Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики кашлюку та паракашлюку

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ НАКАЗ N 169 15.04.2005 Про затвердження методичних вказівок з мікробіологічної діагностики кашлюку та паракашлюку Кашлюк - широко розповсюджене захворювання у світі. Щорічно хворіє близько 60 млн. чоловік з яких близько 600 000 помирає. Захворювання зустрічається й у країнах де протягом багатьох років широко проводяться щеплення проти кашлюку. В Україні в 2004 році у порівнянні з 2003 роком захворюваність на кашлюк зросла у 2 8 рази. Захворіло 2241 осіб в тому числі 2142 дітей до 14 років. Показники захворюваності склали відповідно 4 96 та 1 63 на 100 тис. населення. Серед захворілих дітей 42 5% становлять діти від 0 до 2 років 26 9% - діти у віці від 3-6 років. Найвищі показники захворюваності на кашлюк дітей до 14 років у Запорізькій 108 3 Чернігівській 79 0 Харківській 51 1 Одеській 50 2 та м. Києві 76 40 на 100 тис. дитячого населення. Достовірний діагноз у катаральному періоді може бути поставлений після одержання результатів бактеріологічних досліджень. Результативність досліджень залежить від термінів узяття матеріалу; на першому тижні захворювання позитивні результати вдається одержати в 95% хворих на другому лише в 70-80% а починаючи з 5-го тижня - збудника виділити вже не вдається. За даними галузевої статистичної звітності форма 40-здоров в 2003 році в Україні в перші 10 діб від початку захворювання бактеріологічно обстежено лише біля 30% хворих на кашлюк та паракашлюк. Показник бактеріологічного підтвердження клінічного діагнозу кашлюку в Україні останні роки є незадовільним і становить 23-24%. Аналіз якості лабораторної діагностики кашлюку свідчить про необхідність її суттєвого поліпшення що потребує забезпечення лабораторій сучасними імунобіологічними препаратами в першу чергу наборами для експрес діагностики поживними середовищами гарантованої якості для первинного посіву матеріалу впровадження методів молекулярно-генетичних досліджень для виявлення збудників кашлюку та паракашлюку та їх типування. З метою удосконалення лабораторної діагностики кашлюкової інфекції НАКАЗУЮ: 1. Затвердити "Методичні вказівки з мікробіологічної діагностики кашлюку та паракашлюку" додаються . 2. Міністру охорони здоров'я АР Крим начальникам управлінь охорони здоров'я обласних Севастопольської міської Головного управління охорони здоров'я та медичного забезпечення Київської міської держадміністрацій Головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим областей міст Києва та Севастополя на водному залізничному повітряному транспорті: 2.1. Забезпечити своєчасну клінічну та мікробіологічну діагностику кашлюку та паракашлюку у відповідності з затвердженими методичними вказівками. 2.2. Координацію робіт з лабораторної діагностики кашлюку та паракашлюку здійснення мікробіологічного моніторингу циркуляції збудників кашлюку та паракашлюку покласти на бактеріологічні лабораторії епідеміологічних відділів закладів державної санепідслужби. 2.3. Забезпечити лабораторії лікувально-профілактичних закладів та установ державної санепідслужби необхідним переліком діагностичних імунобіологічних препаратів. 2.4. Інформацію про виконання цього наказу щороку надсилати до Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України до 1 лютого. 3. Головному лікарю Центральної санітарно-епідеміологічної станції МОЗ України головним державним санітарним лікарям Автономної Республіки Крим областей міст Києва та Севастополя на водному залізничному повітряному транспорті: 3.1. Забезпечити організаційно-методичне керівництво з лабораторної діагностики кашлюку та паракашлюку узагальнення та аналіз якості досліджень результатів мікробіологічного моніторингу циркуляції збудників кашлюку та паракашлюку у регіоні та підготовку спеціалістів. 3.2. Забезпечити збір штамів збудників кашлюку та паракашлюку їх підтвердження типування щорічний аналіз структури та якості бактеріологічної діагностики. 4. Вважати такою що не застосовується на території України "Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше" МОЗ СРСР 1983р. 5. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного Мухарську Л. М. та начальника Управління організації медичної допомоги дітям та матерям Моісеєнко Р. О. .   Міністр М.Є.Поліщук ЗАТВЕРДЖЕНО наказом МОЗ України від 15.04.2005 № 169 МЕТОДИЧНI ВКАЗІВКИ З МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ КАШЛЮКУ ТА ПАРАКАШЛЮКУ 1. Загальні положення 1.1. Ці методичні вказівки встановлюють єдиний порядок відбору транспортування та проведення лабораторних досліджень з метою діагностики та профілактики кашлюкової інфекції визначають диференційну діагностику представників роду Bordetella: В.pertussis В.раrареrtussіs B.bronchiseptica на основі виділення чистої культури і вивчення комплексу біологічних ознак. 1.2.Методичні вказівки можуть бути використані усіма установами охорони здоров’я на території України незалежно від їх відомчої належності і форм власності а також юридичними і фізичними особами що проводять лабораторні дослідження з метою діагностики та профілактики кашлюку. 1.3. Кашлюк - гостра високо контагіозна інфекція респіраторного тракту що супроводжується запаленням гортані трахеї і бронхів. У типовій формі хвороба проявляється нападами пароксизмами кашлю тяжкість і тривалість яких варіюють. 1.3.1. Клінічний плин кашлюку можна розділити на три періоди - катаральний початковий продромальний спазматичний судомний пароксизмальний конвульсивний і одужання зворотний розвиток : 1 катаральна стадія починається через 3-14 зазвичай 5-8 днів після проникнення збудника і протікає як застуда бронхіт або грип. У цьому періоді хворий високо заразний тому що у верхніх дихальних шляхах присутні безліч кашлюкових бактерій у вірулентній фазі. Кашель з’являється наприкінці катарального періоду і прогресує до кінця другого тижня спазматичної стадії; 2 спазматичний період характеризується типовим приступоподібним кашлем з почервонінням обличчя сльозотечею репризами дихання із свистом обумовлене проходженням повітря крізь звужену голосову щілину в наслідок лярингоспазму . Приступ часто закінчується відходом мокротиння або блювотою. Найбільша тривалість цього періоду - 8 тижнів. У щеплених дітей і дорослих цей період може протікати без характерного судомного кашлю і реприз; 3 період одужання починається через 4-8 тижнів і характеризується зниженням частоти і сили приступів кашлю; іноді період реконвалесценції затягується на 2 - 6 міс; 4 в окремих випадках спостерігається ускладнення основного плину в наслідок приєднання вторинної бактеріальної інфекції респіраторного тракту або середнього вуха розвитком ураження центральної нервової системи. У патогенезі кашлюкової інфекції велику роль відіграють функціональні зміни в клітинних системах респіраторного тракту пов’язані зі специфічними токсинами збудника що зберігаються після його видалення з організму і клінічні симптоми підсилюються на фоні зниження концентрації збудника в зоні ураження. В. pertussis вражає нервові закінчення в результаті чого в кашлевий нервовий центр постійно поступають нервові імпульси що і зумовлює появу характерних приступів кашлю. При залученні до патологічного процесу сусідніх нервових центрів виникає блювота судинні розлади – зниження артеріального тиску судинний спазм нервові порушення - судоми. Клінічний синдром кашлюку може бути викликаний трьома збудниками: В.pertussis В.parapertussis в поодиноких випадках В.bronchiseptica. Бактеріологічне дослідження є основним методом диференційної діагностики цих захворювань а також випадків змішаної інфекції. 1.3.2. У крові хворих на кашлюк специфічні антитіла виявляються пізно: через 3-4 тижні після початку захворювання тому мають обмежене діагностичне значення. 1.3.3. Збудник нерідко зникає з респіраторного тракту раніше ніж зникають клінічні прояви. Ймовірність його виділення в класичному пароксизмальному періоді набагато нижче ніж у катаральній фазі захворювання. 2. Характеристика мікробів роду Bordetella 2.1.Збудник кашлюку - В.pertussis належить до роду Bordetella до якого також належать B.parapertussis В.bronchiseptica та B.avium. Останнім часом описані нові види бордетел: B.holmesii та B.hinzii. Bordetella parapertussis у людини викликає подібне до кашлюку захворювання паракашлюк може виділятись від здорових та хворих на пневмонію ягнят; близька до збудника кашлюку за морфологічними ознаками і умовам культивування. Воrdеtеllа bronchiseptica ізольована з носоглотки собак котів і кролів у деяких випадках викликає у людини респіраторне захворювання що нагадує кашлюк. В основному це спостерігається у працівників відповідних господарств. Воrdеtеllа avium виділялась із ексудату повітряного мішка індичок. Штами Воrdеtеllа hinzii також виділялись із дихальних шляхів індичок та курчат а також із слини та крові хворого на СНІД. Воrdеtеllа holmesii була виділена із крові пацієнтів з порушеннями функцій імунної системи. Збудник кашлюку виділений у 1910 році з мокротиння хворої дитини французькими мікробіологами Ж.Борде й О.Жангу. Bordetella - на честь Ж. Борде лат. pertussis - сильний кашель. Бордетели являють собою дрібні грам негативні кокобактерії що не утворюють спор розташовуються поодиноким групами у S-формі мають ніжну капсулу нерухливі В. pertussis В. parapertussis або рухливі В. bronchiseptica суворі аероби. Нестійкі у довкіллі прогрівання при 55°С вбиває їх через 30 хвилин. Нижче наведені характеристики клінічно значимих видів бордетел за “Определителем нетривиальных патогенных грамнегативных бактерий аэробных и факультативно анаеробных ” Р.Вейант У.Мосс Р. Уівер Д.Холліс Дж. Джордан Э. Кук М. Дейншвар. Переклад з англійської під редакцією к.м.н. В.А. Курчавого та д.б.н. Г.А. Осипова. Москва. “Мир” 1999. В. pertussis грамнегативні дрібні палички нерухливі. На звичайних поживних середовищах не ростуть але можуть адаптуватися при повторних пересівах. Добре ростуть на поживних середовищах з активованим вугіллям та кров’ю. Виділенню сприяє селективна добавка до середовища 5-40 мкг цефалексину . Зазвичай проявляють дію на кров подібну ?-гемолізу але не таку чітку як спостерігається у В.parapertussis. При густому посіві уреазонегативні пігменту не утворюють оксидазопозитивні. В.parapertussis грамнегативні дрібні палички нерухливі. Вуглеводи не утилізують ростуть на агарі Мак-Конкі оксидазонегативні нітрат не відновлюють повільно ростуть на кров’яному агарі утворюють дрібні колонії. Викликають ?-гемоліз. Утворюють коричневий водорозчинний пігмент його синтез пов’язаний з наявністю у середовищі тирозину сірководень на трьохсахарному агарі з залізом не утворюють желатину не розріджують. В. bronchiseptica грамнегативні дрібні палички рухливі перетрихіальні джгутики . Вуглеводи не утилізують. Добре ростуть на агарі Мак-Конкі та SS агарі. Оксидазопозитивні. Зазвичай уреазо- та нітрат-позитивні без утворення газу. Сірководень на трьохсахарному агарі з залізом не утворюють. Є збудниками захворювань собак свиней та лабораторних тварин включаючи кролів та морських свинок. Можуть передаватися від тварин людині. Для виділення В.pertussis необхідні спеціальні середовища. Як аероб паличка кашлюку краще росте в атмосфері збагаченій вуглекислим газом 5 - 7% СО2 тобто відрізняється капнофільністю. На щільних поживних середовищах утворюють гладенькі вологі випуклі рівні з перлинним відблиском колонії діаметром 1-2 мм які утворюються через 48-72 години культивування. Колонії В.parapertussis з’являються через 24-48 годин а В.bronchiseptica – через 18-24 години . 2.4. Для росту В.pertussis необхідна наявність різних амінокислот цистин пролін метіонін серин глютамін а також нікотинової кислоти різних солей. Оптимальна температура для їх росту 35-37°С. В.parapertussis та В.bronchiseptica не такі вимогливі і здатні рости на простому агарі. В.bronchiseptica та В.avium здатні рости у фосфатно-сольовому буфері і прісній воді які теоретично можуть бути джерелом інфекції. 2.5.Бордетели мають низьку ферментативну активність: не утворюють індол не розріджують желатину не ферментують цукрі каталазопозитивні. Особливо мало активний у біохімічному відношенні збудник кашлюку. 2.6.Фактори патогенності бордетел. Одним із найважливіших факторів патогенності збудника кашлюку є кашлюковий токсин. Він являє собою екзотоксин який складається із двох фрагментів А та В . Фрагмент А має ферментативну активність і впливає на білок мембрани клітини-мішені тим самим порушуючи її функцію. Фрагмент В відповідає за зв’язування токсину з рецепторами клітин-мішеней. З цим токсином пов’язують тяжкість перебігу захворювання та системні прояви при кашлюку. Філаментозний гемаглютинін є поверхневим білком який сприяє адгезії мікроорганізма. В експериментах на тваринах гемаглютинін не проявляв токсичності. Окремі автори говорять що рівень антитіл до філаментозного гемаглютиніну у імунізованих школярів корелював зі ступенем захищеності їх від кашлюка. Аглютиногени також є поверхневими білками стимулюючими синтез антитіл які зв’язуються з бактеріальними клітинами що призводить до аглютинації. Всього у бордетел розрізняють 16 аглютиногенів деякі з них вважаються родовими інші видовими. Крім того серед видових 7-й є основним для В.pertussis для В.bronchiseptica – таким є 12-й і для В.parapertussis – 14-й. В залежності від 2-го та 3-го аглютиногенів розрізняють 4 серотипи В.pertussis: 2 0; 0 3; 2 3; 0 0. У збудника кашлюка виділяють також 4-й 5-й 6-й 13-й 15-й та 16-й аглтиногени. Аглтиногени 8-й 9-й та 12-й – є спільними для В.bronchiseptica та В.parapertussis а 11-й – зустрічається тільки у В.bronchiseptica. Аденілатциклазний гемолізин – це також токсин який має АДФ-рибозилюючу активність і призводить до порушення функції клітини. Цей фактор патогенності діє на початкових стадіях розвитку інфекції. Трахеальний цитотоксин являє собою фрагмент пептидоглікана клітинної стінки бордетел який також може пошкоджувати епітеліальні клітини. Дермонекротизуючий токсин має судинозвужуючу активність але його роль у розвитку захворювання залишається неясною. Білки зовнішньої мембрани ліпополісахарид також належать до факторів патогенності бордетел і відіграють не аби-яку роль в патогенезі захворювання. Усі ці фактори патогенності притаманні свіжовиділеним штамам але при зберіганні на поживних середовищах вірулентність та імуногенність поступово зменшуються змінюються культуральні та біологічні властивості мікроорганізма. Адсорбовані монорецепторні сироватки до видових антигенів аглютиногенів 1 14 і 12 використовують для диференціації видів у представників роду Bordetella. Специфічними монорецепторнимі сироватки до антигенів аглютиногенів позначеним цифрами 1 2 3 розрізняють серовари збудника кашлюку за допомогою реакції аглютинації на склі. Методика постановки реакції аглютинації викладена в додатку до стандартних діагностичних сироваток. Характеристика різних властивостей мікробів роду Bordetella викладена в додатку №1. 3. Показання до лабораторного обстеження 3.1. Лабораторна діагностика кашлюку і паракашлюку може здійснюватись трьома методами: бактеріологічним при якому виділяють збудника зі слизу задньої стінки глотки; серологічним при якому визначають специфічні антитіла в сироватці хворого або особи що перехворіла та виявлення антигенів у полімеразній ланцюговій реакції. Бактеріологічний метод обстеження та ПЛР є методами ранньої діагностики захворювань серологічний - використовують для ретроспективного встановлення діагнозу. 3.2. Бактеріологічне обстеження проводять з діагностичною метою і за епідеміологічними показами. З діагностичною метою обстежують: 1 дітей і дорослих з підозрою на кашлюк і подібні до кашлюку захворювання за клінічними ознаками; 2 дітей що знаходяться в дитячих дошкільно-шкільних організаціях у тому числі закритого типу а також у пологових будинках дитячих лікарнях санаторіях що кашляють протягом 5-7 днів і більше незалежно від вказівок на контакт із хворим на кашлюк і паракашлюк; 3 дорослих що працюють з дітьми в зазначених вище організаціях які кашляють протягом 5-7 і більше днів незалежно від вказівок на контакт із хворим на кашлюк і паракашлюк; 4 реконвалесцентів перед випискою у закриті дитячі установи стаціонари і санаторії не раніше 2-3 днів після завершення прийому антибіотиків . 3.3. За епідемічними показами обстежують осіб які спілкувалися з хворими на кашлюк і паракашлюк: 1 дітей і персонал дитячих дошкільних дитячих оздоровчих установ початкових класів шкіл пологових будинків дитячих лікарень санаторіїв при спілкуванні з хворим в організації; 2 дітей до 7 років і дорослих які працюють в зазначених вище дитячих установах при спілкуванні з хворим на кашлюк у домашніх умовах; 3 обстеження проводять дворазово на 2-4 тижнях від початку кашлю в першого хворого у вогнищі. 4. Лабораторна діагностика 4.1. Основним методом лабораторної діагностики є бактеріологічний при якому проводиться посів досліджуваного матеріалу на оптимальні поживні середовища і виділення чистої культури з наступною ідентифікацією збудника. Бактеріологічне дослідження з діагностичною метою варто проводити в ранній термін захворювання але не пізніше 3-ого тижня дворазово щодня або через день тому що в більш пізній термін висіваність збудника різко знижується. Необхідність обстеження в дитячих організаціях і його терміни встановлює епідеміолог. 4.2. Матеріалом для дослідження є слиз з верхніх дихальних шляхів що осідає при кашлі на задній стінці глотки. Взяття матеріалу здійснюють натще або через 2 години після прийому їжі до початку антибактеріальної терапії. Для посіву матеріалу краще використовувати казеїново-вугільний агар з доданням 5% крові коня або барана використання крові людини дає гірші результати та пеніциліну. Метод інформативний у ранній термін захворювання: до другого тижня періоду спазматичного кашлю. 4.3. Мікроби роду Bordetella дуже вимогливі щодо поживних середовищ і умов вирощування. Висіваність їх залежить від наступних факторів: 1 терміну бактеріологічного обстеження кращої висіваності досягають при обстеженні хворих протягом 2 тижнів від початку хвороби а при обстеженні контактних - до 3 - 4 тижнів від початку захворювання першого хворого ; 2 кратності обстеження при повторних обстеженнях проведених з короткими інтервалами імовірність висіву значно збільшується ; 3 додержання правил узяття і посіву матеріалу; 4 якості тампонів використовують тільки спеціальні м’які ватні тампони; не можна їх замінювати тампонами що застосовуються для забору матеріалу на дифтерію ; 5 термінів і умов доставки матеріалу в лабораторію при транспортуванні слід оберігати матеріал від прямих сонячних променів і низької температури посіви поміщають у спеціальні термоконтейнери бікси з захисною прокладкою марлевими ватниками грілками Оптимальною температурою для тривалого транспортування становить 4оС при 25оС суттєво знижується процент позитивних результатів культурального дослідження; 6 якості поживних середовищ. В даний час доцільним вважають зменшити в 3 рази кількість пеніциліну що додається в агар або замінити пеніцилін на цефалексин останній у дозі 40 мг на 1дм3 середовища іноді може бути використаний амфотерицин у дозі 50 мг на 1дм3 для пригнічення грибкової флори. 4.4. Забір матеріалу може проводитись 2 способами - задньоглоточним тампоном і «кашлевими пластинками»: 1 задньоглоточним тампоном матеріал забирають як з діагностичною метою так і за епідемічними показами. У немовлят матеріал забирають тільки тампоном; 2 забір матеріалу задньоглоточним тампоном проводить спеціально призначений і інструктований персонал: медичні сестри дитячих поліклінік і дитячих установ помічники епідеміологів лаборанти. Матеріал беруть у дитячих поліклініках у спеціально виділених приміщеннях що виключають контакт з іншими дітьми а також у дитячих установах і вдома. При заборі матеріалу повинна бути цілком виключена можливість взаємного зараження обстежуваних; 3 для підвищення імовірності знахідки збудника матеріал відбирають 2 тампонами попередньо вигнутими під тупим кутом до стерилізації : сухим і зволоженим. Сухий тампон служить для провокації кашлю а зволожений - для безпосереднього взяття виділень. Матеріал із сухого тампона засівають на чашки з середовищем КВА обов’язково на місці його взяття а зволожений - сіють в лабораторії. Матеріал доставляють в лабораторію не пізніше 2-4 годин після взяття; Методика забору матеріалу сухим і зволоженим тампонами однакова і зводиться до наступного. Медичний працівник лівою рукою фіксує за допомогою шпателя корінь язика а правою - вводить тампон у порожнину рота просуваючи його за корінь язика. Тампон не повинен торкатися слизової оболонки щік язика і мигдалин. Кінчиком тампона й опуклою його частиною торкаються задньої стінки глотки проводячи по ній з права наліво 2-3 рази потім також обережно над шпателем витягають тампон з порожнини рота. Якщо дитина виявляє ознаки занепокоєння то помічник який знаходиться за його спиною фіксує голову позаду. 4.5. Метод “кашлевих пластинок” використовують тільки з діагностичною метою при наявності кашлю. Узяття матеріалу проводить медичний персонал. Збір матеріалу проводять на 2 чашки з поживним середовищем. Для цього під час кашлю знімають кришку з чашки Петрі підносять чашку із середовищем до рота особи яка кашляє на відстані 10-12 см і тримають протягом 5-6 кашлевих поштовхів так щоб крапельки слизу з дихальних шляхів потрапили на поверхню середовища. При нетривалому покахикуванні можна цю ж чашку піднести повторно. Необхідно стежити щоб на поживне середовище не потрапила слина блювотні маси мокротиння. Чашку з поживним середовищем закривають кришкою і доставляють у лабораторію. 4.6. При посіві матеріалу з діагностичною метою рекомендується використовувати 2 чашки із середовищем а за епідемічними показами - 1 чашку. 4.7. Інкубацію здійснюють при температурі 35оС в умовах підвищеної концентрації СО2 та підвищеної вологості. 4.8.Іншим методом виділення збудника є імунофлюоресцентний який може бути використаний при наявності якісних реагентів та кваліфікованого персоналу. 4.9.Сучасним і перспективним методом діагностики є полімеразна ланцюгова реакція ПЛР . Чутливість методу становить декілька бактерій у пробі специфічність біля 100 % при негативних культуральних дослідженнях ПЛР виявляється позитивною у 71% випадків. 4.10. Виявляти антигени В.pertussis у клінічному матеріалі можна за допомогою ІФА. Одним із варіантів цього метода є визначення кашлюкового токсину. З цією метою використовуються очищені специфічні антитіла до токсину. 5. Доставка матеріалу й оформлення направлення 5.1.Забір зберігання та доставка зразків до лабораторії проводиться з дотриманням правил асептики і біологічної безпеки при роботі з інфекційним матеріалом ДСП 9.9.5.-080–2002 . 5.2. Матеріал на зволожених тампонах і посіви матеріалу негайно доставляють в лабораторію не пізніше 2-4 годин після узяття . При транспортуванні варто оберігати матеріал від прямих сонячних променів зберігаючи його в температурних межах від +4 до +370С для чого рекомендується поміщати його в спеціальні термоконтейнери або бікси з захищаючою прокладкою марлеві ватники грілки . На матеріал що надсилають до лабораторії оформлюють направлення за формою 204/0 де додатково вказують: 1 кількість обстежень; 2 метод узяття матеріалу. 6. Бактеріологічний метод дослідження 6.1. Бактеріологічний метод дослідження передбачає виділення збудника шляхом посіву на щільні поживні середовища виділення чистої культури й ідентифікацію збудників роду Bordetella до виду. Дослідження продовжується протягом 5-7 днів. 6.2. Перший день дослідження: 1 посів матеріалу узятого тампоном проводять послідовно на 1-2 чашки з поживним середовищем що попередньо оброблене пеніциліном цефалексином або амфотерицином для пригнічення супутньої мікрофлори при узятті матеріалу “кашлевими пластинками” середовище антибіотиками не обробляють . Обробку антибіотиками можна проводити двома способами: шляхом нанесення їх на поверхню поживного середовища або шляхом додавання в середовище додаток №2 . Для одержання ізольованих колоній посів матеріалу роблять ретельно втираючи його тампоном спочатку на периферії середовища у вигляді 4-5 бляшок а потім Z - подібним штрихом у центрі чашки. Та ж методика посіву застосовується на другій чашці. Стерильним шпателем розтирають центральні частини посіву не торкаючись бляшок. Посів матеріалу також можна робити в такий спосіб: на половину чашки Петрі матеріал засівається площадкою потім розсівається на третій і четвертий сектори; 2 засіяні чашки тампоном або “кашлеві пластинки” поміщають у термостат при температурі 35-37°С на 3 доби 72 години . Для зволоження повітря в термостат ставлять посудину з водою; 3 як поживне середовище для посіву досліджуваного матеріалу застосовують середовища що містять кров: картопляно-гліцериновий агар середовище Борде-Жангу і молочно-кров'яний агар або середовища без крові: казеїново-вугільний агар КУА . Середовища можуть бути приготовлені безпосередньо в лабораторіях Додаток №3 або придбані. 6.3. Четвертий день дослідження 3 доба 72 години : 1 переглядають посіви на чашках з поживним з середовищем з метою відбору підозрілих колоній роду Bordetella. Перегляд колоній роблять за допомогою бінокулярного стереоскопічного мікроскопа або бінокулярної лупи з великою фокусною відстанню типу БМ-51-2 ; 2 колонії мікробів роду Bordetella при рості на поживних середовищах опуклі вологі гладкі блискучі з рівними краями сірого кольору з блакитнуватим перлинним або металевим а іноді жовтуватим або білуватим відтінком. Колонії всіх трьох видів Bordetella мають м’яку маслянисту консистенцію і легко знімаються. При перегляді колоній у стереоскопічному мікроскопі можна спостерігати вузький промінь світла “хвостик” що відходить від її центру. Колонії B.bronchiseptica в субкультурі можуть бути двох видів: подібні до кашлюкових і більш плоскі або з піднятим центром. Терміни появи колоній різні: колонії B.bronchiseptica з’являються через 18-24 години В. parapertussis - через 24-48 годин і В. pertussis - через 48-72 години. Різна швидкість росту відбивається на величині колоній при перегляді їх через 72 години див. таблицю . На середовищах із кров’ю навколо колоній майже завжди утворюється зона слабкого гемолізу; 3 В. parapertussis при рясному рості на середовищі КВА викликають дифузне забарвлення середовища в бурувато-коричневий колір що виявляється при перегляді в проходячому світлі а також викликають потемніння середовища з кров’ю. Ріст В.pertussis і B.bronchiseptica на поживному середовищі не супроводжується зміною його кольору; 4 при виявленні на середовищі підозрілих колоній виділяють чисту культуру шляхом відсівання їх на скошений КВА або в чашки Петрі з одним з поживних середовищ. При цьому поверхню середовища ділять на кілька секторів і відсівають кожну колонію на окремий сектор ретельно втираючи її в середовище круговими рухами; 5 при наявності значної кількості однотипних підозрілих колоній крім виділення чистої культури з колоній що залишилися роблять мазки визначають морфологічні та тинкторіальні властивості культури при фарбуванні за Грамом. Одночасно виявляють і відсутність спонтанної аглютинації. Мікроби роду Bordetella мають вигляд мономорфних дрібних овоїдних паличок кокобактерій рівномірно розташованих в мазку грамнегативні. Іноді В.parapertussis особливо з середовища Борде-Жангу можуть мати вигляд подовжених поліморфних паличок. Культуру з колоній що залишилися перевіряють у реакції аглютинації на склі зі специфічними видовими неадсорбованими сироватками розведеними 1:10 і по можливості з адсорбованими монорецепторними сироватками до аглютиногенів факторів 1 і 14. Якщо кількість підозрілих колоній значна то можна поставити пробу Закса для визначення наявності ферменту уреази; 6 на підставі вивчення характеру колоній і морфології клітин у мазках пофарбованих за Грамом позитивної реакції аглютинації з видовими неадсорбованими сироватками до факторів 1 і 14 на третю добу можна видати попередню відповідь; 7 при відсутності росту підозрілих колоній на середовищі чашки Петрі знову поміщають у термостат на 24-48 годин і переглядають повторно у відповідний термін. 6.4. П’ятий-шостий день дослідження 4-5 доба 96-120 годин : 1 переглядають посіви зроблені для виділення чистої культури і відзначають зміну кольору середовища: В.parapertussis дифузно забарвлюють середовище вирощування КВА у бурувато-коричневий колір; 2 на предметному склі в краплі фізіологічного розчину готують мазок і забарвлюють його за Грамом визначаючи морфологію виділеної культури її чистоту а також відсутність спонтанної аглютинації; 3 серологічні властивості перевіряють у реакції аглютинації на склі зі специфічними неадсорбованими сироватками до В. pertussis і В. parapertussis розведеними 1:10 а також з адсорбованими монорецепторними сироватками до факторів 1 і 14. Серовар В. pertussis визначають аглютинацією з монорецепторними сироватками до факторів 1 2 3; 4 для перевірки біохімічних властивостей роблять посіви чистої культури на агарове середовище з тирозином визначення наявності тирозинази виявляють наявність уреази за методом Закса або посівом на бульйон Хоттінгера. При підозрі на виділення чистої культури В.bronchiseptica визначають утилізацію цитрату на середовищі Сімонса і рухливість шляхом посіву у напіврідкий агар 0 3% агар-агару . В.pertussis біохімічно інертна: не росте на м’ясопептонному агарі не змінює колір агарового середовища з тирозином не має ферменту уреази проба Заксе - негативна не утилізує цитрат. В.parapertussis дає ріст на простих поживних середовищах змінює колір середовища з тирозином на коричневий має фермент уреазу проба Заксе позитивна . В.bronchiseptica відрізняється швидким ростом на простих поживних середовищах рухливістю не змінює кольору середовища з тирозином здатна утилізувати цитрат на середовищі Сімонса Додаток №1 ; 5 на підставі вивчення чистої культури: морфології колоній і клітин реакції аглютинації з видовими неадсорбованими сироватками й адсорбованими монорецепторними сироватками до факторів 1 і 14 результатів проби на уреазу зміни кольору середовища з тирозином утилізації цитратів може бути видана остаточна позитивна відповідь; 6 якщо протягом п’яти діб 6 день дослідження на середовищі вирощування не виявлені колонії підозрілі для бактерій роду Bordetella дослідження припиняють і видають остаточну негативну відповідь. 7. Вивчення ферментативної активності 7.1.Виявлення уреазної активності. Метод базується на здатності мікроорганізмів які мають фермент уреазу розщеплювати сечовину до аміаку за рахунок якого відбуваються зміна рН середовища що виявляють за зміною кольору індикатора. Суміш реактивів А 1 частина і Б 19 частин розливають по 0 1 - 0 2 см3 у стерильні аглютинаційні пробірки із пробками і вносять 1-2 петлі досліджуваної культури. Одночасно ставлять контроль реактиву без внесення культури. Пробірки поміщають у термостат при 35-37°С на 30 хв. Облік результатів проводять після інкубування а при відсутності зміни кольору суміші - пробірки залишають при кімнатній температурі і результат враховують наступного дня. При наявності у мікроорганізму ферменту уреази відбувається розщеплення сечовини до аміаку що приводить до залуження середовища зміни його кольору з жовтого в малиновий. 7.2.Визначення здатності утилізувати цитрат як єдине джерело вуглецю. Досліджувану культуру засівають на скошене середовище Сімонса і інкубують при 37±1 °С одну добу. Цитрат-асимілюючі бактерії добре ростуть залужують середовище і викликають забарвлення його в синій колір. Мікроби що не асимілюють цитрати на цьому середовищі не ростуть і не змінюють його кольору. 7.3.Визначення пігментоутворення. Засівають культуру що виділена на простий поживний агар з 0 1% тирозином і інкубують протягом доби при 37±1 °С. При розщепленні тирозину середовище забарвлюється в жовто-коричневий колір. 8. Дослідження атипових штамів бордетел 8.1. У вогнищах кашлюкової інфекції можуть бути виявлені атипові штами збудника кашлюку. Вони відрізняються від типових культур морфологічними властивостями і характером колоній. На середовищі вирощування КВА такі штами утворять через 72 години росту іноді більш великі колонії з плоскою поверхнею з центром що западає іноді не мають світлового конусу білуватого бурого жовтуватого або ледь рожевого чи зеленуватого кольору мають маслянисту консистенцію. При відборі таких колоній на вторинні чашки вони можуть давати зливний ріст слизистого характеру з зеленувато-жовтим пігментом. Частина таких штамів виділяється уповільненим ростом і зниженою життєздатністю: мікроби виростають на первинних чашках через 6-7 і більше діб а при наступних відсівах таких колоній вони іноді не виростають. Морфологія клітин у мазках з колоній може відрізнятися від типової: зустрічаються більш довгі палички роздуті овоїдні палички форми у вигляді стрептобацил. Чиста культура виділена з таких колоній має типові для кашлюкового мікроба властивості. Біохімічні і серологічні властивості атипових штамів характерні для кашлюкового мікроба: вони не розкладають сечовину і тирозин позитивні в реакції аглютинації на склі зі специфічними видовими неадсорбованими сироватками типується моноспецифічними рецепторними сироватками до факторів 1 2 3. 8.2. У ряді випадків із ротоглотки дітей і дорослих можуть бути виділені грамнегативні бактерії подібні до кашлюкового мікроба за морфологією видом колоній і серологічними властивостями. У чистій культурі вони являють собою грамнегативні овоїдні палички утворюють подібні з типовими кашлюковими мікробами колонії аглютинують на склі з видовими неадсорбованими кашлюковими і паракашлюковими сироватками дають позитивну реакцію аглютинації в пробірках у розведеннях до 1:320 і не аглютинують з монорецепторними сироватками. Спеціальні дослідження в реакції імуноелектрофорезу показали що вони не мають антигенів характерних для кашлюкового і паракашлюкового мікробів і добре ростуть на простих поживних середовищах. Враховуючи наявність атипових штамів бордетел рекомендується при виділенні чистої культури відсівати з поживного середовища максимальну кількість колоній усіх видів у середньому не менше п’яти. 9. Терміни видачі і формулювання відповідей 9.1. Відповідь при дослідженні на кашлюк та паракашлюк видається як правило на 3-5 добу. Попередня позитивна відповідь може бути видана на третю добу з формулюванням: “Виявлені мікроби підозрілі на бактерії роду Bordetella дослідження продовжується”. Остаточна позитивна відповідь може бути видана на 5-6 добу і формулюється так: “Виявлені В. pertussis В. parapertussis B.bronchiseptica ”. Негативна відповідь видається на 5 добу при відсутності підозрілих колоній на бактерії роду Bordetella і формулюється так: “Бактерії роду Bordetella не виявлені”. 9.2. У випадку уповільненого росту мікробів або виділення нетипової культури попередня й остаточна відповіді можуть бути видані пізніше 6-7 доба . 10. Серологічна діагностика 10.1. Серологічна діагностика кашлюку та паракашлюку полягає у виявленні в досліджуваній сироватці специфічних антитіл. З цією метою використовують РА РНГА ІФА. Дослідження проводять на 2-3 тижні захворювання коли в крові хворих з’являються специфічні антитіла. У зв’язку із широкою імунізацією проти кашлюку результати серологічних реакцій можуть мати діагностичне значення тільки при вивченні їх у динаміці досліджуючи парні сироватки хворого не менше ніж 2-3 рази з інтервалом 1-2 тижні. Серологічні реакції слід ставити паралельно з кашлюковим і паракашлюковим діагностикумами. 10.2. Кров для дослідження можна взяти з пальця 0 8-1 0 см3 з дотриманням звичайних правил асептики. Кров збирають приклавши до місця уколу відтягнутий не занадто тонко кінець короткої пастерівської піпетки. Кров з піпетки видувають у центрифужну пробірку яку потім поміщають на 10-15 хв. у термостат. Згусток що утворився відокремлюють від стінки пробірки і поміщають в холодильник до відділення сироватки. Сироватку відсмоктують пастерівською піпеткою розводять фізіологічним розчином 1:5 або 1:10 щільно закривають пробкою і зберігають у холодильнику. 10.3. Коли вдається взяти кров у невеликій кількості її набирають у кількості 0 2 або 0 5 см3 і вносять у пробірку куди попередньо наливають 1 8 см3 стерильного фізіологічного розчину. Після центрифугування суміш сироватки з фізіологічним розчином розведення сироватки відповідно 1:20 або 1:10 переносять у стерильну пробірку і з неї роблять наступні 2-кратні розведення 1:20 1:40 і т.д. . Класичним методом серологічної діагностики кашлюка найбільш доступний в умовах практичної лабораторії є реакція аглютинації яка дозволяє виявити антитіла індуковані аглютиногенами збудника. 10.4. Реакція аглютинації Із досліджуваної сироватки готують 9-10 послідовних розведень: 1:5 1:10 і т.п. до 1:1280 або 1:2560. Обов’язково ставлять контролі діагностикуму сироватки та фізрозчину. Реакцію аглютинації ставлять у такий спосіб: до 0 25 см3 відповідного розведення сироватки додають 0 25 см3 діагностикуму. Пробірки поміщають у термостат при 37±1 °С на 2 години а потім залишають при кімнатній температурі 20±2 °С. Результати враховують наступного дня за допомогою аглютиноскопа. В першу чергу проводять оцінку контролів. Діагностикум з розчином натрію хлористого КД повинний мати рівномірну каламуть без пластівців. Сироватка з розчином натрію хлористого КС та розчин натрію хлористого КФЗР повинні бути прозорими. Якщо контролі відповідають вимогам враховують результати реакції аглютинації. Кінцевим титром вважають розведення при якому відзначається чітка аглютинація на два хрести ++ однак реакція враховується як позитивна лише при наявності в попередніх пробірках чіткої аглютинації на чотири або три хрести ++++ або +++ . Сироватка + фіз.р-н 1:5 або 1:10 зберігають у холодильнику 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 КД КС КФЗР 0 25см3 відповідного розведення 0 25см3 діагностикуму на 2 год. при 37°С потім при кімнатній температурі до наступного дня аглютиноскоп діагностичний титр ++ якщо попередні +++ . Діагностичним титром реакції аглютинації у не щеплених і тих що не хворіли дітей вважають розведення 1:80. У імунізованих дітей і дорослих позитивні результати реакції враховують тільки при дослідженні парних сироваток крові узятих з інтервалом 1-2 тижні при наростанні титру не менше ніж у 4 рази. 11. Перспективні методи лабораторної діагностики* Перспективним є впровадження сучасних експрес-методів: 1 імунофлюоресцентний - визначення антигенів збудника в слизі задньої стінки глотки; 2 латексна мікроаглютинація - визначення антигенів кашлюкової палички в слизі задньої стінки глотки. 3 імуноферментний аналіз ІФА за допомогою якого визначають антитіла класів імуноглобулінів М ІgМ і G ІgG у різні терміни захворювання. За допомогою методу ІФА можна визначати також антигени В. pertussis у слизі ротоглотки. *Застосовуються при наявності відповідних імунобіологічних препаратів 4 ПЛР – діагностика в ході якої виявляють наявність ДНК кашлюкового мікроба у мокроті. 12.Форми первинної облікової звітності Реєстрація матеріалу що надходить на дослідження відображається у журналі за ф.252/0 “Журнал реєстрації мікробіологічних і паразитологічних досліджень” хід аналізу результати досліджень повинні бути відображені в журналі за ф. 253/0 „Робочий журнал мікробіологічних досліджень”. Реєстрацію матеріалу і результатів серологічних досліджень проводять в журналі за ф.259/0 “Журнал реєстрації серологічних досліджень”. 13. Збереження культур бордетел 13.1. Способи тривалого збереження без пересівання культур бордетел Для збереження культур бордетел готують наступні консервуючи суміші: 1 80% розчин гліцерину в буферному фізіологічному розчині простерилізованому в автоклаві при 1 3 атм. протягом 30 хвилин. Буферний фізіологічний розчин готують розчиняючи в 8дм3 дистильованої води NaCI - 69 2 г Na2HPO4 - 15 36 г КН2P04 - 3 52 г і автоклавують при 0 5 атм. протягом 30 хв. Розчин повинен мати рН - 7 2. 2 сахарозо-желатинове середовище 10% розчин сахарози і 1% розчин желатини . Для приготування сахарозо-желатинового середовища попередньо готують 2 розчини: на водяній бані при температурі +55°С необхідно розчинити в 300см3 дистильованої води 10 г желатини 1 розчин і в 300 см3 дистильованої води - 100 г сахарози 2 розчин . Потім обидва розчини з’єднують доповнюють до 1дм3 дистильованою водою; встановлюють рН 7 0 розчином бікарбонату натрію і розливають у флакони. Флакони з готовим розчином стерилізують текучою парою в автоклаві 3 дні по 1 годині. У стерильних аглютинаційних пробірках змішують по 2 см3 стерильного 80% розчину гліцерину в буферному фізіологічному розчині і сахарозо-желатинового середовища поміщають на дно пробірки 3-4 петлі 3-х добової культури кашлюкового мікроба закривають ватно-марлевою пробкою і зберігають у морозильній камері при температурі -30°С до 1 року. При висівах беруть петлею частину матеріалу з дна пробірки і висівають на середовище КВА з 3-4% крові розтираючи шпателем. 13. 2. Збереження культур бордетел в напіврідкому КВА із кров'ю і без крові Приготування напіврідкого агару КВА. Казеїново-вугільний агар готується за прописом але агар-агару додають 1г на 1 дм3 середовища 0 1% розливають у пробірки у кількості до 8см3 і стерилізують при 0 5 атм. 20хв. У напіврідкий КВА можна додати стерильну дефібриновану кров великої рогатої худоби або коня з розрахунку 0 5-1 см3 на 8см3 середовища. Культуру бордетели засівають у середовище витримують у термостаті 3-4 дні а потім без пересівання зберігають у холодильнику або при кімнатній температурі протягом 1міс. При збереженні культури збудника кашлюку на щільному середовищі КВА її пересівають через 10-14днів. 14 Вимоги безпеки Мікробіологічні дослідження з метою діагностики та профілактики кашлюкової інфекції проводять з дотриманням вимог біологічної безпеки відповідно до ДСП 9.9.5. -080 –2002 “Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях відділах відділеннях мікробіологічного профілю” Додаток №1 Характеристика мікробів роду Bordetella Тест Вид мікроба В. pertussis В. parapertussis B. bronchiseptica Терміни появи колоній у годинах 48-72 24-48 18-24 Розмір колоній у мм 1-2 2-4 2-4 Фарбування за Грамом - - - Рухливість - - + Ріст на простому агарі - + + Зміна кольору поживних середовищ побуріння - + - Оксидаза + - + Розщеплення сечовини - + +* Утилізація цитратів - - + Утворення пігменту з тирозину - + - Відновлення нітратів - - + Наявність глютаміндекарбоксилази - - + Аглютинація видовими специфічними неадсорбованими кашлюковими і паракашлюковими сироватками + + + Аглютинація монорецепторними сироватками до агглютиногенів факторів + - - фактор-1 + - - фактор-14 - + - фактор-12 - - + * -позитивна реакція з’являється через 4 години. Умовні позначення: “-“ - відсутність ознаки; “+”- наявність ознаки. Додаток №2 Схема бактеріологічного дослідження 1.Перша доба. Посів досліджуваного матеріалу на середовища КВА Борде-Жангу і інкубація в термостаті при 35 - 37°С. пеніцилін цефалексин і посудина з водою 35-37°С на 72год. 2. Четверта доба дослідження через 72 години : 1 вивчення характеру колоній на середовищах вирощування з використанням стереоскопічного мікроскопа; 2 відсів колоній для отримання чистої культури мікроба; 3. При наявності великої кількості колоній на середовищі вирощування: 1 приготування мазків забарвлення їх за Грамом мікроскопія; 2 постановка реакції аглютинації на склі зі специфічними неадсорбованими кашлюковими та паракашлюковими сироватками в розведенні 1:10 і специфічними монорецепторними сироватками до аглютиногенів факторів 1 і 14; 3 постановка проби на уреазу. 4. Видача попереднього позитивного результату проведеного дослідження. КВА КВА Борде-Жангу 5. П’ятий-шостий день дослідження через 96-120 годин . Вивчення виділеної чистої культури у випадку наявності в досліджуваному матеріалі паракашлюкового або бронхісептичного мікробів: а вивчення характеру росту чистої культури і зміни кольору поживного середовища; приготування мазків і забарвлення їх за Грамом мікроскопія; б постановка реакції аглютинації на склі з видовими неадсорбованими і монорецепторними сироватками до аглютиногенів факторів 1 14 і 12; в постановка проби на уреазу й облік результатів; посів на середовище МПА з тирозином; при необхідності визначення рухливості шляхом посіву в стовпчик напіврідкого агару; посів на середовище Сімонса. г облік результатів 4-х діб дослідження; д визначення сероваріанту збудника кашлюку; є видача остаточної відповіді: позитивної чи негативної. 6. При відсутності росту підозрілих колоній на третю добу дослідження чашки із середовищем вирощування переглядають на четверту і п’яту добу. Подальший хід дослідження продовжується за схемою: МПА МПА Сімонса н/р 0 3 % агар сечовина з тирозином Додаток №3 Методи приготування поживних середовищ Загальні вимоги до виготовлення поживних середовищ викладені в ГОСТ 10444.1 - 84. З метою підвищення достовірності та якості досліджень перевагу слід віддавати поживним середовищам та діагностичним препаратам промислового виробництва. У випадку відсутності готових комерційних поживних середовищ середовища готуються за пропонованою рецептурою. Згідно сучасних вимог для приготування поживних середовищ замість дистильованої води використовують воду очищену. Дату приготування та результати контролю якості поживних середовищ реєструють в “Журналі приготування та контролю поживних середовищ” Ф№256/0 1. Гідролізат казеїну Для приготування гідролізату казеїну рекомендується використовувати казеїн кислотний технічний першого сорту ГОСТ 1211-41 і харчовий кислотний ТУ 153-54; активоване деревне вугілля освітлююче марки А ГОСТ 4453-48 може бути використане активоване вугілля й іншої марки ; соляну кислоту хімічно чисту з питомою вагою 1 19. Казеїн відмивають 0 2% розчином оцтової кислоти протягом 6-7 днів 25см3 80% оцтової кислоти на 10дм3 води . Перший день розчин змінюють 3 рази а наступні 5-6 днів по 1 разу на день. Потім казеїн промивають очищеною дистильованою водою добре відтискають і висушують при температурі від 60° до 70°С або при кімнатній температурі. Гідролізат казеїну одержують під тиском за допомогою міцної соляної кислоти. Для цього в скляному посуді колба або сулія ємністю 2 дм3 змішують 400 г казеїну 400 см3 соляної кислоти і 200 см3 очищеної дистильованої води. Суміш автоклавують при 127°С протягом 3-4 годин. Після автоклавування гідролізат дворазово розводять очищеною дистильованою водою фільтрують через полотнину або папір. Потім об’єм фільтрату доводять очищеною дистильованою водою до 3 дм3 і освітлюють активованим вугіллям. Для цього додають 50 г вугілля на 1дм3 фільтрату. Суміш кип’ятять протягом 10 хвилин і пропускають через паперовий фільтр. Із вказаної кількості казеїну виходить приблизно 3 дм3 гідролізату що являє собою прозору рідину ледь жовтуватого кольору. Після фільтрації в готовому гідролізаті визначають кількість амінного азоту методом формольного титрування методика кількісного визначення амінного азоту наводиться нижче . Гідролізат можна зберігати при кімнатній температурі при додаванні 0 5% хлороформу протягом декількох місяців. 2. Діалізат дріжджів Свіжі хлібні дріжджі пресовані у кількості 1кг розмішують у 1дм3 очищеної дистильованої води до стану гомогенної маси переливають у целофановий мішок попередньо промитий очищеною дистильованою водою. Мішок зав’язують обмивають під струменем водопровідної води а потім очищеною дистильованою водою і занурюють в емальований посуд каструля бак у яку попередньо налито 1 3 дм3 очищеної дистильованої води. Мішок повинен бути повністю занурений у воду. Діаліз ведуть при температурі 60 - 80°С протягом 6 годин за цей час кількість води в каструлі повинна зменшитися приблизно в 2 рази . Потім рідину з каструлі переливають у стерильну сулію. Для підвищення виходу діалізату можна повторити діаліз цих же дріжджів у такий спосіб: мішок із дріжджами заливають другий раз такою ж кількістю очищеної дистильованої води попередньо нагрітої до 70°С; посудину у якій проводиться діаліз з метою збереження тепла накривають ватником і залишають на ніч. Наступного дня рідину з каструлі змішують з першою порцією додаючи хлороформ 0 5% і зберігають при температурі 5 - 7°С до 3-х місяців. 3. Екстракт дріжджів Свіжі хлібні дріжджі пресовані у кількості 1 кг суспендують у 1дм3 дистильованої води стерилізують текучою парою 100°С протягом 30 хв. потім відстоюють у холодильнику +4°С протягом 3-6 діб. Надосадову рідину декантують обережно зливають розливають у флакони і знову стерилізують при 100°С протягом 30 хвилин. Зберігають дріжджовий екстракт у холодильнику. 4. Казеїново-вугільний агар Для приготування 1дм3 середовища КВА необхідні наступні інгредієнти: 1 казеїновий гідролізат - з розрахунку щоб у готовому середовищі містилося 30-150 мг% амінного азоту розрахунок кількості гідролізату приводиться нижче ; 2 КН2Р04 - 0 5г; 3 MgCl2 - 0 4г або 2 см3 20% розчину; 4 крохмаль розчинний -1 5г; 5 СaСl2 - 0 01 г або 1 см3 1% розчину; 6 FeS04 - 0 01 г або 1 см3 1% розчину; 7 CuS04 -0 005 г або 1 см3 0 5% розчину; 8 цистин або цистеїн - 0 03г чи 2cм3 1 5% розчину; L і LD - форми 9 дріжджовий діалізат або дріжджовий екстракт – 100 см3; 10 агар-агар -22г; 11 вугілля активоване -Зг; Кількість гідролізату казеїну яку беруть для приготування казеїново-вугільного агару не є постійною а змінюється в залежності від вмісту амінного азоту. Кількість гідролізату яку варто взяти для приготування середовища визначають у такий спосіб: якщо наприклад у казеїновому гідролізаті міститься 800 мг% амінного азоту а у виготовленому середовищі повинно міститися його 150 мг% то роблять розрахунок: 1000 см3 * 150 мг% / 800 мг% ==187 см3 гідролізату на 1дм3 середовища. Казеїновий гідролізат і дистильовану воду приблизно 600 см3 змішують в емальованій каструлі відповідної ємкості і нейтралізують 20% їдким натром до рН 7 0 за бромтимоловим синім до зеленого кольору . Потім вносять наважки різних солей за прописом. Крохмаль попередньо розчиняють у невеликій порції гарячої води і вносять у вигляді розчину. Агар-агар промивають під струменем водопровідної води протягом декількох годин або замочують на 1-2 години і вносять у суміш після чого кип’ятять 10 хв. для розплавлення агар-агару. Потім до суміші додають цистин або цистеїн дріжджовий діалізат або дріжджовий екстракт. Встановлюють рН 7 3 і вносять активоване вугілля ретельно перемішуючи. Середовище розливають у флакони або пробірки. Стерилізують при 110°С протягом 20хв. Середовище у флаконах після стерилізації охолоджують до 45-50°С ретельно перемішують для рівномірного розподілу вугілля і розливають у чашки а середовище в пробірках після охолодження і перемішування скошують. Середовище що залишилося про запас у флаконах матрацах у міру необхідності розтоплюють на водяній бані або апараті Коха текучою парою до повного розплавлення агару. Зайве прогрівання середовища не рекомендується. Готове середовище повинне мати чорний колір конденсаційна вода не повинна містити часток вугілля. Середовище розлите в чашки Петрі зберігається в холодильнику протягом тижня. Для поліпшення якості поживного середовища одночасно з цистіном можна додати 0 03 г проліну або глютаміну на 1 дм3 середовища. 5. Середовище із сухого казеїново-вугільного агару КВА У 100 см3 очищеної дистильованої води ретельно розмішують 4 5-5 0 г порошку доводять до кипіння автоклавують 30 хв. при 110°С. Середовище перемішують і розливають у чашки Петрі або пробірки. Повторне розтоплювання середовища не рекомендується. Для поліпшення якості на 100 см3 стерильного охолодженого КВА додають 3-5 см3 стерильної дефібринованої крові барана коня великої рогатої худоби кролика людини. Середовище ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі або пробірки. Замість крові для поліпшення росту можна додати до автоклавування середовища 0 5% активованого вугілля марки «А» або іншої марки одночасно з дріжджовим діалізатом або екстрактом 50см3 на 1дм3 середовища попередньо нейтралізованим за бромтимоловим синім до зеленого кольору до рН 7 0. 6. Картопляно-гліцериновий агар середовище Борде-Жангу розрахунок на 4дм3 середовища Картоплю ретельно миють щіткою з милом обтирають спиртом і знімають ножем поверхневий шар ретельно вирізуючи всі бруньки. Промивають дистильованою водою нарізають на шматки і зважують необхідну кількість у чистий посуд. Картоплю в кількості 500 г заливають 1дм3 дистильованої води варять до неповної готовності додають 4% гліцерину і варять до повної готовності. Рідину що залишилася фільтрують через 6 шарів марлі попередньо промитої і висушеної. До картоплі що залишилася в каструлі додають невелику кількість гарячої дистильованої води струшують дають недовго відстоятися і фільтрують через той же фільтр після чого доводять об’єм рідини до первісного 1дм3 додаючи гарячу воду дистильовану через той же фільтр. Картопляний відвар можна приготувати про запас стерилізуючи при 120°С протягом 15хв. До 3 дм3 дистильованої води додають 0 75% хімічно чистої NaCl з розрахунку на 3 дм3 і 4% агар-агар з розрахунку на всю кількість середовища . Суміш поміщають в автоклав де агар-агар розплавляється текучою парою протягом години. Після відстоювання у виключеному автоклаві агар фільтрують через один шар марлі не виливаючи осаду. Сольовий агар 3 частини і картопляний відвар 1 частина змішують у гарячому вигляді розливають у флакони й однократно стерилізують при 120°С протягом 30 хв. Реакцію середовища не перевіряють. Перед уживанням до розтопленого й охолодженого до 45°С картопляно-гліцеринового агару додають стерильну дефібриновану кров у кількості 20-25% цитратна і консервована кров непридатна . 7. Молочно-кров'яний агар До 1дм3 водопровідної води додають 40-45 г агару 10 г хлориду натрію і розтоплюють в автоклаві. Потім фільтрують через кілька шарів марлі. До гарячого агару додають рівну кількість знежиреного молока підігрітого до температури 65 - 70°С перемішують і витримують в апараті Коха при текучій парі протягом 30-40хв. після чого фільтрують також в апараті Коха через кілька шарів марлі дають відстоятися й обережно декантують верхній прозорий шар. Після цього середовище розливають у пляшки і стерилізують в автоклаві при 0 5 атм. протягом 40 хв. Перед уживанням до розплавленого й охолодженого до 44°С агару додають дефібриновану кров людини коня кролика або барана в кількості 20-25%. 8. Поживний агар з тирозином До100см3 дистильованої води додають 3 5г сухого поживного агару і 0 1 г тирозину розплавляють над полум’ям пальника розливають у пробірки і стерилізують при 0 5 атм. 20-30 хвилин. 9.Середовище Сімонса Для приготування середовища Сімонса беруть: 1 дистильована вода - 1дм3; 2 NH4 2HP04 -1 5г; 3 КН2Р04 -1 0 г; 4 Mg04 х 7Н20 - 0 2г; 5 Na-цитрат -3 0г; 6 Агар-агар - 20 0г. У половині кількості дистильованої води розчиняють фосфорнокислий амоній фосфорнокислий калій і сірчанокислий магній. В іншій частині води розплавляють агар. З’єднують обидві частини попередньо зливши з осаду. Додають лимоннокислий натрій нейтральний встановлюють рН 7 1-7 2. Додають індикатор - 1 6% розчин бромтимолового синього - 9 4см3. Стерилізують при 0 5 атм. 30 хвилин. 10. Бульйон Хоттінгера із сечовиною До 100 см3 бульйону Хоттінгера рН 7 0 додають 1 г сечовини і 0 2см3 1 6% спиртового розчину крезолового червоного стерилізують текучою парою при 100°С протягом 15 хв. Посів роблять у 1см3 середовища петлею витримують 24 години при 35-37°С. 11.Реактиви для визначення уреази метод Закса Готують 2 реактиви. Реактив А: 2г сечовини 2 см3 96° етилового спирту 4см3 дистильованої води. Реактив В: 1 см3 0 2% спиртового розчину фенол-рота 0 1 г однозаміщеного фосфату калію КН2РО4 0 1 г двозаміщеного фосфату калію К2НР04 100 см3 дистильованої води 0 5г хлористого натру. Реактив А не стерилізують і зберігають при температурі 4 - 10°С реактив В стерилізують в автоклаві текучою парою. Перед уживанням змішують 1 частину реактиву А та 19 частин реактиву В. 12.Розчин для змочування тампонів У конічній колбі змішують 90-95 см3 попередньо приготовленого 1/15 М розчину Na2HPO4 11 876 г на 1дм3 дистильованої води і 5-10см3 розчину КН2Р04 9 078 г на 1дм3 дистильованої води ; до цієї суміші додають 0 5 г агар-агару стерилізують при 1 атм. 20 хв. Потім у гарячу суміш додають 0 2 г активованого вугілля наважку вугілля стерилізують окремо . Суміш готують про запас і зберігають у холодильнику до 2-х місяців. 13. Приготування і стерилізація тампонів 13.1.Сухі ватні тампони: на один кінець металевого дроту що легко згинається щільно намотують шар гігроскопічної вати. Довжина намотки повинна бути - 4-5 см щоб уникнути аспірації вати . Кінець дроту з намотаною ватою 1-2см згинають під тупим кутом 110-1200. Інший кінець дроту монтують у коркову або ватну пробку. Виготовлений тампон поміщають у пробірку і стерилізують в автоклаві при 112±1 °С протягом 30 хв. або в сушильній шафі при температурі 140-150°С протягом години. 13.2.Зволожені тампони: готують з дроту що не іржавіє і легко згинається краще алюмінієвого . Намотування вати згинання і стерилізацію проводять так як вказано для сухих тампонів. Стерильні тампони перед уживанням змочують у суміші див. п.12 шляхом дворазового занурення в пробірку з рідиною. Після змочування тампона його поміщають у пробірку а потім використовують для взяття матеріалу. Зберігати 3 дні в умовах холодильника. 14. Порядок використання антибіотиків Для пригнічення сторонньої мікрофлори при посіві досліджуваного матеріалу використовують пеніцилін або цефалексин . Їх застосовують як при обробці поверхні поживного середовища розлитого в чашки Петрі так і шляхом внесення антибіотика в середовище. Для обробки поверхні середовища використовують антибіотик з розрахунку 7 5 МО наносячи його на поверхню середовища шпателем або вносячи його в розтоплений і охолоджений КВА з розрахунку 25-50 МО на 100см3 середовища. Пеніцилін розводять безпосередньо перед взяттям матеріалу. Для цього у флакон з антибіотиком додають стерильний фізіологічний розчин для одержання основного розведення пеніциліну. При вмісті у флаконі 500.000 МО в нього додають 1см3 фізіологічного розчину а при вмісті 1млн MО – 2 см3. Отримане основне розведення антибіотика у флаконі можна зберігати в умовах холодильника при +4°С не більше тижня. Для одержання необхідних для роботи концентрацій антибіотика 0 1см3 основного розведення з флакона розчиняють у 9 9 см3 стерильного фізіологічного розчину. 1см3 такого розчину містить 5 000 МО на 1см3. Далі роблять розведення до одержання 75 МО в 1см3 фізіологічного розчину. Схема розведення пеніциліну: 1 пробірка - фізіологічний розчин 9 9 + 0 1см3 основного розведення антибіотика = у 1см3 5 000 МО; 2 пробірка - фізіологічний розчин 8 5+ 1 5розчину з першої пробірки антибіотика = у 1см3 750 МО; 3 пробірка - фізіологічний розчин 4 5+0 5розчину з другої пробірки антибіотика = у 1см3 75 МО. З третьої пробірки наносять 0 1см3 7 5 МО на поверхню поживного середовища у кожній чашці ретельно втираючи шпателем. Розчин із третьої пробірки можна використовувати для внесення його усередину середовища. Для цього 4см3 300 МО антибіотика додають на 1дм3 середовища з розрахунку 30 МО на 100 см3 середовища . Це ж розведення можна використовувати для додавання до змочуючих рідин з розрахунку 0 1 см3 на 10-12 см3 рідини. Робоче розведення антибіотика в останній пробірці використовують тільки в день приготування. Додаток №4 Контроль якості поживних середовищ 1.Методика кількісного визначення азоту Принцип методу оснований на блокуванні формальдегідом при рН 7 0 вільних аміногруп і титруванні лугом еквівалентної кількості карбоксильних груп. Початок і кінець титрування визначають потенціометрично. Реактиви: їдкий натр 0 1N розчин; соляна кислота 0 1N розчин; формалін 40% розчин формальдегіду . Перед кожним визначенням рН формаліну доводять до 7 0. Хід визначення. Для аналізу використовують певний об’єм “B” рідкого зразка або розчину сухого зразка з вмістом амінного азоту 1 5-5 мг. “В” дорівнює: 1 для рідких гідролізатів низького ступеня розщеплення 0 1-0 2% амінного азоту – 3 см3; 2 середнього ступеня розщеплення 0 3-0 6% амінного азоту – 1 см3; 3 високого ступеня розщеплення 0 7-1 3% амінного азоту - 0 6 см3; 4 для рідких поживних середовищ 0 08-0 14% амінного азоту – 3 см3; 5 для рідких екстрактів 0 02-0 04% амінного азоту – 10 см3. При аналізі сухих зразків таких як сухі гідролізати сухі поживні середовища сухі екстракти з вмістом амінного азоту 1 5 - 4 0 % “В” дорівнює 10 см3 1% розчину наважка зразка “С” що аналізується складає 100 мг . У склянку місткістю 50 см3 наливають об’єм “В” розчину зразка що аналізується і доводять загальний об’єм дистильованою водою до 20 см3. Електроди потенціометра занурюють у досліджуваний розчин рН якого доводять до 7 0 за допомогою 0 1N розчину NaOH або 0 1N розчину соляної кислоти. Під час визначення електроди повинні залишатися зануреними в розчин. До нейтралізованого розчину додають 2 см3 нейтрального формаліну перемішують і не виймаючи електродів титрують вміст 0 1N розчином їдкого натру до рН 9 1. При титруванні варто використовувати мікробюретку на 5см3. Вміст амінного азоту в досліджуваному зразку в % X обчислюють за формулою: 1 для рідкого зразка: X1 = А * К * 1 4 * 100 / В * 1000 де А - кількість 0 1 N розчину NaOH у 1см3 використане на титрування досліджуваної проби; К - поправка до титру 0 1 N розчину NaOH; 1 4 - кількість амінного азоту в мг еквівалентне 1 см3 0 1 N розчину NaOH; 100 - коефіцієнт перерахунку у відсотки; В - кількість рідкого зразка в см3 взяте на аналіз; 1000 - коефіцієнт перерахунку мг у г.; 2 для сухого зразка: Х2= А*К*1 4*100 /С де С - наважка сухого зразка що аналізується в мг яка міститься в об’ємі “В” що титрують; інші позначення дивися вище. 2. Підготовка культур збудника кашлюку для перевірки якості поживних середовищ В. pertussis висушена з замороженого стану під вакуумом може зберігатися дуже довгий час в ампулі при температурі не вище 10°С. Ампулу з висушеним штамом розкривають стерильно над лотком. Верхній кінець ампули нагрівають на полум’ї пальника і знімають парафін потім шматочком стерильної вати змоченим у стерильній воді обережно торкаються до відтягнутого кінця ампули так щоб утворилась невелика тріщина і також мокрою ватою обводять навколо носика ампули. Після утворення кругової або не повністю кругової тріщини легким ударом пінцета видаляють кінець ампули. Після розкриття ампули в неї асептично вносять 0 2-0 3 см3 стерильного фізіологічного розчину. Після розчинення сухого вмісту ампули його переносять пастерівською піпеткою на чашку з поживним середовищем і 48-72 години вирощують при температурі 35-37°С. У перших пересівах мікроби мають дещо знижену життєздатність. Для відновлення повної життєздатності потрібно 2-3-пасажи на оптимальних поживних середовищах. Рекомендується для роботи користуватися культурою після другого або третього пересівання. Надалі культури В. pertussis зберігають на середовищі Борде-Жангу або КВА з 10% крові пересіваючи 1 раз на 3-4 тижні. Дозволяється користуватися культурою не більше 10-го пасажу. 3.Контроль ростових якостей середовища із сухого казеїново-вугільного агару КВА У зв’язку з досить складним прописом казеїново-вугільного середовища і великою чутливістю його до режиму стерилізації варто періодично перевіряти якість готового середовища. З цією метою необхідно використовувати щойно виділені культури В. pertussis. У стерильних пробірках роблять 8 різних розведень суспензії 2-3-х добової культури. Густина суспензії в 1 пробірці повинна відповідати 5 млрд. мікробних тіл у 1см3 за стандартом мутності. В 2-6 пробірки наливають по 4 5 см3 стерильного фізіологічного розчину у 7-у наливають 2 см3 і в 8-у - 1 см3. Поверхню однієї з двох чашок Петрі з досліджуваним середовищем ділять на 2-4 або 8 секторів у залежності від поживного середовища : 0 5 см3 суспензії з 1 пробірки переносять стерильною піпеткою в 2 пробірку і цією ж піпеткою наносять 0 1 см3 суспензії на сектор 1. Іншою стерильною піпеткою перемішують вміст другої пробірки переносять із неї 0 5 см3 у 3-ю пробірку і 0 1 см3 наносять на сектор 2 і т.д. Для кожного розведення слід вживати окрему стерильну піпетку перемішуючи нею вміст пробірки. У 8-у пробірку переносять із 7-ї 1см3 суспензії також перемішуючи стерильною піпеткою і наносять 0 1 см3 на сектор 8. Чашку Петрі обережно кришкою догори щоб краплі не злилися ставлять у термостат і витримують протягом 3-5 діб. Якщо середовище приготоване правильно то на перших трьох секторах ріст має вигляд суцільних бляшок на секторах 4 5 і 6 виростають близько розташовані колонії а на секторах 7 і 8 - невелика кількість ізольованих колоній. Якщо немає росту на останніх двох секторах то середовищем користуватися не можна. При використанні поживних середовищ з додаванням крові чашки Петрі поділяють на два сектори а при використанні сухих середовищ КВА з додаванням дріжджового екстракту - на 4 сектори. У лабораторіях районних СЕС перевірку якості поживного середовища можна проводити за полегшеним методом. Посів колоній В. pertussis роблять на 1/16 поверхні чашки із середовищем КВА розлитим у чашки Петрі. Усього перевіряють 5-10 колоній. Облік росту культури проводять через 48 годин. У випадку росту культури по всьому сектору - середовище доброї якості при рості на 1/2 сектора - уповільнений ріст В. pertussis; ріст тільки на посівній площі - середовище непридатне. Схема приготування розведень В. pertussis для перевірки якості КВА № пробірок Кількість фіз. р-ну у см3 Об’єм внесеної суспензії у см3 Кількість мікробів у 1 см3 1 1 0 1 0 вихідної суспензії 5.000.000.000. 5х109 2 4 5 0 5 з 1-ї пробірки 500.000.000. 5х108 3 4 5 0 5 з 2-ї пробірки 50.000.000. 5х107 4 4 5 0 5 з 3-ї пробірки 5.000.000. 5х106 5 4 5 0 5 з 4-ї пробірки 500.000. 5х105 6 4 5 0 5 з 5-ї пробірки 50.000. 5х104 7 2 0 0 5 з 6-ї пробірки 10.000. 104 8 1 0 1 0 з 7-ї пробірки 5.000. 5х103 1 1