або вакцинацію. Відрізнити інфекційний процес від вакцинального можливо лише за допомогою виділення та вивчення вірусу * У осіб що були щойно щеплені температура і висипка можуть бути пов'язані з іншими інфекціями наприклад краснухою Враховуючи вищезазначене слід хвороби підозрілі на кір у щойно щеплених що мають специфічні антитіла класу ІgМ класифікувати таким чином: Класифікація випадків хвороби у щойно щеплених осіб при позитивному результаті дослідження на антитіла класу ІgМ Термін вакцинації Епідемічна ситуація Заключна класифікація Щеплений в термін менший ніж 6 тижнів до появи висипу На даній території не має зареєстрованих випадків кору. Хворий не відвідував території де циркулює вірус кору Діагноз кору не підтверджено Щеплений в термін менший ніж 6 тижнів до появи висипу При активному епідеміологічному розслідуванні виявлені інші лабораторно підтверджені випадки кору Діагноз кору підтверджено 5.4.3. Реакція нейтралізації бляшок використовується для контролю напруженості поствакцинального імунітету проти вірусу кору здебільш у централізованих вірусологічних лабораторіях. Реакція нейтралізації бляшок в 3 5-4 5 разів чутливіша у порівнянні з методом визначення титрів антитіл з пригніченням цитопатичної дії вірусу. При постановці реакції нейтралізації змішують рівні об'єми двократно розведених сироваток і вірусного матеріалу що містіть 100 БУО бляшкоутворюючих одиниць вірусу. Методика постановки реакції нейтралізації бляшок досить складна так як передбачає необхідність попереднього вирощування однодобових моношарових культур Vero Hela MS та ін. . Витримування суміші сироваток і вірусного матеріалу протягом 1 години при температурі +22?С забезпечує специфічну взаємодію антигенів вірусу з антитілами вакцинованого. Після цього сумішшю інфікують моношари культури клітин які попередньо відмивають розчином Хенкса і витримують 45-60 хв. для забезпечення адсорбції вірусів які не були нейтралізовані на поверхні клітин. Для визначення інфекційної активності вірусу моношарову культуру клітин заливають поживним середовищем - покриттям до складу якого входить агар або інші гелеутворюючи компоненти бентоніт агароза метілцелюлоза та ін. . Це покриття забезпечує локальне розмноження вірусу в точці його адсорбції на моношарі клітин. Після інкубування монокультури з суміші розведених сироваток і вірусного матеріалу які покрити агаром на поверхні агару з'являються бляшки просвітлені дільниці окресленої форми які являють собою нейтралізовані сироваткою ділянки загиблих клітин серед суцільного моношару культури клітин. Контролями в реакції нейтралізації бляшок РНБ як завжди є контроль клітин сироваток і вірусу. Титр антитіл в РНБ обчислюється за показником нейтралізації кількості бляшок на 50 % та більше порівняно з контролем інфекційної активності вірусу кору. 6. ВИСНОВКИ Втілення в практику охорони здоров'я методичних вказівок що пропонуються дозволить оптимізувати роботу по здійсненню серологічного моніторингу за станом колективного та популяційного імунітету проти дифтерії правця кашлюку та кору. Уніфікація методик та аналізу результатів досліджень сприятиме більш об'єктивній оцінці епідемічної ситуації щодо інфекцій які контролюються засобами імунопрофілактики і дозволить зробити науково обґрунтований прогноз розвитку епідемічного процесу. Використання викладених рекомендацій дасть можливість визначити групи ризику за тією чи іншою інфекцією своєчасно провести імунокорекцію та підвищити ефективність профілактичних та протиепідемічних заходів. В цілому втілення в практику охорони здоров'я запропонованих рекомендацій сприятиме зниженню захворюваності на контрольовані інфекції і скорішому досягненню завдань РПІ. 7. ВИМОГИ БЕЗПЕКИ Серологічні дослідження з метою вивчення стану імунітету проти дифтерії правця кашлюку та кору проводять відповідно до ДСП 9.9.5. - 080 - 2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях відділах відділеннях мікробіологічного профілю ". Заступник начальника Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Л.М.Мухарська ЛІТЕРАТУРА 1. Брико Н.И. Критерии оценки эффективности вакцинации // Вакцинация 2000. - №3. - С.3-5. 2. Волянський Ю.Л. Маніна Ж.Н. Слюсар Л.І. Верезуб Л.Г. Бабіч Є.М. Селіщева Л.М. Єрьомін М.М. Федорова Л.Г. Імунодіагностика дифтерійної інфекції // Інформаційний лист №89-97. 3. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. - М.:ООО "Медицинское информационное агенство" 2003. - 604 с. 4. Зуева Л.П. Яфаев Р.Х. Еремин С. Р. Эпидемиологическая диагностика. - Санкт-Петербург 2003. - 264 с. 5. Кириллова Г. А. Сухинова Е.Е. Шмелева Е.И. Меруалова Н.У. Ремова Т.Н. Озерецковская М.Н. Захарова Н.С. Петрова Э.П. Антипина В.Я. Опыт применения иммуноферментного анализа для диагностики коклюша // Журн. микробиол. 1994. - №6. - С.83-84. 6. Клиническая иммунология и аллергология. /под ред. Г. Лолора-младшего Т. Фишера Д. Адельмана. - М.: Практика 2000. - 806 с. 7. Ларшутин С.А. Смирнов В.Д. Сюндюкова Р.А. Просвиркина Т.Д. Лабораторная диагностика коклюша //Эпидемиология и инфекционные болезни 1998. - №2. - С.50-52. 8. Медуницын Н.В. Вакцинология. - М.: Триада-Х 1999. - 272 с. 9. Ройт А. Бростофф Дж. Мейл Д. Иммунология. - М: Мир 2000 - 592 с. 10. Ценева Г.Я. Курова Н.Н. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2003. - №4.-Т.5.- С.329-341. 11. de Souza V.A. Pannuti C.S. Sumita L.M. de Andrade J'unior H.F. Enzime-linked immunosorbent assay-IgG antibody avidity test for single sample serologic evaluation of measles vaccines. // J.Med.Virol. 1997. - №52 3 . - P.275-279. 12. Control of diphtheria pertussis tetanus Haemophilus influanzae type b and hepatitis B Field Guide. - WHO Washington 2005. - 85 p. 13. Guris D. Module on best practices for measles surveillance. - WHO Geneva 2001. - 53 p. 14. Kosters K. Riffelmann M. Dohrn B. Wirsing von Konig C. H.. Comparison of Five Commercial Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for Detection of Antibodies to Bordetella pertussis // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 2000. - Vol. 7. - No. 3. - p. 422-426. 15. Nates S.V. Rey G.Y. Giordano M.O. Depetris A.R. Boshell J. Neutralization enzyme-linked immunosorbent assay for evolution of immunity to measles virus. // Viral Immunology 1995. - №8 1 . - P. 47-52. 16. Ramsay M. A strategic framework for the elimination of measles in the European Region//Copenhagen WHO Regional Office for Europe 1999. - 36 p. 17. Strategic plan for measles and congenital rubella infection in the European region of WHO. - WHO 2003. - 43 p. 18. Surveillance Guidelines for measles and congenital rubella infection in the WHO European Region. - WHO 2003. - 66 p. 19. Vaccines Immunization and Biologicals. 2002-2005 Strategy. - WHO 2002. - 69 p. 20. WHO-recommended standards for surveillance of selected vaccine-preventable diseases. - WHO 2003. - 44 p. 21. Руководство по лабораторной диагностике кори. ВОЗ Женева 1999. ?? ?? ?? ?? 2