Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ Н А К А З № 45 від 06.02.2002 м. Київ Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції З метою виконання заходів національної програми боротьби із захворюванням на туберкульоз на 2002 - 2005 роки затвердженої указом Президента України від 20 серпня 2001 року № 643/2001 щодо поліпшення мікробіологічної діагностіки туберкульозу в Україні  НАКАЗУЮ: 1. Затвердити Інструкцію з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції додається . 2. Міністру охорони здоров'я Автономної Республіки Крим начальникам управлінь охорони здоров'я обласних Севастопольської міської державних адміністрацій та головного управління Київської міської державної адміністрації довести зазначену Інструкцію до керівників закладів охорони здоров'я і забезпечити її дотримання. 3. Головному фтизіатру МОЗ України Фещенко Ю.І. та директору Референс-Центру з мікробіологічної діагностики туберкульозу МОЗ України Журило О.О. надати пропозиції щодо проведення семінару з мікробіологічної діагностики туберкульозу для головних спеціалістів управлінь охорони здоров'я з питань лабораторної діагностики та завідуючих лабораторій протитуберкульозних закладів. 4. Наказ МОЗ СРСР від 8 червня 1978 року № 558 "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкульозе" вважати таким що не застосовується на території України. 5. Контроль за виконанням цього наказу покласти на першого заступника Державного секретаря Бобильову О.О. Міністр В.Ф.Москаленко Затверджено наказом МОЗ України 06.02.2002 № 45 ІНСТРУКЦІЯ З БАКТЕРІОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЬОЗНОЇ ІНФЕКЦІЇ * * Складена під керівництвом Головного фтизіатра і пульмонолога України академіка АМН України професора Ю.І.Фещенка співробітниками Інституту фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України д.м.н. О.А.Журило к.м.н. М.Т.Клименко к.м.н. А.І.Барбовою м.н.с. П.С.Трофімовою за участю д.б.н. В.В.Власенка. В умовах широкого застосування різноманітних антимікобактеріальних препаратів змінилася біологія збудника туберкульозу. Зміни стосуються як морфології мікобактерій так і їхньої ферментативної активності і біологічних властивостей. У зв'язку з цим значно ускладнилася мікробіологічна діагностика туберкульозу. З'явилися також деякі додаткові труднощі пов'язані з виділенням у ряді випадків із патологічного матеріалу хворих атипових мікобактерій діагностика яких можлива тільки з застосуванням комплексного дослідження що включає мікробіологічні біохімічні і біологічні методи. Таке комплексне різнобічне дослідження можливе у добре оснащених бактеріологічних лабораторіях із висококваліфікованим персоналом. За останні роки в ряді областей України створені лабораторії що виконують усі види мікробіологічних досліджень. Функцію Центральної референс-лабораторії України з діагностики туберкульозу виконує Референс-Центр МОЗ України розташований на базі Інституту фтизіатрії і пульмонології ім.Ф.Г.Яновського що співпрацює з ВООЗ з питань діагностики туберкульозу. Референс-Центр виконує весь спектр мікробіологічних досліджень з діагностики туберкульозу розроблює апробує й впроваджує нові методи та методики діагностики туберкульозу здійснює спостереження за етиологічною структурою туберкульозної інфекції циркуляцією збудників туберкульозу серед населення з метою зниження захворюваності на туберкульоз шляхом профілактичних і протиепідемічних заходів. Референс-Центр є організаційно-методичним центром що здійснює контроль за якістю всіх досліджень які проводяться в регіональних лабораторіях протитуберкульозних закладів країни і надає їм методичну допомогу. Лабораторії обласних протитуберкульозних диспансерів є лабораторіями III рівня і проводять усі види бактеріологічних досліджень що включають: 1 бактеріоскопію 2 посів патологічного матеріалу на яєчні середовища 3 типування виділених мікобактерій і їх таксономічну ідентифікацію 4 визначення чутливості культур M.tuberculosis МБТ до антимікобактеріальних препаратів 5 біологічну пробу: зараження лабораторних тварин з метою виявлення мікобактерій туберкульозу при наявності віварію . Спектр мікробіологічних досліджень які виконуються з діагностики туберкульозу в міських та районних протитуберкульозних закладах визначається рівнем технічного оснащення бактеріологічних лабораторій в даних закладах. Інші лабораторії проводять бактеріоскопію досліджуваного матеріалу посів його для виділення чистої культури M.tuberculosis лабораторії II рівня . Периферійні лабораторії які виконують лише бактеріоскопію харкотиння є лабораторіями I рівня пункти мікроскопії . ДИНАМІКА БАКТЕРІОЛОГІЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ ХВОРОГО Погіршення епідеміологічної ситуації в країні потребує систематичного перегляду форм і методів профілактики і виявлення туберкульозу серед населення з метою зниження інфікованості захворюваності та зменшення резервуару туберкульозної інфекції. У більшості виявлених хворих при зверненні туберкульоз діагностується несвоєчасно. Виявлення хворих з занедбаними формами туберкульозу знижує ефективність лікування навіть при застосуванні сучасних методів хіміотерапії. Хворі-бактеріовиділювачі які тривалий час невідомі протитуберкульозним диспансерам з причин пізньої діагностики становлять велику епідеміологічну небезпеку для оточуючих особливо дітей. Під час епідемії туберкульозу в країні одним із пріоритетних напрямків в системі протитуберкульозних заходів є підвищення рівня знань лікарів з питань клініки та своєчасної діагностики перш за все заразних форм туберкульозу у хворих які звертаються за медичною допомогою. Стратегічним пріоритетом в системі виявлення туберкульозу за звертанням повинно бути встановлення етиологічного діагнозу на основі клінічного обстеження рентгенологічної діагностики органів грудної клітки та мікроскопії мазка харкотиння на мікобактерії туберкульозу. Мікроскопічному дослідженню мазка харкотиння підлягають хворі: - з наявністю кашлю з харкотинням або без нього більше 3-х тижнів; - з кровохарканням або легеневою кровотечею; - з симптомами запалення бронхо-легеневої системи; - з болями в грудній клітці які пов'язані з диханням або кашлем; - з рентгенологічними змінами в легенях з підозрою на туберкульоз; - особи що контактують з хворими-бактеріовиділювачами які мають симптоми інтоксикаційного або бронхо-плевро-легеневого синдромів. 1. Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу 1.1 Харкотиння Дослідження харкотиння методом мікроскопії мазка необхідно здійснювати у всіх бактеріологічних лабораторіях протитуберкульозних закладів і клініко-діагностичних лабораторіях загальнолікувальної мережі. Хворих у яких виявлені кислотостійкі мікобактерії слід направляти в протитуберкульозний диспансер за місцем проживання для подальшого обстеження підтвердження етиологічного діагнозу туберкульозу лікування та диспансеризації. Для одержання коректного результату важливо правильно організувати збирання харкотиння яке слід проводити без сторонніх людей на відкритому повітрі на території закладу де аерозолі які містять МБТ розсіюються а збудники туберкульозу гинуть під впливом прямого сонячного світла або на веранді або в добре провітрюваній кімнаті яка повинна кварцуватися і добре оброблятися дезинфектантами. Медичний працівник повинен детально пояснити пацієнту як слід відкашляти харкотиння з глибоких нижніх дихальних шляхів. З цією метою слід попросити хворого зробити декілька глибоких вдихів і тільки потім похаркати в посуд з послідуючою перевіркою наявності в посуді харкотиння. Якщо харкотиння немає або хворий не може його відхаркати матеріал для дослідження треба одержати за допомогою подразнюючих інгаляцій. Для запобігання зараження туберкульозом при збиранні харкотиння медичний працівник зобов'язаний бути у шапочці масці клейончатому фартусі та гумових рукавичках та повинен стояти позаду пацієнта. Для виявлення кислотостійких мікобактерій в амбулаторних умовах необхідно досліджувати як мінімум 3 мазки харкотиння методом мікроскопії за Цілем-Нільсеном. Першу пробу харкотиння беруть у хворого в день звертання за медичною допомогою в присутності медперсоналу потім йому дають посуд для збирання ранкового харкотиння збирає самостійно і останню третю пробу збирають в присутності медперсоналу в день здачі другої проби. В стаціонарних умовах доцільно проводити дослідження харкотиння 3 доби підряд в ранкові години вище приведеним методом. Харкотиння збирається в скляні ємкості з широким горлом з кришками а потім передається в лабораторію для дослідження. При зберіганні та доставці харкотиння в лабораторію на дослідження необхідно також додержуватись заходів по запобіганню зараження туберкульозом. Для зберігання та перевозки використовують спеціальні контейнери або металеві бікси. Якщо перший мазок виявився позитивним а хворий не прийшов повторно до лікаря хворого слід терміново розшукати і сповістити в районний протитуберкульозний диспансер а також в заклад санітарно-епідеміологічного нагляду з тим щоб викликати його для подальшого обстеження встановлення діагнозу і направлення на лікування. У хворих що виділяють невелику кількість харкотиння його варто збирати протягом доби за умови що воно буде зберігатися в холодному місці краще в холодильнику а потім разом із ранковою порцією буде доставлене в лабораторію. Якщо у хворого харкотиння виділяється епізодично в невеликій кількості то треба напередодні і ранком дати відхаркувальне або застосувати метод подразнюючої аерозольної інгаляції що підсилює секрецію бронхів і кашель. Якщо хоча б 2 зразки харкотиння з трьох показали позитивний результат при проведенні бактеріоскопії на присутність кислотостійких паличок КСП то пацієнт відноситься до хворих з позитивним мазком КСП+; він своєчасно повинен бути направлений в районний або міський тубдиспансер на госпіталізацію та лікування. Якщо з трьох зразків харкотиння які були досліджені 1 позитивний на КСП КСП+ то пацієнта направляють до фтизіатра на дообстеження й вирішення питання про призначення відповідного лікування. Якщо всі 3 мазки дали негативний результат але симптоми хвороби стійкі й на рентгенограмі є відповідні зміни які характерні для туберкульозного процесу то хворому ставлять діагноз туберкульозу легень з негативним мазком КСП- й прописується відповідний лікувальний режим. Якщо в 3-х мазках харкотиння при бактеріоскопії КСП не виявлено але є симптоми захворювання без відповідних змін на рентгенограмі то хворий лікується по схемі лікування гострих пневмоній. Якщо через 2 тижні захворювання на тлі неспецифічної антибактеріальної терапії не помітно позитивних клініко-рентгенологічних змін то у хворого повторно збирають 3 проби харкотиння 3 доби підряд для дослідження мазків методом мікроскопії за Цілем-Нільсеном. При виявленні кислотостійких мікобактерій хоч в одному з мазків харкотиння хворий направляється в спеціалізований стаціонар для дообстеження та лікування. В лабораторії позитивні мазки на КСП зберігаються 6 місяців й при необхідності можуть бути консультовані або передані для ідентифікації в протитуберкульозний диспансер. Окрім мікроскопії мазка харкотиння пофарбованого за Цілем-Нільсеном можливе дослідження матеріалу методом люмінесцентної мікроскопії. Подразнюючі інгаляції. Якщо у хворого харкотиння виділяється у невеликій кількості то напередодні і ранком йому дають відхаркувальні препарати чи застосовується подразнювальна аерозольна інгаляція портативним інгалятором. Як інгаляційна суміш рекомендується 15 0 % розчин хлориду натрію в 2 0 - 3 0 % розчині харчової соди. Склад гіпертонічного розчину та його приготування: беруть 1 0 літр дистильованої води добавляють 150 0 г кухонної солі 20 0-30 0 г харчової соди стерилізують і зберігають до 30 діб. Для провокації харкотиння необхідно інгалювання від 30 0 мл до 60 0 мл суміші підігрітої до 42 - 45 град. Цельсію і вдихати її не менше 10 - 15 хвилин. У зв'язку з тим що інгаляційний розчин викликає посилену салівацію ще до появи кашлю з харкотинням хворий повинен видалити слину в приготовлений лаборантом посуд із хлораміном і тільки після цього зібрати харкотиння для мікробіологічного дослідження. Гіперсекреція бронхіального вмісту у більшості хворих спостерігається ще протягом доби після інгаляції гіпертонічного розчину що повинно бути використане з метою виявлення мікобактерій. Через що хворому рекомендується зібрати харкотиння для повторного дослідження протягом доби після інгаляції. Консервування харкотиння. При неможливості доставки в мікробіологічну лабораторію харкотиння зібраного для мікробіологічної діагностики туберкульозу протягом 2 - 8 годин після збору його необхідно консервувати одним з існуючих консервантів 10 0 % водний розчин трьохзаміщеного фосфорнокислого натрію 5 0 - 10 0 % розчин гліцерину 10 0 % розчин натрію хлориду 2 0 - 3 0 % розчин борної кислоти шляхом заливання зібраного харкотиння консервантом. Останній консервант найбільш зручний в умовах спекотного клімату. Харкотиння зібране в скляну плювальницю заливають консервантом у співвідношенні 1:1 герметично закривають кришкою встановлюють у дерев'яний ящик із гніздами і пересилають разом із направленням в якому вказане прізвище хворого й адреса у бактеріологічну лабораторію. 1.2 Промивні води бронхів Правила відбору і доставки промивних вод бронхів. При відсутності у хворих харкотиння досліджують промивні води бронхів. Промивні води бронхів є матеріалом з якого значно частіше ніж із промивних вод шлунка висіваються мікобактерії туберкульозу при легеневих процесах. Проте промивання бронхів проводиться лікарем-отоларингологом тому ця процедура доступна тільки в тих лікувальних закладах де є такий фахівець. Промивні води бронхів збирають в стерильний посуд що закривається і відразу ж доставляють в мікробіологічну лабораторію Диагностический бронхоальвеолярный лаваж: Методические рекомендации / А.Г.Хоменко В.П.Филиппов К.М.Лебедев и соавт. - М. 1986.- 20 с . Діагностичний бронхоальвеолярний лаваж БАЛ - безпечний метод що забезпечує прижиттєве дослідження не респіраторних функцій легень. Дослідження бронхоальвеолярного змиву БАЗ істотно підвищує ефективність мікробіологічної діагностики туберкульозу. Крім того метод дозволяє встановити визначені тенденції в зміні життєздатності клітин легень їх функціональної активності і порушення співвідношень між окремими елементами при різних патологічних процесах. Інформативність БАЗ може бути прирівняна до біопсійних маніпуляцій і БАЛ необхідно вважати діагностичною процедурою. Хворому декілька разів підчас вдиху вводять шприцем у трахею 5 0-7 0 мл стерильного ізотонічного розчину що викликає кашльовий рефлекс. При цьому разом з ізотонічним розчином відкашлюється секрет із глибоких відділів бронхіального дерева. У хворих із вираженим рвотним рефлексом вказану процедуру виконують після попередньої анестезії надгортанника гортані і задньої стінки глотки. Більш доцільно проводити бактеріологічне дослідження відділку бронхів отриманого на наступний день або через день після проведення бронхоскопії коли у хворого з'являється самостійний продуктивний кашель з глибинних відділів бронхіального дерева. 1.3 Промивні води шлунка Іншим методом одержання діагностичного матеріалу від хворих що не виділяють харкотиння є промивання шлунка. Найбільш широко цей метод застосовується в клініці дитячого туберкульозу. M.tuberculosis потрапляють у шлунок при заковтуванні невеликих кількостей харкотиння яке не відхаркується хворими. Промивні води шлунка беруть натщесерце. Останній прийом їжі хворим повинен бути не менше ніж за 12 годин до взяття промивних вод шлунка. Для одержання промивних вод шлунка хворому дають випити склянку 200 0 мл дистильованої води тому що у водопровідній воді можуть міститися кислотостійкі сапрофіти. Після цього вводять шлунковий зонд і збирають вміст шлунка в стерильну склянку. Матеріал доставляють у лабораторію негайно. 1.4 Сеча Для дослідження сечі використовують ранкову порцію отриману після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Отриману сечу центрифугують. Якщо в осаді сечі патологічних елементів нема кислотостійких паличок то для дослідження на туберкульоз використовують добову порцію сечі повторюючи дослідження 2-3 доби підряд. 1.5 Пунктати з закритих порожнин спинномозкова рідина ексудати і трансудати з плевральної і черевної порожнин Беруть стерильним шприцем у стерильний посуд і відразу доставляють у лабораторію. У стерильному посуді також негайно доставляють у бактеріологічну лабораторію тканину отриману шляхом біопсії або під час операції. 1.6 Гній із свищів виділення ран менструальна кров і виділення з відкритих порожнин Беруть стерильним шприцем або стерильним ватним тампоном у стерильний посуд і доставляють у лабораторію негайно. 2 Методи виявлення мікобактерій туберкульозу 2.1 Деякі біологічні особливості роду Mycobacterium 21 group Berge'ss Manual Determinative Bacteriology Ninth Edition Мікробіологічні дослідження є одним з найбільш важливих діагностичних тестів при захворюваннях органів дихання що сприяють своєчасній діагностиці збудника інфекційного процесу визначають особливості клінічної симптоматики дозволяють орієнтувати лікаря на ймовірний діагноз і перебіг хвороби диктують вибір препарату для проведення адекватної антибактеріальної хіміотерапії. До складу роду Micobacterium сімейства Micobacteriaceae включені кислото- і спиртостійкі ознака особливо виражена у патогенних видів аеробні нерухомі грампозитивні прямі чи вигнуті паличкоподібні бактерії. Іноді вони утворюють нитковидні чи міцеліальні структури які фрагментуються при легкому механічному впливі на палички чи кокоподібні елементи. Для них характерним є високий вміст ліпідів і восків до 60 0 % у клітинних стінках утворених пептидогликано-арабіногалактановим комплексом; деякі види утворюють каратиноїдні пігменти що не дифундують. Каталазо - і арилсульфатазопозитивні резистентні до дії лізоциму. Ростуть повільно чи дуже повільно сапрофітні види значно швидше . Мікобактерії широко поширені в навколишньому середовищі - воді їрунті у рослин і тварин. Незважаючи на те що в даний час ідентифіковано близько 50 видів рід нараховує близько 200 видів; типовий вид - Mycobacterium tuberculosis. За ознакою патогенності виділяють власне патогенні що спричиняють конкретні захворювання і атипові мікобактерії серед яких є умовно-патогенні і сапрофітні. Для систематики атипових мікобактерій запропоновані різні класифікації засновані на генетичній спорідненості з M. tuberculosis чи спорідненості з сапрофітними видами; серед запропонованих варіантів найбільше поширення знайшла класифікація Раньона 1959 в основу якої покладені дві властивості - колір колоній і швидкість росту. Відповідно вона виділяє 4 групи атипових мікроорганізмів. У лабораторній практиці основними методами індикації й ідентифікації різних мікобактерій є бактеріоскопічний метод дослідження пряма мікроскопія мікроскопія після збагачення люмінесцентна мікроскопія фазовоконтрастна мікроскопія культуральний метод швидкість росту форми колоній і мікроколоній здатність до утворення пігменту ріст при різних температурах здатність до росту на МПА толерантність до NaCl і деякі біохімічні особливості що представлені нижче і біологічний метод. Мікроскопія і бактеріологічний метод проводяться одночасно. M.tuberculosis - тонкі прямі чи злегка вигнуті палички розмірами 1 0 - 10 0 х 0 2-0 6 мкм зі злегка закругленими кінцями у цитоплазмі містять зернисті утворення . Морфологія істотно варіює в залежності від віку культури й умов культивування - в молодих культурах палички довші а в старих схильні до простого розгалуження. Іноді утворюють коковидні структури і L-форми що зберігають патогенність а також фільтрівні форми патогенна роль яких залишається недостатньо вивченою. Нерухомі спор не утворюють позбавлені капсул але мають мікрокапсулу яка відокремлена від клітинної стінки осмієфобною зоною. Кислотостійкі що обумовлено високим вмістом ліпідів і міколової кислоти в клітинній стінці а також утворюють кислотолабільні гранули які переважно складаються з метафосфату зерна Муха розташовуються вільно або в цитоплазмі паличок. Грампозитивні анілінові фарби сприймають погано; за Цілем-Нільсеном забарвлюються в яскраво-червоний колір; за Мухом-Вайссом - у фіолетовий йодофільність ; гранули забарвлюються у відповідний колір. Аероби але здатні рости у факультативно анаеробних умовах; 5 0 - 10 0 % вмісту СО2 сприяє більш швидкому росту. Розмножуються повільно в середньому 14-18 годин. Температурний оптимум 37 - 38 град. Цельсію; потреба в рН 7 0-7 2 але можуть рости в межах 4 5-8 0 . Для росту мають потребу в присутності білкового субстрату і гліцерину а також вуглецю хлору сірки фосфору азоту факторів росту біотину нікотинової кислоти рибофлавіну й ін. іонів Mg++ K+ Na+ Fe++ . Для вирощування найчастіше використовують щільні яєчні середовища Льовенштайна-Єнсена Фінна-2 й ін. . На рідких середовищах ріст спостерігають на 5-7 добу у вигляді сухої зморшкуватої плівки R - форма що підіймається на стінки пробірки; середовище залишається прозорим. У середовищах що містять детергент твін-80 дають рівномірний ріст по товщі середовища особливо при періодичному струшуванні . На рідких середовищах і при внутрішньоклітинному розвитку добре виявляється характерний корд-фактор тригалоза-6 6-димиколат що обумовлює зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях їх ріст у вигляді серпантиноподібних утворень "кіс" і має відношення до вірулентності збудника. На щільних середовищах відзначають ріст у вигляді сухого зморшкуватого нальоту кремового кольору; колонії з піднятим центром що нагадують цвітну капусту крихкуваті погано змочуються водою. Колонії легко знімаються з середовища а при прожарюванні тріскотять. Під впливом антибактеріальних препаратів можуть дисоціювати з утворенням м'яких вологих S - колоній або рости у вигляді гладких чи пігментованих колоній. Відмінна риса M.tuberculosis - здатність до синтезу значної кількості нікотинової кислоти ніацину це використовують для її диференціальної діагностики з іншими мікобактеріями ніациновий тест ; одна з умов - необхідність посіву на середовище Льовенштайна-Єнсена що не містить малахітового зеленого тому що барвник вступає в реакцію з реагентами що використані . На середовищах з жовчю утворюють сіруватий маслянистий наліт обумовлений подовженими паличками. Проведення широкого комплексу мікробіологічних досліджень обумовлено зміною епідеміологічної ситуації патоморфозом туберкульозу зміною ряду властивостей збудника що утруднюють мікробіологічну діагностику туберкульозу. До числа їх належить: - олігобацилярність хворих що виражається як невеликим числом мікобактерій у діагностичному матеріалі так і епізодичністю бактеріовиділення. У зв'язку з цим достовірна діагностика бактеріовиділення повинна грунтуватися на серії мікробіологічних досліджень; - зміна культуральних властивостей мікобактерій втрата ними здатності до росту на деяких штучних живильних середовищах. Тому посів діагностичного матеріалу необхідно проводити не менш ніж на два різні живильні середовища чи використовувати попереднє підрощення на рідких живильних середовищах; - зміна тинкторіальних властивостей збудника втрата мікобактеріями кислотостійкості і пов'язана з цим недостатня інформативність бактеріоскопічних методів дослідження при фарбуванні за Цілем-Нільсеном. Додаткове використання люмінесцентної мікроскопії і комплексність мікробіологічного дослідження дозволяють виключити цю проблему; - збільшення ролі неспецифічної мікрофлори у виникненні супутніх захворювань і ускладнень при туберкульозі. У ряді випадків особливо у хворих з неясною етиологією захворювання мікробіологічна ідентифікація збудника повинна проводиться за життєвими показаннями інтервал між одержанням матеріалу від хворого і посівом його на відповідні живильні середовища має бути максимально коротким і не перевищувати 2 години. З метою встановлення бактеріовиділення чи його відсутності кожен хворий повинен бути комплексно обстежений: дослідження харкотиння промивних вод бронхів трахеї шлунку чи ін. не менше трьох разів методом бактеріоскопії трьохразовий посів перед початком лікування у вперше виявленого хворого або при загостреннях і рецидивах процесу. В період лікування зазначені дослідження бактеріоскопія мазка і посів досліджуваного матеріалу проводяться за схемою 2.1 до закінчення основного курсу хіміотерапії. Схема 2.1 - Кратність обстеження хворого на вперше виявленний туберкульоз легень в динаміці хіміотерапії Період від початку терапії міс. Обов'язковий мінімум Рекомендації ВООЗ 0 БС Посів Визначення медикаментозної стійкості наприкінці 2 3 * на початку 5 наприкінці 6 8 ** х 3 х 2 х 2 х 2 х 3 х 1 х 1 х 1 х 3 х 1 х 1 х 1 Примітки: БС - бактеріоскопія; * - якщо наприкінці 2-го місяця лікування результати бактеріоскопії мазка КСП+ в мазку наявні КСП є необхідним проведення бактеріоскопії наприкінці 3-го місяця лікування; ** - якщо наприкінці 6-го місяця лікування результати бактеріоскопії мазка КСП+ в мазку наявні КСП є необхідним проведення бактеріоскопії наприкінці 8-го місяця лікування. В період лікування обстеження проводится після дводенної перерви в прийомі антимікобактеріальних препаратів. 2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу Бактеріоскопічний метод дослідження залишається одним з основних. Перевага цього методу - в його швидкості. Але можливості його обмежені: при прямій бактеріоскопії мазка забарвленого за Цілем-Нільсеном мікобактерії туберкульозу можуть бути виявлені тільки при дуже великій їх кількості - 5 000 - 10 000 бактеріальних клітин і більше в 1 0 мл патологічного матеріалу. Хворі особливо в процесі антибактеріальної терапії часто виділяють мікобактерії в значно меншій кількості тоді цей метод може виявитися недостатньо чутливим для їхнього виявлення. У таких випадках застосовують методи "збагачення" патологічного матеріалу. Приводимо методику прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном п.2.2.1 . Метод прямої мікроскопії мазка за Цілем-Нільсеном доцільно використовувати як попереднє дослідження однак у світовій практиці і за рекомендаціями ВООЗ у даний час досліджується осад патологічного матеріалу який отримується після попередньої гомогенізації матеріалу з наступним його центрифугуванням метод збагачення . 2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном Принцип методу грунтується на здатності M.tuberculosis після забарвлення їх фуксином при прогріванні утримувати барвник навіть після тривалого знебарвлення в сірчаній кислоті або в солянокислому спирті. Реактиви 1. 1 0 % розчин основного фуксину 1 0 г основного фуксину розтирають із 2-3 краплями гліцерину додають по краплі 10 0 мл 96 % етилового спирту і 90 0 мл 5 0 % розчину фенолу 5 0 г кристалічного фенолу або карболової кислоти в 100 0 мл дистильованої води . Розчин лишають на добу потім фільтрують через паперовий фільтр. Зберігають у темному місці при кімнатній температурі в добре закритому посуді. 2. Знебарвлюючі розчини: 20 0 % сірчана кислота 20 0 мл концентрованої H2SO4 додають до 80 0 мл стерильної дистильованої води ; 3 0 % солянокислий спирт 3 0 мл концентрованої соляної кислои додають до 97 0 мл 70 % етилового спирту . 3. Дофарбовуючий розчин: 0 25 % метиленового синього 0 25 г метиленового синього на 1 0 л дистильованої води . 4. Фільтрувальний папір. Всі розчини маркуються і зберігаються в посуді з темного скла при кімнатній температурі протягом 6-12 місяців. Спеціальне обладнання Мікроскоп з імерсійним об'єктивом Газовий або спиртовий пальник Предметні скельця Дерев'яна паличка Хід дослідження Приготування мазка харкотиння: Візьміть нове чисте предметне скельце без подряпин й напишіть з одного боку шифр пацієнта.                               ||                               \/ Перенесіть необхідну кількість досліджуваного матеріалу за допомогою аплікатора або бактеріологічної петлі. Для приготування мазків використовуйте непрозорі сіруваті або жовтуваті творожисті маси які присутні в харкотинні.                               ||                               \/ Матеріал необхідно розподілити по предметному скельцю тонким шаром на площі приблизно 1 0 см на 2 0 см. Мазок повинен бути достатньо тонким щоб його можна було легко мікроскопіювати. На кожному предметному скельці повинно бути не більше одного мазка.                               ||                               \/ Залишіть мазок для підсихання на 15 хв. при кімнатній температурі. Не підсушуйте мазок підігріванням.                               ||                               \/ Фіксуйте препарати використовуючи один із наступних методів: - Проведіть скельце мазком догори через полум'я 3-4 рази. Не перегрівайте мазок. Перед забарвленням мазок необхідно охолодити. - Фіксуйте мазки не менше 2 годин на електронагрівачі для сушки предметних скелець при температурі + 65 - 75 град. Цельсію . Цінність мазків при дослідженні іншого біологічного матеріалу не з легень Так як туберкульозні бактерії можуть вражати майже будь-які органи лабораторія може отримувати для дослідження різноманітний матеріал наприклад біологічні рідини тканини гній та сечу. Результати бактеріоскопічного дослідження цих матеріалів мають обмежене значення тому в таких випадках рекомендується використовувати культуральний метод дослідження. Промивні води шлунка. Не слід використовувати проби промивних вод шлунка для приготування мазків так як при цьому можуть бути отримані некоректні результати. Кислотостійкі сапрофітні бактерії нерідко присутні у воді та в харчових продуктах з якими вони можуть потрапити в шлунок. При бактеріоскопічному дослідженні неможливо віддиференціювати такі мікроорганізми від туберкульозних бактерій. Мазок з гортані. Мікроскопія мазків з гортані не представляє цінності. Негативні результати нічого не значать тому краще зберегти такий матеріал для культурального дослідження. Гній та густий аспірат. Мазки з такого матеріалу повинні бути дуже тонкими. Товсті мазки звичайно змиваються з предметних скелець а якщо вони й зберігаються на склі то все одно після забарвлення дуже важко віддиференціювати кислотостікі бактерії. Труднощі можуть виникнути й при наявності в мазку великої кількості крові так як іноді елементи крові можуть бути причиною утворення кислотостійких артефактів. Плевральна рідина. Матеріал з плевральної рідини повинен бути відцентрифугований після чого для приготування тонкого мазку використовують осад. Спиномозкова рідина. Мікроскопія мазків із спиномозкової рідини рідко дає позитивні результати а осад концентрованої рідини краще використовувати для посіву. Сеча. Мікроскопія мазків із осаду відцентрифугованої сечі не дозволяє отримати достовірні результати тому бактеріоскопічне дослідження сечі проводити недоцільно. Фарбування мазків. Помістіть маркіровані предметні скельця на підставку "санчата" групами максимально по 12 штук так щоб вони не торкалися один одного                               ||                               \/ Налийте на кожне скло достатню кількість розчину Ціля-Нільсена карбол-фуксину який був профільтрований перед використанням або накрийте кожний препарат стрічкою фільтрувального папірця якщо розчин перед використанням не фільтрувався.                               ||                               \/ Обережно підігрівайте препарат до появи парів. Не доводити до кипіння. Ні в якому разі не доводьте до повного випарювання рідини.                               ||                               \/ Якщо були використані стрічки фільтрувального папірця необхідно видалити їх пінцетом. Обережно промийте скельце під струменем води до повного видалення барвника.                               ||                               \/ Нанесіть знебарвлюючий розчин максимум на 3 хв. .                               ||                               \/ Ретельно промийте скельце водою. Видаліть залишки води.                               ||                               \/ Нанесіть на предметне скельце дофарбовуючий розчин на 30-60 сек. .                               ||                               \/ Ретельно промийте скло водою. Видаліть залишки вологи. Залишіть мазок сохнути на повітрі. Не промокайте препарат.                               ||                               \/ Примітка: Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів бактеріоскопії рекомендується знебарвлюючі та дофарбовуючі розчини наносити безпосередньо на мазок. Слід відмовитися від занурення скелець з мазками в посуд із знебарвлюючими та дофарбовуючими розчинами. Оцінка результатів. Препарат мікроскопують під імерсією. На перегляд препарату звичайно потрібно біля 15 хвилин. Цього часу достатньо щоб виявити поодинокі мікобактерії в препараті. В цьому випадку необхідно переглянути не менш 300 полів зору. В останній час при мікроскопії можна спостерігати морфологічні і тінкторіальні зміни M.tuberculosis під впливом антимікобактеріальних препаратів що приводить до утруднення диференціації їх від атипових і сапрофітних мікобактерій. Відомо що М.tuberculosis можуть частково змінювати кислотостійкість набувати кокоподібної сегментоподібної форми а також подвійних коків розташованих бобоподібно як всередині лейкоцитів так і самостійно. Це ускладнює їх диференціацію. Кількість мікобактерій в мазку або колоній в пробірці при культуральному методі дослідження в процесі антимікобактеріальної терапії є орієнтовним показником її ефективності або непрямим свідченням розвитку стійкості мікобактерій до антимікобактеріальних препаратів. Якщо в процесі лікування кількість мікобактерій у препараті не зменшується в порівнянні з початковим - терапію хворого варто змінити. Дуже важливо визначити живі чи неживі мікобактерії оскільки вирішити це питання неможливо шляхом фарбування мазка за Цілем-Нільсеном. З цією метою приготований мазок фіксують над полум'ям фарбують 1 0 % розчином малахітового зеленого протягом 5 - 10 хвилин підігріваючи мазок до появи парів. Після цього фарбу зливають мазок промивають водою і забарвлюють карболовим фуксином в розведенні 1:5 протягом 5 хвилин. При цьому живі мікобактерії фарбуються в зелений колір а нежиттєздатні - в червоний. Цитохімічний метод визначення життєздатності мікобактерій застосовують для проб з великою кількістю мікобактерій. Предметні скельця використовуються лише нові. Мазки з позитивними результатами знищують в установленому порядку так як на скельцях можуть зберігатися мікобактерії попередніх аналізів. 2.2.2 Метод збагачення У випадку відсутності мікобактерій при прямому мікроскопічному дослідженні та при наявності клінічних ознак туберкульозу застосовують різні методи обробки досліджуваного матеріалу з метою концентрації збудника - методи збагачення. Наводимо найбільш поширену та найменш трудомістку методику збагачення досліджуваного матеріалу. Кип'ятіння з содовим розчином Харкотиння хворого збирають у кишенькову плювальницю в кількості 10 - 20 мл. Туди додають рівний об'єм стерильного 5 0 % розчину харчової соди бікарбонату натрію ставлять на водяну баню і кип'ятять протягом 45 хвилин з моменту закипання води. Далі після охолодження вміст виливають в центрифужні пробірки центрифугують при 3500 об/хв. протягом 25 - 30 хвилин надосадову рідину зливають а з осаду роблять тонкі мазки фіксують їх фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують під імерсійною системою світлового мікроскопу. Кип'ятіння з содовим розчином широко використовується в даний час завдяки його простоті ефективності доступності та безпечності. Оцінка результатів світлової мікроскопії. Для запобігання отримання хибнопозитивних результатів при проведенні бактеріоскопії необхідно: - імерсійне масло наносити на скельце піпеткою не торкаючись поверхні мазка; - об'єктив не повинен торкатися поверхні мазка а легко стикатися з верхнім меніском імерсійного масла. Перегляд мазків треба робити за певною системою це вимагає стандартизації що гарантує перегляд найбільш репрезентативних полів у мазку. Для того щоб переконатися в однократності проглядання полів зору необхідно дотримуватися визначеного порядку і керуватися наступними рекомендаціями: - перегляд мазків забарвлених за Цілем-Нільсеном завжди проводиться під 100 кратним об'єктивом з імерсією; - обов'язково включати позитивний і негативний контролі. Позитивний контроль гарантує придатність розчинів до фарбування і правильність методу. Негативний контроль підтверджує відсутність у розчинах і барвниках кислотостійких артефактів; - техніка перегляду мазка: мазок проглядається кілька разів по довжині зигзагоподібно; - мазок можна кваліфікувати як негативний після перегляду не менше 300 полів зору. У досвідченого мікроскопіста на цю роботу піде 15 хвилин. У мазку площею 1 0 х 2 0 см кількість мікроскопічних полів зору від краю до краю буде відповідати 100. У випадку якщо мазок явно позитивний немає необхідності переглядати весь мазок і перегляд декількох полів достатній для оцінки його як позитивного. Мікроскопічне дослідження повинне показати чи присутні в мазку кислотостійкі палички і якщо присутні необхідно дати їх кількісну оцінку в полі зору. При прямій бактеріоскопії у повноцінному полі зору повинен бути присутнім один з наступних елементів бронхіального секрету: лейкоцити еластичні волокна і миготливий епітелій. Після збагачення цих елементів немає бо вони зникають під впливом обробки матеріалу. Результати повинні бути представлені в кількісному вираженні. При фарбуванні мазків за методом Ціля-Нільсена рекомендується наступний порядок видачі результатів: Оцінка результатів бактеріоскопії при забарвленні за Цілем-Нільсеном Кількість КСП паличок у мазку Кількість полів зору Результат Оцінка ступеня обсіменіння та форма відповіді Відсутні 300 Негативний КСП не виявлене на 300 п/зору 1 - 3 300 Негативний КСП не виявлене на 300 п/зору 4 - 9 100 Позитивний недостатня кількість Указати точне число виявлених КСП 4-9 на 100 п/зору 10 - 99 100 Позитивний 1+ від 10 до 99 КСП на 100 п/зору 1 - 10 В полі зору Позитивний 2+ 1-10 КСП у п/зору в 50 п/зору Більше 10 В полі зору Позитивний 3+ більш 10 у п/зору в 20 п/зору Примітки: КСП - кислостійкі палички; п/зору - поле зору. 2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія Люмінесцентна мікроскопія має більш високу чутливість у виявленні мікобактерій. Метод може бути використаний при різних видах обробки біологічного матеріалу. Цей метод значно збільшує діагностичну ефективність мікроскопічних досліджень. Швидкість виявлення мікобактерій простота флюорохромування робить його широко доступним для практичних лабораторій. Перевагою методу люмінесцентної мікроскопії є те що він дозволяє проводити дослідження при менших збільшеннях мікроскопа і отже переглядати в короткий термін значно більше полей зору ніж при звичайній мікроскопії з імерсійною системою. Застосовуючи малі збільшення вдається швидше виявити мікобактерії туберкульозу. Люмінесцентна мікроскопія дозволяє збільшити знахідки у порівнянні з прямою бактеріоскопією мазка. Цей метод крім того найбільш економічний з усіх бактеріоскопічних методів дослідження і рекомендується як основний метод в обласних протитуберкульозних диспансерах для проведення скринінгових досліджень із розрахунку 1 люмінесцентний мікроскоп на 500 тис. - 1 млн. населення. Даний метод мікроскопії грунтується на здатності мікобактерій сприймати люмінесцентні барвники і потім світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. При цьому в залежності від застосовуваних барвників мікобактерії дають яскраво-червоне світіння на зеленому чи золотаво-жовте на темно-зеленому тлі поля зору. Існує ряд методик забарвлення препаратів для люмінесцентної мікроскопії: акридиновим жовтогарячим; аураміном і родаміном за Боєм; аураміном за Хагеманом; аураміном за Хагеманом в модифікації Набонна. Для забарвлення препаратів акридиновим жовтогарячим необхідні наступні реактиви: акрединовий жовтогарячий 3 0 % солянокислий спирт метиловий спирт 10 0 % розчин аміаку. З акрединового жовтогарячого готується основний розчин шляхом розчинення 1 0 г барвника в 100 0 мл дистильованої води. З основного розчину готується робочий розчин шляхом додавання 10 0 мл основного розчину до 990 0 мл дистильованої води. Сюди ж додається 3 - 6 крапель 10 0 % розчину аміаку рН має бути не менше 9 0. Мазки готують з осаду отриманого при обробці матеріалу для посіву краплю якого наносять на скельце звичайним способом. Препарати фіксуються метиловим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Скельця для препаратів повинні бути новими тонкими і без подряпин. Забарвлення препаратів здійснюють шляхом занурення фіксованих мазків у робочий розчин акридинового жовтогарячого на 24 години без підігріву. Потім мазки двічі по 10 хвилин знебарвлюють 3 0 % солянокислим спиртом промивають дистильованою водою висушують у термостаті і мікроскопують. Для забарвлення препаратів аураміном і родаміном за Боєм необхідні наступні реактиви: аурамін 00 родамін С 3 0 % солянокислий спирт 0 25 % водний розчин метиленової синьки. Родамін С можна заміняти подвійною кількістю родаміу 6 Ж. Робочий розчин аураміну і родаміну готується шляхом додавання 1 0 г аураміну і 0 1 г родаміну до 1000 0 мл дистильованої води. Фіксований над полум'ям пальника мазок забарвлюють протягом 10 хвилин робочим розчином при легкому підігріванні потім мазок промивають водою знебарвлюють 3 0 % солянокислим спиртом і знову промивають водою. Гасіння тла роблять шляхом забарвлення препарату 0 25 % розчином метиленового синього після чого препарат промивають водою висушують на повітрі і мікроскопують. Методика забарвлення препарату за Хагеманом в модифікації Набонна аураміновий метод : на фіксований мазок наливають розчин аураміну 00 на 15 хвилин не нагрівають мазки й не використовують стрічки фільтровального папірця потім препарат ретельно промивають водою знебарвлюють солянокислим спиртом 3 - 5 хвилин промивають водою дофарбовують розчином кислого фуксину протягом 2 хвилин ретельно промивають водою висушують і мікроскопують. Забарвлені препарати мають малиново-червоний колір. При люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій світяться золотаво-зеленим кольором на темному чи бурувато-червоному тлі. Методика забарвлення препаратів за Боєм в модифікації Полякової: фіксовані препарати забарвлюють розчином що містить аурамін 1:1000 і родамін С 1:1000 протягом 20 хвилин. Потім препарат промивають водопровідною водою і знебарвлюють 3 0 % солянокислим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Потім цей препарат знову промивають водою і після гасіння тла 0 25 % розчином метиленової синьки протягом 1 - 2 хвилин промивання водою і висушування він готовий до мікроскопії. При даному методі забарвлення в препаратах при люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій мають золотаво-жовтогарячий колір. При люмінесцентній мікроскопії необхідно правильно відповідно до інструкцій користуватися освітлювальною апаратурою. Позитивна відповідь дається при виявленні не менше 3-х клітин мікобактерій у препараті. Кількість клітин мікобактерій оцінюється так само як і в методиці світлової мікроскопії препаратів пофарбованих за Цілем-Нільсеном. Люмінесцентний метод мікроскопії підвищує результативність досліджень по виявленню клітин мікобактерій у досліджуваному матеріалі на 18 0 - 20 0 % у порівнянні зі світловою мікроскопією препаратів з нативного матеріалу і на 8 0 - 10 0 % - препаратів з матеріалу після збагачення. Слід зазначити що люмінесцентна та пряма мікроскопія не дає можливості диференціювати M.tuberculosis від сапрофітних та умовно-патогенних мікобактерій. Приготування барвників і реактивів для люмінесцентної мікроскопії Розчин аураміну 00 і родаміну С для забарвлення за Боєм : 1 0 г аураміну і 0 1 г родаміну С розчиняють у 1000 0 мл дистильованої води для цього розчину можна застосовувати родамін 6 Ж в кількості 0 2 г на 1000 0 мл дистильованої води . 3 0 % солянокислий спирт для забарвлення за Боєм : 3 0 мл соляної кислоти додається до 97 0 мл 70 % спирту. Розчин аураміну 00 для забарвлення за Хагеманом : 1 0 г аураміну 00 розчиняють у 1000 0 мл дистильованої води. У фарбу додають 5 0 мл 5 0 % розчину карболової кислоти. Водний розчин аураміну 00 не повинен давати пластівців при додаванні в нього карболової кислоти. Кислий фуксин для забарвлення за Хагеманом : 1 0 г кислого фуксину розчиняється в 390 0 мл дистильованої води. До цього розчину додається 10 0 мл концентрованої оцтової кислоти. Солянокислий спирт для знебарвлення препаратів при забарвленні за Хагеманом : до 90 0 мл спирту-ректифікату налитого в градуйовану посудину доливається 4 0 мл концентрованої соляної кислоти що димить і висипається 4 0 г хімічно чистої кухонної солі. Потім доливається дистильована вода до мітки 100 0 мл частина нерозчиненої кухонної солі залишається в осаді . 0 25 % розчин метиленової синьки: до 100 0 мл дистильованої води додається 0 25 г метиленового синього. Основні розчини флюорохромів можуть зберігатися в темряві багато місяців у темних флаконах закритих скляними притертими корками чи гумовими корками обгорненими алюмінієвою фольгою. Робочі розчини не повинні зберігатися більше 6 - 7 діб. Фільтрувальний папір застосовувати не можна. Якщо барвник розчинений не цілком і є осад флакон з розчином на кілька годин можна помістити в термостат при 37 град. Цельсію. Оцінка результатів люмінесцентної мікроскопії. Мазки пофарбовані для люмінесцентної мікроскопії якщо неможливо переглянути відразу після приготування слід зберігати в темному місці переважно в холодильнику максимум протягом доби оскільки з часом інтенсивність світіння флюорохромів може знижуватися. При люмінесцентній мікроскопії мазків як правило використовується менше збільшення у порівнянні зі збільшенням використовуваним при перегляді мазків пофарбованих за методом Ціля-Нільсена 1000 . Поле зору в люмінесцентному мікроскопі охоплює більшу частину мазка ніж при світловій мікроскопії. Представлена нижче схема дозволяє порівнювати результати отримані в різних лабораторіях незалежно від використаного методу мікроскопії і збільшення: Співвідношення результатів світлової та люмінесцентної мікроскопії Світлова мікроскопія при фарбуванні за Цілем-Нільсеном Люмінесцентна мікроскопія Х 1000 Результат Х 250 Х 450 Х Х 630 Немає / 300 полів зору 1 - 3 / 300 полів зору 4 - 9 / 100 полів зору 10-99 / 100 полів зору 1 - 10 в полі зору Більше 10 в полі зору КСП не виявлені КСП не виявлені Указати точне число 1 + 2 + 3 + Розділити кількість знайдених КСП на 10 Розділити кількість знайдених КСП на 4 Розділити кількість знайдених КСП на 2 Примітка: КСП - кислотостійкі палички. Приклад: При перегляді мазка методом люмінесцентної мікроскопії виявлено 20 КСП у полі зору при збільшенні 450. Ділимо це число на коефіцієнт приведений у схемі: 4 одержуємо порівнянний результат з результатом світлової мікроскопії - 5 КСП в полі зору що може бути оцінене як 2 + але не як 3 +. Після перегляду препаратів методом люмінесцентної мікроскопії при необхідності можна забарвити ці ж самі препарати за Цілем-Нільсеном та досліджувати їх в світловому мікроскопі. 2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія Фазовоконтрастна мікроскопія є єдиним мікроскопічним методом дослідження що дозволяє спостерігати клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми в живому стані. Для її здійснення до звичайного світлового мікроскопу застосовується спеціальне фазовоконтрастне пристосування КФ-4. З методів фазовоконтрастної мікроскопії найбільше широко застосовується методика дослідження препаратів приготовлених по типу препарату що одержав назву "роздавлена крапля". Для готування даного препарату беруть чисте знежирене предметне скельце. На поверхню його бактеріологічною петлею чи піпеткою наносять краплю рідкої суспензії досліджуваних мікобактерій чи їх біологічно змінених форм покривають краплю чистим і фламбірованим над полум'ям пальника покривним скельцем так щоб між предметним і покривним скельцем не було пухирців повітря. Препарат поміщають на предметний столик мікроскопа і відповідно до правил здійснюють фазовоконтрастну мікроскопію. При цьому в полі зору мікроскопа стають помітними живі клітини мікобактерій чи їх біологічно змінені форми. Для фазовоконтрастної мікроскопії імерсійним методом на поверхню покривного скельця наносять краплю імерсійної олії занурюють у неї імерсійний об'єктив і здійснюють мікроскопію. При цьому у полі зору спостерігають живі клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми окремі деталі їх структури. 2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу Бактеріологічний метод виявлення мікобактерій має великі переваги перед методом бактеріоскопії. Він дозволяє виявити M.tuberculosis в досліджуваному матеріалі якщо їх міститься біля 100 в 1 мл. Зрілі культури можуть бути ретельно досліджені й ідентифіковані у них може бути визначена чутливість до антимікобактеріальних препаратів вивчена вірулентность та інші властивості. Виділення мікобактерій бактеріологічним методом свідчить про високу життєздатність мікобактерій і вегетування їх в організмі хворого. 2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище Бактеріологічному дослідженню піддається самий різноманітний матеріал: харкотиння промивні води бронхів шлунка ексудат виділення ран сеча ліквор біопсійний і секційний матеріал і ін. Матеріал повинен доставлятися в лабораторію в стерильному добре закритому посуді. Для знищення супутньої мікрофлори досліджуваний матеріал піддають спеціальній обробці. Для обробки патологічного матеріалу використовують різні речовини. Основні вимоги що пред'являють до таких реактивів це з одного боку повне зберігання життєздатності M.tuberculosis а з іншого пригнічення росту неспецифічної мікрофлори яка може бути в досліджуваному матеріалі. Для практики можуть бути рекомендовані наступні методи обробки патологічного матеріалу. Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислим натрієм Цей метод є найбільш зручним і поширеним. Принцип. Трьохзаміщений фосфат натрію є реактивом який не впливає на життєздатність туберкульозних паличок. Цей метод лужної обробки допускає навіть тривалу експозицію патологічного матеріалу з фосфатом натрію без порушення життєздатності M.tuberculosis 2-3 доби . Це особливо цінно в тих випадках коли доставка матеріалу в лабораторію утруднена. Крім того трьохзаміщений фосфат натрію добре пригнічує супутню мікрофлору і гомогенізує матеріал. Обробці трьохзаміщеним фосфорнокислим натрієм піддають харкотиння промивні води бронхів ексудати і будь-які інші матеріали. Реактиви 12 0 % стерильний водний розчин Na3PO4 автоклавування при 121 град. Цельсію 1-2 хв. . Обробка полягає в додаванні до досліджуваного матеріалу рівної за об'ємом кількості 12 0 % розчину трьохзаміщеного фосфату натрію й інкубації цієї суміші при 37 град. Цельсію у термостаті протягом доби. Після інкубації матеріал центрифугують 15 хвилин при 3500 об/хв. надосадну рідину зливають до осаду додають 1 0 мл фізіологічного розчину і засівають по 0 2 мл на 2 пробірки щільного яєчного середовища. Обробка фосфатом натрію зручна і тоді коли харкотиння для посіву треба доставляти в лабораторію здалека. У цьому випадку хворий протягом доби збирає харкотиння в стерильну кишенькову плювальницю з 10 0 мл 12 0 % розчину фосфату натрію який служить консервантом. При доставці харкотиння в лабораторію вміст плювальниці переливають у стерильні пробірки центрифугують надосадну рідину зливають а осад засівають звичайним способом. Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова використовується за рекомендаціями ВООЗ Реагенти: 4 0 % гідроксид натрію NaOH : Гідроксид натрію хімічно чистий - 4 0 г. Дистильована вода - 100 0 мл. Розчинити NaOH в дистильованій воді й стерилізувати автоклавуванням при 121 град. Цельсію протягом 15 хв. Стерильний розчин NaOH можна зберігати протягом декількох тижнів. Зберігати в пластиковому посуді. Стерильний ізотонічний розчин хлориду натрію: Хлорид натрію хімічно чистий - 0 85 г. Дистильована вода - 100 0 мл. Розчинити NaCl в дистильованій воді і стерилізувати автоклавуванням при 121 град. Цельсію протягом 15 хв. Методика. До харкотиння додати подвійний об'єм 4 0 % розчину NaOH.                                   ||                                   \/ Закрити флакон кришкою і струсити.                                   ||                                   \/ Залишити на 15 хв. при кімнатній температурі та періодично струшувати.                                   ||                                   \/ Центрифугувати при 3500 об/хв. протягом 15 хвилин.                                   ||                                   \/ Видалити надосадну рідину.                                   ||                                   \/ Додати 15 0 мл стерильного ізотонічного розчину NaCl або дистильованої води та ресуспендувати осад.                                   ||                                   \/ Центрифугувати при 3500 об/хв. протягом 15 хвилин.                                   ||                                   \/ Видалити надосадну рідину і негайно провести засів на живильне середовище.                                   ||                                   \/ Метод з використанням NaOH простий і дешевий; при цьому досягається добра очистка від контамінантів. Гідроксид натрію є токсичним по відношенню як до контамінантних мікроорганізмів так і до туберкульозних бактерій. Тому при використанні даного методу необхідно чітко додержуватися вказаної тривалості кожного етапу обробки. Обробка досліджуваних проб методом NALC-OH - N-ацетил-L-цистеїном з гідроксидом натрію Більш щадящим методом обробки матеріалу є метод з використанням N-ацетил-L-цистеїну і гідроокису натрія NALC-OH . Застосування муколітичного препарату NALC який використовується для швидкого розрідження харкотиння дозволяє знизити концентрацію деконтамінуючого субстрату NaOH до 1 0 %. Цитрат натрію який включений до літичної суміші є необхідним для зв'язування йонів важких металів які можуть бути присутніми в пробі та інактивовувати дію ацетилцистеїну. Обробка досліджуваних проб методом NALC-OH переслідує 3 мети: - деконтамінація; - гомогенізація; - збагачення. Даний метод обробки проб є найбільш щадящим. Час експозиції після внесення NALC-OH 20 хвилин і температурний режим 20 град. Цельсію дозволяє зберегти життєздатність 85 0 % клітин мікобактеріальної популяції що знаходиться в досліджуваному матеріалі. Приготування розчинів. Розчин 1: - 40 0 г NaOH розчинити в 1000 0 мл дистильованої води. Розчин 2: - 32 5 г Na-цитрату розчинити в 1000 0 мл дистильованої води. Розчини 1 і 2 автоклавують 20 хвилин при 121 град. Цельсію. - 50 0 мл розчину 1; Розчин 3: - 50 0 мл розчину 2; - 0 5 г N-ацетил-L-цистеїну. Розчин 3 готувати кожного дня!!! Фосфатний буфер - рН 6 8: - 11 64 г Na2HPO4 х 2H2О; - 9 26 г KH2PO4 Розчинити в 2000 0 мл дистильованої води встановити рН автоклавувати при 121 град. Цельсію 20 хвилин Хід дослідження - 10 0 мл досліджуваної проби змішати з розчином 3 в рівних кількостях; - змішувати струшуючи протягом 20 хвилин при кімнатній температурі; - додати фосфатний буфер до 50 0 мл перемішати; - центрифугувати при 3500 об/ хв 20 хвилин; - надосад злити; - до осаду додати 1 0 мл фосфатного буфера струсити негайно посіяти. Особливості обробки сечі методом NALC-OH Для дослідження використовують ранкову порцію сечі в кількості 50 0 мл. Готують суміш: - 50 0 мл сечі; - 0 5 мл плазми; - 3 краплі 20 0 % сульфосаліцилової кислоти; - 1 краплю 1 0 % твіну-80. Обережно перемішують. Для осадження білку залишають на 2 години в холодильнику при + 4 град. Цельсію . Потім пробу центрифугують при 3500 об/хв 20 хвилин і зливають надосадну рідину. Осад обробляють за методом NALC-OH. Обробка досліджуваних проб харкотиння методом Necal - BX модифікований Necal-BX - диізобутилнафталансульфонат Приготування розчинів. - 0 1 г Necal-BX сухий порошок ; Розчин 1: - 5 0 г твердого кристалічного NaOH; - розчинити в стерильній дистильованій воді довести об'єм суміші до 1000 мл. - 2 0 г CaCl2 x 2H2O CaCl2 без води - 1 5 г ; Розчин 2: - 4 0 г BaCl2 x H2O; - розчинити в стерильній дистильованій воді довести об'єм суміші до 100 мл. Розчини 1 і 2 не потребують автоклавування. Зберігають стабільність при 4-25 град. Цельсію протягом 4 тижнів. Хід дослідження 1 частину приблизно 2 0 мл досліджуваного матеріалу наприклад харкотиння ретельно змішують з 5 частинами приблизно 10 0 мл розчину 1 і 2 краплями розчину 2. Інкубують до 20 годин при кімнатній температурі. Після цього негайно центрифугують при 3500 об/хв зливають надосадну рідину осад засівають на живильне середовище Льовенштайна-Єнсена. Обробка кислотою Для обробки патологічного матеріалу можна користуватися сірчаною кислотою. Цей метод зручний для обробки матеріалу в той же день наприклад перед вихідним днем. У залежності від забрудненості матеріалу використовують кислоту різної концентрації. Харкотиння гнійні ексудати тампони з ран пунктати лімфатичних вузлів промивні води шлунка бронхів операційний матеріал обробляють 3 0 % сечу - 6 0 % секційний матеріал - 10 0 % сірчаною кислотою. Стерильно взяту спинномозкову рідину серозні ексудати можна засівати без обробки. Досліджуваний матеріал поміщають у банку з скляними кульками або битим склом додають рівний об'єм відповідного розчину сірчаної кислоти і старанно протягом 10 хвилин струшують. Потім оброблений кислотою матеріал 10 хвилин центрифугують. Час контакту матеріалу з кислотою не повинен перевищувати 20 хвилин від початку обробки. Після центрифугування надосадну рідину зливають до осаду додають фізіологічний розчин ще раз центрифугують і зливають відмиваючи кислоту. Осад засівають на яєчне середовище по 0 2 мл. Варто пам'ятати що при будь-якому методі обробки промивні води шлунка сіють відразу ж тому що шлунковий сік згубно діє на мікобактерії туберкульозу і при тривалому стоянні частина паличок гине. Якщо патологічний матеріал доставлений у великій кількості промивні води шлунка сеча і т.п. то спочатку його центрифугують збирають осад який потім обробляють і засівають. При всіх способах обробки матеріалу посів роблять мінімум на 2 пробірки яєчного середовища. Для підвищення виходу мікобактерій доцільно робити посів патологічного матеріалу на два яєчних середовища - Льовенштайна-Єнсена і Фінна-2. Посіви переглядають кожного тижня. Ріст M.tuberculosis з'являється на З - 6 тиждень у вигляді сухих безпігментних або блідо-кремових R-колоній. Після курсу антимікобактеріальної терапії від хворих можуть виділятися культури з гладким вологим ростом S-колонії . Позитивну відповідь дають тільки після мікроскопії культур. Результат посіву повинен відображати не тільки якісну характеристику позитивний чи негативний але і кількісну оцінку число колоній . Рекомендується керуватися табл. 2.1 Національна протитуберкульозна програма 2000 : Таблиця 2.1 - Схема ВООЗ по оцінці результатів культурального дослідження на M.tuberculosis Кількість вирослих колоній Оцінка результату Характеристика Немає росту 1-19 колоній Негативний Позитивний вказати число колоній Поодинокі колонії невелике бактеріовиділення; при бактеріоскопії патологічного матеріалу мікобактерії як правило не знаходять 20 - 100 колоній 100 - 200 колоній 200 - 500 колоній майже суцільний ріст Більше 500 колоній суцільний ріст 1 + 2 + 3 + 4 + Помірне бактеріовиділення; при бактеріоскопії патологічного матеріалу знаходять поодинокі мікобактерії в кожному полі зору або одиничні - у препараті але не менше п'яти Масивне бактеріовиділенлення; бактеріоскопічно - 10 і більше паличок у кожному полі зору Проріст банальною мікрофлорою Проріст - посів повторити Більшість посівів дає ріст M.tuberculosis протягом двох місяців. Тому достатньо інкубувати посіви до двох з половиною місяців. При відсутності росту до цього часу посів вважається негативним і пробірки видаляють. 2.3.2 Живильні середовища Для посіву патологічного матеріалу використовують наступні яєчні середовища: Льовенштайна-Єнсена Фінна-2 та ін. Середовище Льовенштайна-Єнсена рекомендоване ВООЗ для всіх координаційних лабораторій. Цим середовищем користується більшість лабораторій України. Заслуговує уваги середовище Фінна-2. Воно відрізняється від середовища Льовенштайна-Єнсена тим що не містить дорогого L-аспарагіну. На цьому середовищі ріст мікобактерій як правило з'являється на декілька днів раніше ніж на середовищі Льовенштайна-Єнсена. Використання двох середовищ одночасно підвищує відсоток виділення M.tuberculosis з патологічного матеріалу і є обов'язковим. Однак треба пам'ятати що середовище Фінна-2 можна використовувати лише для первинного виділення мікобактерій з патологічного матеріалу. 2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ Середовище Льовенштайна-Єнсена без крохмалю . Сольовий розчин: однозаміщений фосфорнокислий калій - 2 4 г магній сірчанокислий - 0 24 г магній лимоннокислий - 0 6 г L-аспарагін - 3 6 г гліцерин - 12 0 мл вода дистильована - 600 0 мл. Реактиви розчиняють у воді у вказаній вище послідовності при слабкому нагріванні розливають у флакони і стерилізують при 121 град. Цельсію протягом 30 хвилин. Сольова основа може бути приготована заздалегідь і зберігатися до 1 місяця. Яєчна маса: 10 - 12 в залежності від величини свіжих дієтичних яєць миють проточною теплою водою щіткою з милом занурюють на 30 хвилин у 70 % спирт або оброблюють 1 - 2 хвилини 5 0 % йодною настоянкою а потім над полум'ям пальника розбивають стерильним пінцетом у колбу з битим склом добре струшують після кожного яйця до отриманої однорідної яєчної маси додають 10 0 мл стерильного 2 0 % розчину малахітової зелені і 300 0 мл сольового розчину. Суміш фільтрують через марлевий фільтр і розливають у пробірки приблизно по 5 0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 град. Цельсію протягом 30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові. В даний час для виділення та культивування МБТ використовують сухі комерційні середовища для приготування сольової основи середовища Льовенштайна-Єнсена фірма MERCK Німеччина а також виробництва Державного експериментального заводу медичних препаратів м. Київ Україна . Середовище Фінна-2. Сольовий розчин: магній сірчанокислий - 0 5 г натрій лимоннокислий - 1 0 г квасці залізоаміачні - 0 05 г калій фосфорнокислий однозаміщений - 20 0 г амоній лимоннокислий однозаміщений - 5 0 г натрій глутаміновокислий однозаміщений - 10 0 г гліцерин - 20 0 мл вода дистильована - до 1 0 л. Інгредієнти розчиняють у вказаному вище порядку в теплій дистильованій воді. рН не корегувати - 6 3-6 5. Розливають у флакони і стерилізують при 121 град. Цельсію - 20 хвилин. Далі чинять так само як і при приготуванні середовища Льовенштайна-Єнсена. Для приготування яєчних живильних середовищ використовують свіжі курячі яйця не більше тижня з цілою незабрудненою шкарлупою. Готове яєчне середовище з малахітовим зеленим повинно бути світло-зеленого кольору без дрібних поглиблень та пухирців на поверхні досить щільним. Знебарвлення готового середовища вказує на його надлишкову температурну обробку. Після згортування коагуляції необхідно залишити всі пробірки або вибіркові екземпляри при 35-37 град. Цельсію на 24 години для перевірки стерильності. 2.3.2.2. Рідкі живильні середовища Кров'яне середовище. Для прискореного виявлення в патологічному матеріалі M.tuberculosis в виключних випадках використовують метод Прайса оснований на мікрокультивуванні мікобактерій на предметних скельцях а також в глибині рідкого середовища в модифікації Є.А.Школьнікової . Цей метод дає можливість виявити мікроколонії M.tuberculosis уже через 2 - 10 діб після посіву. Досліджуваний матеріал після обробки переносять піпеткою в центрифужну пробірку і центрифугують 1-2 хвилини. З осаду готують мазки на стерильних вузьких скельцях які отримують розрізуючи предметне скло вздовж на 2 частини. Можна робити мазки безпосередньо з грудочок харкотиння. Мазки роблять на 1/3 частини скельця яке укладають в стерильну кювету підсушують в термостаті при 37 град. Цельсію протягом кількох годин потім заливають на 1-2 хвилини 3 0 % розчином сірчаної кислоти для деконтамінації і фіксації. Після зливання кислоти мазки тричі відмивають стерильною водою і занурюють у пробірки з живильним середовищем. Як живильне середовище використовується свіжа цитратна гемолізована донорська кров термін придатності якої для росту мікобактерій - не більше 10 діб. Кров від донора збирається в стерильну колбу з 5 0 % розчином цитрату натрію на 100 0 мл крові 10 0 мл цитрату . Цитратна кров гемолізується стерильною дистильованою водою в співвідношенні 1:10 - 1:5 в залежності від дати взяття крові . Гемолізована кров над полум'ям пальника розливається по 5 0 мл у стерильні пробірки. Облік результатів проводиться через 8 - 10 діб інкубації в термостаті при 37 град. Цельсію. Після закінчення цього терміну пробірки з мазками автоклавують обережно відмивають водою від крові підсушують фіксують над полум'ям забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа. При позитивному результаті в мазках одержують характерні мікроколонії що представляють собою забарвлені в червоний колір переплетені джгути так звані "коси" які складаються з великої кількості щільно притиснутих одна до одної клітин їх можна побачити перевівши об'єктив на імерсійну систему. Корд-фактор тригалоза-6 6-диміколат що забезпечує зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях забезпечує ріст у вигляді серпантиновидних "кіс" і має відношення до вірулентності збудника. Слід зазначити що предметне скельце повинно бути лише новим без подряпин добре відмитим обезжиреним в суміші Нікіфорова і простерилізованим. Напівсинтетичне середовище Школьнікової. Застосовується для мікрокультивування M.tuberculosis в глибині рідкого середовища. Склад. Сольовий розчин: калій фосфорнокислий однозаміщений - 1 5 г натрій фосфорнокислий двозаміщений - 2 5 г магній сірчанокислий - 0 5 г натрій лимоннокислий - 1 5 г лимоннокислоаміачне залізо - 0 05 г L-аспарагін - 1 0 г гліцерин - 30 0 мл вода дистильована до 1000 0 мл. Нативна бичача сироватка. Пеніцилін. Техніка приготування. Солі у вказаному порядку додають у дистильовану воду при легкому нагріванні на водяній бані кожну із солей додають після того як повністю розчиниться попередня . Середовище фільтрують через паперовий фільтр і розливають у колби стерилізують в автоклаві при 0 5 атм. протягом 30 хвилин. В такому стані можна зберігати в холодильнику кілька місяців. Для посіву сольовий розчин розливають у пробірки по 2 0 мл знову автоклавують і безпосередньо перед посівом у кожну пробірку додають по 0 2 мл нативної бичачої сироватки і пеніцилін із розрахунку 10 - 20 ОД на 1 0 мл середовища. Середовище ВКГ розроблено В.В.Власенко середовище зі стимулятором росту для прискореного виявлення мікобактерій туберкульозу . Середовище ВКГ призначене для прискореного виявлення M.tuberculosis: стимулятор - для прискорення росту живильне середовище - для культивування мікобактерій. Стимулятор росту - стерильна прозора безбарвна рідина допускається жовтуватий відтінок . До 5 0 мл стимулятору росту додають в асептичних умовах за допомогою стерильного шприця 1 0-1 5 мл підготовленого патологічного матеріалу відбір і підготовка матеріалу здійснюється за загальноприйнятою методикою бактеріологічних досліджень та чинної методичної НД . Отриману суспензію інкубують у термостаті при температурі 37 0 + - 1 0 град. Цельсію протягом 24 - 48 годин і висівають на живильне середовище. Живильне середовище дрібнодисперсний гігроскопічний порошок кремового кольору у кількості зазначеній на етикетці розмішують в 1 0 л стерильної дистильованої води кип'ятять 2-3 хвилини до повного розплавлення агару фільтрують через ватно-марлевий фільтр розливають у відповідний посуд стерилізують у автоклаві при 121 0 + - 1 0 град. Цельсію протягом 15 хвилин. Готове середовище жовтого забарвлення з рН 7 2 + - 0 2 використовують протягом 1 місяця за умови зберігання його при 6 0 + - 2 0 град. Цельсію. Перед посівом живильне середовище розплавляють на водяній бані і розливають в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі шаром 6-8 мм. В чашку Петрі зі свіжорозплавленим живильним середовищем вносять 1 5 мл суспензії досліджуваного матеріалу у стимуляторі росту рівномірно розподіляючи її по всій поверхні. Чашки Петрі не перевертають!!! герметизують прозорою липкою стрічкою та інкубують при 37 0 + - 1 0 град. Цельсію протягом 10 діб. Посіви продивляються щоденно. Візуально можна виявити характерний ріст мікобактерій уже через 24 - 48 годин. 2.4 Біологічний метод дослідження Зараження морських свинок варто проводити в діагностичних випадках для підтвердження туберкульозної етиології захворювання у нелікованих хворих а також для встановлення бактеріовиділення у хворих що приймали нетривалий час антимікобактеріальні препарати. Особливу цінність представляє біологічна проба при дослідженні матеріалів від хворих що страждають урогенітальним туберкульозом. Доцільно проводити одночасно зараження морських свинок і посів. Сполучення обох методів дає більше можливостей виявити мікобактерії в патологічному матеріалі. Обробка матеріалу для зараження морських свинок. Для зараження морських свинок використовують різноманітний матеріал: харкотиння сечу промивні води бронхів шлунка ексудати виділення ран операційний матеріал і ін. Досліджуваний матеріал обробляють 3 0 % сірчаною кислотою так само як для посіву. Після обробки кислотою його двічі відмивають стерильним ізотонічним розчином хлористого натрію щоб не залишилося кислоти тому що при попаданні кислоти морській свинці під шкіру може виникнути виразка. До отриманого осаду додають 1 0 мл стерильного ізотонічного розчину хлористого натрію і вводять шприцем морській свинці під шкіру правої пахвинної області. Якщо є можливість то краще заражати двох свинок. При цьому одну морську свинку забивають через 1 5 другу - через 3 місяці. За свинками проводять систематичне спостереження перевіряючи появу місцевого інфільтрату стан регіонарних лімфатичних вузлів і т.п. Міра макроскопічних змін може бути різноманітною. Вона залежить від кількості і вірулентності мікобактерій туберкульозу в патологічному матеріалі. Щомісяця перевіряють чутливість до туберкуліну вводячи підшкірно в попередньо вищипану або поголену середню частину черевця 0 1 мл туберкуліну 100 ТО PPD-L . Реакцію оцінюють через 24 і 48 годин. Позитивною вважається реакція у вигляді інфільтрату більше 5 мм. Він спостерігається у свинок інфікованих M.tuberculosis. При наявності в патологічному матеріалі достатньої кількості вірулентних мікобактерій уже через 2 тижні на місці зараження може з'явитися інфільтрат або виразка. Через місяць збільшуються регіонарні лімфатичні вузли. При забої морських свинок через 1 5 місяця відмічають інфільтрат часто з розпадом у місці введення патологічного матеріалу збільшення регіонарних лімфатичних вузлів одиничні туберкульозні вогнища в легенях в селезінці. При забої морських свинок через 3 місяці виявляється збільшення лімфатичних вузлів як регіонарних так і віддалених ураження спостерігаються в такій послідовності: селезінка печінка і легені. При зараженні морських свинок у яєчко вводять тільки 0 4 мл матеріалу обробленого вказаним вище способом. Для зараження в яєчко використовують добре гомогенізований матеріал: сечу харкотиння або промивні води бронхів. При зараженні двох морських свинок їх також доцільно забивати через 1 5 і 3 місяці. По наявності специфічних змін збільшення ущільнення і наявність вогнищ у яєчку та у внутрішніх органах судять про наявність мікобактерій у патологічному матеріалі. Іноді при обстеженні олігобацилярних хворих - при посівах харкотиння або іншого матеріалу мікобактерії не висіваються а при зараженні свинки можуть визначатися незначні зміни в регіонарному лімфатичному вузлі або в органах. У таких випадках варто зробити посів з органів морської свинки для одержання культури і її подальшого вивчення. Посів з органів свинки необхідно робити також в усіх сумнівних випадках. 3. Ідентифікація виділених культур мікобактерій У сучасній бактеріології ідентифікація мікобактерій представляє великі труднощі. З одного боку в результаті інтенсивної і тривалої хіміотерапії туберкульозу змінилася морфологія збудника. З іншого боку частішими стали випадки виділення з патологічного матеріалу атипових мікобактерій. У практичних лабораторіях для диференціації M.tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій необхідно застосовувати найбільш прості і доступні тести що включають бактеріологічні і біохімічні дослідження. За останнім виданням Берджі 9 видання група 21 мікобактерії включає 45 видів із яких більшість являється сапрофітами не патогенними для людини. Поряд із цим ряд видів може викликати ураження легень лімфатичних вузлів і інших органів. Найбільш патогенними для людини є M.tuberculosis і M.bovis. Для правильної оцінки виділених мікобактерій - ідентифікації і визначення їх ролі в захворюванні людини необхідно провести диференціацію виділених культур із використанням спеціальних методик. Комплекс цих тестів різноманітний в залежності від кваліфікації лабораторних робітників обсягу досліджень що проводяться і умов роботи лабораторії. 3.1 Бактеріологічний культуральний метод дослідження При культуральному методі дослідження варто враховувати ріст на яєчних агарових і рідких живильних середовищах. Враховується також швидкість росту температурний оптимум росту морфологія колоній їх колір табл.3.1 . Таблиця 3.1 - Основні диференційно-діагностичні морфологічні і ростові характеристики мікобактерій Вид Колонії Ріст Морфологія Пігмент * Швидкість** град.Цель. M.tuberculosis R-колонії Н кремові Повільна 31-38; 37 оптимум M.bovis Дрібні прозорі R-колонії Н безбарвні чи Кремові Повільна 37-38 M.africanum R-колонії Н Повільна 37 Комплекс M.avium- intracellulare Дрібні опуклі S-колонії R-дисоціанти Н Повільна 25 - 45 37 оптимум M.scrofulaceum Круглі s-колонії С жовто- жовтогарячі Повільна 25-37 M.kansasii R-колонії містять Кристали b-каротину Ф рідко Н чи С Повільна 25-37 M.fortuitum- cheloneae S- і r-колонії Н кремові Швидка 25-40 M.xenopi S-колонії з Виростами Н с Повільна 42-43 M.szulgai S- і r-колонії С 37 град.Цель. ; Ф 25 град.Цель. Повільна 25-37 M.malmoense S-колонії Безбарвні Швидка 25-37 M.simiae S-колонії Ф при тривалій Експозиції Повільна 37 M.marinum Нерівні блискучі S-колонії; рідше R-дисоціанти Ф Помірна 31-33 M.haemophilum R-колонії; рідше S-дисоціанти Н Повільна 20-32 M.gordonae S-колонії С жовтогарячі Повільна 25-37 M.asiaticum R-колонії Ф Повільна 25-37 M.thermoresis- tible Частіше s-колонії; R-дисоціанти Ф жовто-жовтогарячі пізніше - коричневі Швидка 37-45 M.terra-triviale S- м.terra і R- м.triviale колонії Н Повільна 25-37 M.nonchromoge- nicum R-колонії Н Повільна 25-37 M.flavescens S-колонії С Помірна 25-37 M.smegmatis Частіше r-колонії; Рідше s-дисоціанти Н кремові Швидка 25-45 M.shimodei R-колонії Н Повільна 37 Позначення: * Н - нефотохромогенні С - скотохромогенні Ф - фотохромогенні; ** швидкість росту на щільних середовищах: повільна - протягом 4 - 6 тижнів; помірна - протягом 2-3 тижнів; швидка - протягом 2 - 7 діб. M.tuberculosis - збудник туберкульозу у людей. Ці мікобактерії дають первинний ріст при посіві патологічного матеріалу від 3-х тижнів до 2-х місяців рідко - до 2 5 місяців. Пасажні культури ростуть швидше. Ріст на щільному яєчному середовищі що містить гліцерин пишний: культури ростуть у виді шорстких r-колоній але можуть бути гладенькими що зливаються між собою s-варіант мають кремовий відтінок. На рідкому живильному середовищі мікобактерії туберкульозу утворюють плівку на поверхні в молодих культурах - тонку в старих - зморшкувату грубу а іноді навіть дають придонний крихкуватий ріст. Температурний оптимум 37-38 град. Цельсію. При 22 град. Цельсію і 45 град. Цельсію не ростуть. Морфолог чно в мазку забарвленому за Цілем-Нільсеном M.tuberculosis що виросли на яєчних середовищах представляються вигляді поліморфних тонких спирто- лугокислотостійких паличок часто зігнутих що лежать під кутом одна до одної а іноді можна навіть бачити невеликі скупчення у вигляді так званих "кіс" часточки від мікроколоній . М.bovis - мікобактерії що викликають туберкульоз у великої рогатої худоби рідко у людей трохи коротші з менш вираженою схильністю до розгалуження морфологічні відмінності від М.tuberculosis не виражені. Культуральні властивості також подібні однак на штучних середовищах ростуть повільніше і тільки при температурі 37 - 38 град. Цельсію. У первинних культурах і на середовищах що не містять пірувату відзначають бідний ріст; колонії дрібні плоскі шорсткуваті. Концентрація гліцерину в середовищі більше ніж 0 75 % впливає негативно на швидкість розмноження M.bovis. Колонії не мають пігменту вони - білого або сірого кольору. Бактеріоскопічно відрізнити їх від M.tuberculosis не представляється можливим. Морфологічно і культурально подібні з M.africanum i BCG - "M.bovis complex" M.bovis BCG M.africanum . M.africanum - основний збудник туберкульозу в Африці. Справжне поширення збудника визначити складно тому що в багатьох лабораторіях його не ідентифікують або плутають з M.bovis. Атипові мікобактерії В даний час атипові мікобактерії привертають все більшу увагу бактеріологів і клініцистів. Зростаюча роль атипових мікобактерій в патології людини деякою мірою пов'язана з неправильним застосуванням антибіотиків атипові мікобактерії характеризуються широким спектром медикаментозної стійкості і потенційною патогенністю для людини і тварин. При виділенні з патологічного матеріалу хворих атипових мікобактерій важливо встановити значення їх у патології. Особливої уваги заслуговують випадки повторного виділення з патологічного матеріалу атипових культур при відсутності в досліджуваному матеріалі M.tuberculosis. Атипові мікобактерії відрізняються від M.tuberculosis рядом ознак в залежності від їх таксономічної належності. Для систематизації атипових мікобактерій користуються угрупуванням Раньона заснованим головним чином на двох ознаках - швидкості росту і пігментоутворенні. За цим угрупуванням всі атипові мікобактерії розділені на 4 групи. Представники перших 3-х груп ростуть повільно. 4-ї групи ростуть швидко. Найбільш патогенні для людини мікобактерії I і III груп. I група - фотохромогенні мікобактерії: М. kansasii M.marinum М.balnei М. simiae M.szulgai. Кислотостійкі палички; при культивуванні звичайно утворюють жовто-жовтогарячий пігмент; колонії виростають протягом 2 тижнів при температурі 37 град. Цельсію і протягом 3 тижнів - при кімнатній температурі. При культивуванні на світлі пігментоутворюючі штами дають більш інтенсивне червоно-жовтогаряче забарвлення колоній. Молоді клітини довгі і порівняно широкі розташовуються стрічками; утворюють S- і R-колонії. Типовий вид - M.kansasii. М. kansasii. Утворюють пігмент кристали b-каротину тільки при рості на світлі. По ступеню шорсткості колоній штами варіюють від SR до RS але можуть бути повністю шорсткуватими R . Для ідентифікації кристалів каротину рекомендується вивчення колоній під малим збільшенням їхня наявність - чітка ознака що відокремлює М.kansasii а також M.marinum від інших видів. У людини викликають туберкульозоподібні ураження легень найбільш часто спостерігають шийні лімфаденіти скрофули і ураження шкіри рідше особливо в ослаблених пацієнтів дисеміновані ураження. M.marinum. Частіше утворюють S-колонії відмінна риса - прискорений ріст при температурі 30-33 град. Цельсію і повна його відсутність при 37-40 град. Цельсію. Швидкість росту у різних штамів варіює від 5 до 15 діб. До 30 0 % штамів дають слабо позитивний ніациновий тест. У людини найбільш часто викликає ураження верхніх і нижніх кінцівок. II група - скотохромогенні мікобактерії: M. scrofulaceum; M.aquae М.gordonae - M.aquae I типу - "водопровідні мікобактерії" M.aquae II типу - M.gordonae; M.flavescens. Варіабельні кислотостійкі палички частіше утворюють S-колонії плоскі чи з гострою верхівкою у пігментоутворюючих штамів колонії забарвлені в жовто-жовтогарячі тони незалежно від культивування на світлі чи в темряві забарвлення на світлі більш інтенсивне . M. scrofulaceum. Умовно-патогенні мікобактеріі що повільно ростуть через 2 тижні утворюють жовті колонії. Мікроколонії округлі утворені безладно розташованими паличками як купка висипаних сірників . Викликають у дітей ураження лімфовузлів і легень. За характером росту і морфологією нагадують сапрофіти M.aquae М.gordonae і M.flavescens. Для їхньої диференціальної діагностики звичайно використовують тести стійкості до 5 0 % розчину NaCl гідролізу твін-80 і відновлення нітратів а також амідазний тест що диференціює M.aquae I типу "водопровідні" мікобактерії і M.aquae II типу M.gordonae . III група - нефотохромогенні мікобактерії: М.avium M.intracellulare M.xenopi M.haemophilum. Видимий ріст культур виявляється вже через 5 - 10 діб і більше звичайно утворюють кремові іноді напівпрозорі гладенькі S-колонії що добре емульгуються у воді. При старінні культур колонії деяких штамів можуть набувати жовтогарячого забарвлення пігментація не залежить від експозиції на світлі . Ніациновий тест негативний. М.avium. Викликає до 3 0 % захворювань на туберкульоз людини. Морфологічно і культурально аналогічна M.intracellulare і утворює з нею комплекс avium-intracellulare. Морфологічно представлені тонкими слабо гіллястими паличками мікроколонії зірчасті що трансформуються в округлі утворення з безладно розташованими бактеріями. В умовах лабораторії диференціювати М.avium і М.intracellulare важко. Перша добре росте при температурі 45 град. Цельсію а друга не дає росту протягом 3 тижнів. Від сапрофітних видів їх диференціюють по стійкості до 5 0 % розчину NaCl і нездатності гідролізувати твін-80. Лікування уражень викликаних комплексом avium-intracellulare представляє велику проблему у порівнянні з іншими туберкульозоподібними ураженнями тому що збудники виявляють множинну хіміорезистентність. M. xenopi. Молоді культури ростуть у вигляді непігментованих колоній пізніше з'являється пігмент жовтого кольору. Морфологічно - довгі ниткоподібні палички. Ростуть при 40-45 град. Цельсію умовно-патогенні для людини. M.haemophilum. Виявляє унікальну для мікобактерій здатність до росту на 5 0 % кров'яному агарі також на середовищі Льовенштайна-Єнсена доповненому 2 0 % цитратом амонійного заліза . Викликає рідкі випадки гнійних лімфаденітів у дорослих осіб з імунодефіцитами та у дітей без імунодефіциту. IV група - мікобактерії що швидко ростуть: M.phlei M.smegmatis M.malmoense M.chelonae M.abscessus M. fortuitum M.minetti M.friedmanii і ін. - сапрофітні види клінічне значення мають лише два останніх види. Ростуть у вигляді пігментних або безпігментних колоній частіше в R-формі. Гарний ріст дають протягом 2-5 днів при 25 град. Цельсію. Найважливіша диференціальна ознака - здатність рости при температурі 45 град. Цельсію і вище та прискорювати свій ріст при температурному оптимумі. Непігментовані колонії виростають при посіві малих кількостей матеріалу. Пігментоутворення як відмінна ознака класифікації Раньона у даної групи мікобактерій непридатне тому що на утворення пігменту впливає склад середовища вік культури повторні пасажі є природні пігментоутворюючі варіанти. M. fortuitum M.minetti . Ріст у субкультурах на яєчному середовищі з'являється на 2-4 добу у вигляді "розетки". Морфологічно - короткі палички. На середовищі Льовенштайна-Єнсена можуть поглинати фарбу й забарвлюватися в зелений колір. Потенційно-патогенні для людини. 3.2 Диференціація мікобактерій 3.2.1 Культуральні тести Принцип. Для диференціювання M.tuberculosis і M.bovis від інших мікобактерій можна використовувати здатність атипових і сапрофітних мікобактерій до росту на середовищі Льовенштайна-Єнсена з 500 0 мкг/мл саліциловокислого натрію або паранітробензойної кислоти доданої до середовища в тій же концентрації а також ріст на середовищі з 10 0 мкг/мл тіоацетазону тібону . Ці речовини інгібують ріст М.tuberculosis та M.bovis на відміну від інших мікобактерій що ростуть добре в їх присутності. Контролем служить середовище без препаратів. 3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм Інгредієнти. 1. Натрій саліциловокислий. 2. Етиловий спирт 96 %. 2. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100 0 мл до згортання . Середовище з саліциловокислим натрієм готують так: наважку 50 0 мг препарату висипають в пробірку заливають 1 0 мл етилового спирту для дезинфекції додають 2 0 мл стерильної дистильованої води і виливають в 97 0 мл середовища Льовенштайна-Єнсена до згортання . Ретельно розмішують. Тепер середовище містить 0 5 мг препарату в 1 0 мл тобто 500 0 мкг/мл. Розливають у пробірки приблизно по 5 0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 град. Цельсію протягом 30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові. 3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою Інгредієнти: 1. Паранітробензойна кислота. 2. Етиловий спирт 96 %. 3. Їдкий натр. 4. Соляна кислота. 5. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100 0 мл до згортання . 50 0 мг паранітробензойної кислоти добре розтирають у ступці товкачиком додають 1 0 мл етилового спирту 4 0 мл дистильованої води і 20-24 краплі 4 0 % NaOH до рН - 8 0 по індикаторному папірцю . Після цього додають 1-2 краплі 10 0 % HCl до рН - 7 0. Усе це додають до 95 0 мл яєчного середовища попередньо профільтрованого. Одержують концентрацію паранітробензойної кислоти 500 0 мкг/мл. Розливають у пробірки приблизно по 5 0 мл. Згортають в скошеному вигляді при 85 град. Цельсію протягом 20-30 хвилин в апараті для згортання сироватки крові. 3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном тібоном Принцип. Тіоацетазон тіосемікарбазон пара-ацетамінобензальдегід протитуберкульозний препарат. М.tuberculosis та M.bovis чутливі до цього препарату тоді як інші мікобактерії за винятком M. kansasii до нього стійкі. Інгредієнти. 1. Тіоацетазон тібон . 2. Етиловий спирт 96 %. 3. Середовище Льовенштайна-Єнсена - 100 0 мл до згортання . Готують розчин тіоацетазону що містить 1000 0 мкг/мл препарату. Для цього до наважки 10 0 мг тібону висипаної в пробірку додають 1 0 мл етилового спирту і 9 0 мл стерильної дистильованої води отримують розведення 1 0 мг/мл 1000 0 мкг/мл . 1 0 мл цього розведення додають до 99 0 мл яєчної маси - одержують концентрацію тібону 10 0 мкг/мл і розливають у пробірки по 5 0 мл. Середовище в пробірках згортають в скошеному вигляді в апараті для згортання сироватки крові при 85 град. Цельсію протягом 30 хвилин. Всі три описані тести здатність росту на середовищах із саліциловокислим натрієм та паранітробензойною кислотою а також тібоном служать для відрізнення М.tuberculosis та M.bovis від атипових мікобактерій. Варто згадати ще про один простий тест що у комплексі з вказаними вище дозволяє диференціювати збудників туберкульозу від атипових мікобактерій - це толерантність деяких видів мікобактерій до NaCl. 3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NaCl Принцип. Метод грунтується на здатності атипових мікобактерій ІУ групи рости на середовищі з 5 % NaCl. Крім цієї групи на даному середовищі ростуть тільки M.terrae complex включає M.triviale M.terrae M.nonchromogenicum III група і M.flavescens II група а також деякі мікобактерії I групи M.marinum . Всі інші мікобактерії у тому числі M.tuberculosis і M.bovis на цьому середовищі не ростуть. Інгредієнти. 1. Натрій хлористий хімічно чистий . 2. Сольова основа середовища Льовенштайна-Єнсена. 3. Яєчна суміш середовища Льовенштайна-Єнсена. До сольової основи середовища Льовенштайна-Єнсена додають хлористий натрій із розрахунку 5 0 г на 100 0 мл сольової основи 5 0 % . Отриманий розчин стерилізують при 121 град. Цельсію 20 хвилин. Далі готують середовище як указано в рецепті приготування середовища Льовенштайна-Єнсена. На всі вказані вище середовища засівають по 0 2 мл зависі досліджуваної культури. 3.2.1.5 Виявлення корд-фактора Крім росту на цих середовищах використовують здатність мікобактерій по-різному рости на рідких живильних середовищах. Атипові мікобактерій ростуть дифузно у вигляді кучок на відміну від істинних туберкульозних мікобактерій що ростуть плівкою або придонно мають корд-фактор і ростуть у вигляді "кіс" "джгутів" "вусів" у тісному переплетенні окремих паличок одна з одною. Це може служити диференціальною ознакою. Проте стійкі до препаратів групи ГІНК мікобактерії туберкульозу цілком або частково втрачають корд-фактор. Тому для диференціації туберкульозних культур від атипових визначення корд-фактору треба використовувати в комплексі з іншими тестами. Для відрізнення M.tuberculosis від інших мікобактерій М.bovis і атипових мікобактерій використовують різноманітні біохімічні методи що у комплексі з біологічним методом дозволяють ідентифікувати культури. 3.2.2 Біохімічні методи дослідження Для відрізнення M.tuberculosis від інших мікобактерій а також для розрізнення М.tuberculosis від М.bovis проводять наступні визначення: 1 вміст ніацину 2 нікотинамідазної активності 3 нітратредуктазної активності 4 каталазної і пероксидазної активності. 3.2.2.1 Ніациновий тест Є одним з основних. Він дає можливість відрізнити M.tuberculosis від інших мікобактерій. Принцип. Відомо що M.tuberculosis синтезують нікотинову кислоту ніацин у 10 разів більше ніж M.bovis або атипові. На цій підставі були запропоновані хімічні методи визначення нікотинової кислоти за допомогою ціанистих сполук з якими нікотинова кислота дає яскраво-жовте забарвлення. Цей тест одержав назву ніацинового. Порівняльне вивчення різноманітних методів визначення ніацину показало що найбільш результативним із них є модифікований метод Беніні і Лиюбоа дещо модифікований і описаний Є.І.Тюрі і М.Є.Тюрі Лабораторное дело. - 1964. - № 7 . Вказаний метод визначення ніацину вимагає для роботи застосування ціанистого калію робота з яким повинна проводитися під витяжною шафою і вимагає певних умов що обмежує широке застосування цього тесту. У зв'язку з цим особливої уваги заслуговує метод визначення ніацину паперовими смужками запропонований Кубика і Кильбурн у модифікації Бараускене Проблемы туберкулеза. - 1973 . Визначення ніацину паперовими смужками. Перевага цього методу - у використанні замість ціанистого калію роданистого калію - речовини нелеткої і більш доступної для бактеріологічних лабораторій а також у швидкості реакції що дозволяє через 3-4 години дати відповідь про належність культури що виросла на щільному середовищі до M.tuberculosis або до інших мікобактерій. Принцип методу полягає в екстракції ніацину з мікобактерій дистильованою водою і визначення його за допомогою паперових смужок просочених реактивами. Приготування реактивів. 1. 20 0 % розчин ПАСК. У пробірку наливають 1 75 мл 95% спирту 0 25 мл диметилсульфоксиду димексиду і додають 400 0 мг ПАСК. Суміш підігрівають на водяній бані при 56 град. Цельсію протягом 5-10 хвилин при періодичному струшуванні до повного розчинення ПАСК. 2. 60 0 % розчин роданистого калію. Наважку 1 5 г роданистого калію розчиняють у пробірці з 2 5 мл 8 0 % розчину лимонної кислоти 200 0 мг лимонної кислоти і 2 5 мл дистильовані води . 3. 50 0 % розчин хлораміну "Б". 3 125 г хлораміну "Б" розчиняють у 6 25 мл дистильованої води на водяній бані при температурі 56 - 60 град. Цельсію при струшуванні. Гарячий розчин капають на смужки. 4. Індикаторні смужки готують із фільтрувального паперу Filtrak 11. Один кінець смужки розміром 60 x 8 мм відзначають простим олівцем. Відтягнутими пастерівськими піпетками на папір наносять по одній краплі свіжоприготованих реактивів у наступному порядку: 20 0 % розчин ПАСК - на позначений олівцем кінець 60 0 % розчин роданистого калію - посередині смужки і 50 0 % розчин хлораміну УБФ - на інший кінець. Між краплями повинні залишатися сухі проміжки. Папірці висушують при кімнатній температурі в темряві протягом 24 годин після чого зберігають їх у холодильнику в пробірках закритих гумовими корками. Індикаторні смужки залишаються активними протягом 3-х місяців. Для одержання більш чіткої реакції рекомендується наносити повторно 1 краплю хлораміну "Б" на вже висохлу краплю. Хід дослідження. Водяний екстракт мікобактерій одержують шляхом додавання в пробірку з культурою 1-1 5 мл дистильованої води і витримування пробірок у горизонтальному положенні щоб усі колонії добре відмилися водою протягом 2-3 годин у термостаті. Потім 0 6 мл екстракту мікобактерій відсмоктують мірною піпеткою в пробірку. Індикаторну смужку поміщають кінцем поміченим олівцем у пробірку з 0 6 мл досліджуваного екстракту мікобактерій. Пробірку закривають гумовою коркою і погойдують поки уся смужка не просочиться екстрактом. При позитивному ніациновому тесті через 16-30 хвилин рідина забарвлюється в яскраво-жовтий колір. Дегазація пробірки після проведення реакції здійснюється шляхом додавання 10 0 % розчину нашатирного спирту. Використання паперових смужок для визначення ніацину дає можливість застосовувати цей тест в усіх практичних лабораторіях. В даний час існують комерційні набори готових папірцевих смужок для проведення ніацинового тесту що значно його спрощує і стандартизує. 3.2.2.2 Визначення амідазної активності Принцип визначення амідазної активності базується на дезамінуванні амідів і виділенні аміаку що визначається спеціальними реактивами. Існує два методи визначення амідазної активності - кількісний біохімічний за Бьоніке і якісний бактеріологічний за Таке . Метод Бьоніке Амідний ряд за Бьоніке включає 10 амідів але в лабораторній практиці можна користуватися трьома амідами: сечовина нікотинамід і піразинамід. За Бьоніке розчини амідів варто готувати виходячи з наступних кількостей аміду на 100 0 мл дистильованої води: сечовина - 9 8 мг нікотинамід - 20 0 мг піразинамід - 20 0 мг. Хід реакції визначення амідазної активності біохімічним методом приведений на прикладі нікотинамідазної активності. Визначення нікотинамідазної активності Принцип. Нікотинамідаза - це одна з ациламідаз. Вона сприяє переходові нікотинаміду в нікотинову кислоту - ніацин. При цьому звільняється аміак що уловлюється відповідними реактивами. Наявність нікотинамідази поряд із позитивним ніациновим тестом свідчить про належність мікобактерій до M.tuberculosis. Реактиви. 1. Феноловий реактив. Розчинити 25 0 г кристалічного фенолу в 10 0 мл води додати при помішуванні 54 0 мл 25 0 % розчину NaOH 25 0 г NaOH + 75 0 мл дистильованої води і довести об'єм до 100 0 мл. Зберігати на холоді в пляшці із темного скла. 2. Розчин гіпохлориту. Розмолоти 25 0 г хлорного вапна просіяти і розчинити в 300 0 мл дистильованої води додати при помішуванні 135 0 мл водного розчину вуглекислого калію 20 0 г безводної солі К2СО3 у 100 0 мл дистильованої води попередньо прокип'яченої для видалення аміаку старанно розмішати швидко нагріти до 90 град. Цельсію остудити і довести до 500 0 мл. Фільтрують невелику частину суміші і випробовують на присутність іонів кальцію. Якщо проба позитивна розчин каламутніє то додають ще вуглекислого калію до одержання негативної проби розчин - прозорий . Профільтрувати суміш і зберігати розчин у холодильнику у невеликих пляшках із темного скла. Реактив може зберігатися в холодильнику 1-2 місяці. 3. Водний розчин нікотинаміду - 200 0 мкг/мл. Для цього 20 0 мг нікотинаміду розчиняють у 100 0 мл дистильованої води. 4. 1/15 М фосфатний буфер рН-7 2. 5. 0 07 % MnSO4. Хід дослідження. До 0 5 мл густої бактеріальної зависі 20 0 мг/мл змішують за допомогою струшувача типу ВОРТЕКС у 0 5 мл 1/15 М фосфатного буфера рН-7 2 додають 0 5 мл розчину нікотинаміду. Суміш витримують у термостаті 15-16 годин. Потім визначають аміак по Расселу. Для цього до суміші додають 0 2 мл 0 07 % MnSO4 2 0 мл фенолового реактиву в 1 мл гіпохлориту. Пробірки поміщають у водяну баню при 100 град. Цельсію на 15-20 хвилин. Поява синьо-зеленого забарвлення свідчить про наявність у середовищі аміаку отже про належність культури до M.tuberculosis. Контролем є пробірка з 0 5 мл нікотинаміду і 0 5 мл буферу яку також поміщають у термостат. У контрольній пробірці реакція на аміак повинна бути негативною. У випадку появи блідо-блакитного забарвлення воно враховується при оцінці результатів у дослідній пробірці. Метод Таке Іншим способом визначення амідазної активності є бактеріологічний якісний тест Таке. Принцип методу полягає в появі специфічного іржавого забарвлення при додаванні реактиву Несслера до зрілих культур МБТ які виросли на агаровому середовищі яке містить аміди що і є свідченням про достатнє утворення ацетиламідази мікобактеріями в процесі їх росту. Реактиви 1. Нікотинамід. 2. Піразинамід. 3. Сечовина. 4. Реактив Несслера. 5. Агарове середовище: пептон натрій хлористий глюкоза калій фосфорнокислий однозаміщений KH2PO4 гліцерин. Хід дослідження. Приготування агарового середовища: 1 0 г пептону 20 0 г агар-агару або агару Діфко 5 0 г NaCl 0 1 г глюкози 2 0 г KH2PO4 10 0 мл гліцерину розчиняють у дистильованій воді при нагріванні доводячи кінцевий об'єм до 1 0 літра рН - 6 9. Гаряче середовище розливають по пробірках і автоклавують при 120 град. Цельсію 30 хвилин. Після стерилізації агар у пробірках скошують. Готують розчини амідів у дистильованій воді: сечовина - 40 0 мг/мл нікотинамід - 30 0 мг/мл піразинамід - 20 0 мг/мл. Розчини нікотинаміду і піразинаміду стерилізують у водяній бані при 100 град. Цельсію протягом 30 хвилин. Розчин сечовини фільтрують через бактеріальний фільтр Зейця . Стерильний розчин амідів вносять по 0 25 мл у пробірки з живильним середовищем і лишають останні в горизонтальному становищі 2-3 доби так щоб розчин всмоктався в поверхню живильного середовища. За підрахунками кількість сечовини нікотинаміду і піразинаміду на 1 0 кв. см поверхні середовища складає відповідно - 1000 750 і 500 мкг/кв. см . У пробірки з амідами засівають 0 2 мл густої зависі культури випробовуваних мікобактерій 1 0 мг/мл . Посіви інкубують при 37 град. Цельсію. Як тільки з'явиться ріст через 2-3 тижні додають 0 5 мл реактиву Несслера. Поява іржавого забарвлення свідчить про позитивну реакцію про наявність у бактерій відповідної амідази . Контролем є посіви в пробірках без амідів. Різні види мікобактерій відрізняються по ферментативній активності стосовно різних амідів. Ці розходження подані в табл. 3.2. Таблиця 3.2 - Амідазна активність окремих видів мікобактерій Група За Раньоном Види Аміди Мікобактерій Сечовина Нікотинамід Піразинамід М. Tuberculosis + + + M. Bovis + - - I M. Kansasii + + - II M. Gordonae m. Aquae -/+ - - II M. Scrofulaceum + + + III M. Avium - + + III M. Xenopi - + + III M. Intracellulare - + + III M. Terrae - + + IV M. Fortuitum + +/- +/- IV M. Smegmatis + + + IV M. Phlei + + + Позначення: + реакція позитивна - реакція негативна                 +/- реакція може бути позитивною або негативною Для штамів кислотостійких сапрофітів що швидко ростуть IV група характерною є наявність формамідазної активності. Цей фермент відсутній у M.tuberculosis й у більшості атипових мікобактерій які класифіковані за Раньоном. Принцип реакції полягає в здатності формамідази розщеплювати формамід з утворенням аміаку виділення якого уловлюється в реакції з фенолом і гіпохлоритом. Хід дослідження модифікована методика Дихно аналогічний реакції на нікотинамідазу. Використовується 0 2 мл формаміду на 250 0 мл дистильованої води. Для проведення реакції необхідно мати інгредієнти високої якості. 3.2.2.3 Визначення нітратредуктазної активності При диференціюванні мікобактерій туберкульозу користуються також реакцією відновлення нітратів у нітрити. Реакція відновлення нітратів дає можливість диференціювати M.tuberculosis які мають нітратредуктазу від M.bovis M.avium і від деяких атипових у яких цей фермент відсутній. Виняток складають фотохромогенні мікобактерії М. kansasii і деякі з III і IV груп. Принцип. Активність нітратредуктази визначається по кількості відновленого з нітрату нітриту що дає кольорову реакцію з пара-диметиламінобензальдегідом. Реактиви. 1. 0 067 М фосфатний буфер рН-7 1 що містить 0 1 % нітрату натрію. 2. 2 0 % розчин вага/об'єм пара-диметиламінобензальдегіду в 10 0 % HCl. 3. 10 0 % розчин соляної кислоти. Для реакції використовують 3-4-тижневі культури вирощені на яєчному середовищі. Хід дослідження. 50 0 мг вологої ваги 3 - 4-тижневої культури суспендують в 5 0 мл можна суспендувати 10 0 мг культури в 1 0 мл 0 067 М фосфатного буферу рН - 7 1 що містить 0 1 % нітрату натрію і інкубують при 37 град. Цельсію 15 - 16 годин. Утворення нітриту перевіряється додаванням 2 крапель 2 0 % розчину пара-диметиламінобензальдегіду в 10 0 % HCl + 1 0 мл 10 0 % HCl. Поява жовтого забарвлення свідчить про належність культури до M.tuberculosis метод Тсукамура . Крім активності вказаних ферментів для відрізнення M.tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій можна використовувати різну активність окисно-відновних ферментів. 3.2.2.4 Диференціація мікобактерій за окисно-відновними ферментами У окисно-відновних процесах мікробної клітини активну участь приймають такі ферменти як каталаза і пероксидаза. У M.tuberculosis і M.bovis чутливих до препаратів групи ГІНК гідразиду ізонікотинової кислоти виявляється активність обох ферментів паралельно. При цьому у чутливих культур спостерігається швидке активне виділення пухирців кисню обумовлене діяльністю каталази і забарвлення колоній у темно-коричневий колір обумовлене діяльністю пероксидази. Поява коричневого пігменту пояснюється переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази. У культур M.tuberculosis стійких до препаратів групи ГІНК активність цих ферментів різко знижена при визначенні каталазної активності пухирці кисню виділяються в невеликій кількості повільно або майже відсутні а при визначенні активності пероксидази колонії або ледь забарвлюються або при високому ступені стійкості до ізоніазиду залишаються безбарвними. На відміну від M.tuberculosis у атипових мікобактерій незалежно від стійкості до ГІНК каталазна активність завжди різко позитивна пероксидазна ж як правило не виявляється. Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно модифікована методика Богена Принцип каталазної реакції полягає в розщепленні перекису водню ферментом каталазою на воду й атомарний кисень що супроводжується виділенням пухирців кисню і переходом пірогалолу в пурпурогалин в присутності перекису водню під впливом пероксидази. Реактиви. 1. 0 5 % пірогалол: 50 0 мг чистого пірогалолу розчинити в 10 0 мл дистильованої води. 2. 2 0 % пергідроль. 0 2 мл пергідролю розвести в 10 0 мл дистильованої води. Обидва розчини готують безпосередньо перед дослідом змішують і наливають у пробірку так щоб покрити культуру. Хід дослідження. Обидва розчини зливають у колбу в рівній кількості і наливають по 6 0 - 8 0 мл суміші у пробірку з культурою. В залежності від кількості культур що перевіряють об'єм розчинів які готуються відповідно збільшують. Облік реакції активності каталази проводять через 5 хвилин по активному виділенню пухирців кисню. Реакцію на пероксидазу враховують через 1 5-2 години по забарвленню колоній у темно-коричневий колір. Ступінь активності каталази позначають по 3-бальній системі: - +++ рясне виділення пухирців кисню в 1-шу хвилину; - ++ помірне виділення пухирців кисню; - + поодинокі пухирці. При відсутності пухирців реакція вважається негативною - . Активність пероксидази оцінюється також по 3-бальній системі: - +++ темно-коричневе забарвлення колоній; - ++ коричневе забарвлення колоній; - + блідо-коричневе забарвлення колоній. При негативній реакції колір колоній не змінюється. Цінною реакцією для відрізнення M.tuberculosis від атипових мікобактерій є проба на термостабільність каталази. Термостабільність каталази Каталаза у кислотостійких мікобактерій різна. У вірулентних мікобактерій вона швидко і легко руйнується при нагріванні до 65 - 68 град. Цельсію. У атипових мікобактерій і кислотостійких сапрофітів вона термостабільна. Визначення активності термостабільної каталази Готують 3 0 мл густої зависі мікобактерій. 1 5 мл зависі переносять у центрифужну пробірку яку нагрівають на водяній бані при 68 град. Цельсію протягом 10 хвилин. Потім пробірку охолоджують і на предметне скло наносять по 1 краплі зависі: на один кінець - непрогріту служить контролем на другу - завись після нагрівання. До цих двох зависів додають по 1 краплі пергідролю. Утворення пухирців свідчить про активність ферменту відсутність - про пригнічення. На підставі цієї реакції легко відрізнити M.tuberculosis у яких каталаза завжди термолабільна від більшості атипових і кислотостійких сапрофітів із різко термостабільною каталазою. Термостабільність каталази так само як і її активність враховується по 3-бальній системі. Співвідношення окисно-відновних ферментів у різних видів мікобактерій показане в табл.3.3. Таблиця 3.3 - Ідентифікація мікобактерій по окисно-відновним ферментам і ніациновій пробі Мікобактерії Каталаза Пероксидаза Термостабільність каталази Ніацинова проба Атипові + + + - + - M.tuberculosis чутливі до ізоніазиду + + + + - + M.tuberculosis стійкі до ізоніазиду + + - - - + M.bovis + + ++ - - 3.2.2.5 Реакція гідролізу твіну-80 Важливою реакцією для ідентифікації мікобактерій всередині II і III груп за Раньоном є реакція гідролізу твіну-80. Твін-80 зв'язує нейтральний червоний і суміш до реакції має солом'яно-жовтий колір. Принцип реакції - у ензимному гідролізі твіну-80. При цьому відбувається звільнення нейтрального червоного і забарвлення відновлюється від рожевого до червоного. Позитивна реакція відзначається у M.aquae на відміну від M.scrofulaceum у яких реакція негативна а з III-ї групи вона позитивна тільки у M.terrae. Реактиви. 1. 1/15 М фосфатний буфер рН - 7 - 100 0 мл. 2. Твін - 80 - 0 5 мл. 3. Основний нейтральний червоний 0 1 % - 2 0 мл. Краще розчинити 0 1 г нейтрального не в 100 0 а в 85 0 мл дистильованої води. Змішати усі три реагенти. Розлити по 4 0 мл у пробірки й автоклавувати при 120 град. Цельсію 15 хвилин. Протягом доби перевіряють на стерильність у термостаті і зберігають у холодильнику. Стабільність розчину - не більше 2-х тижнів. Хід дослідження. Емульгують 3 бактеріологічні лопатки культури в пробірках із приготованим субстратом твін-80 із нейтральним червоним . Пробірки поміщають у термостат. Реакцію перевіряють через 4 години на 5-у і 10-у добу. Тест вважається позитивним якщо рожево-червоне забарвлення з'явилося до 10-ої доби негативним якщо забарвлення не з'явилося модифікована методика Вайна . Контролем є пробірка з середовищем без реактивів. 3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій При описанні біохімічних тестів ми зупинилися на найбільш простих пробах що дають можливість відрізнити M.tuberculosis від атипових і розрізняти деякі види атипових мікобактерій всередині груп Раньона. При диференціації мікобактерій варто пам'ятати що крім використання комплексу тестів застосованих при вивченні атипових культур необхідно користуватися обов'язковими для кожного виду тестами так звані ключові тести проведення яких полегшує ідентифікацію культур. Наводимо ключові тести для окремих видів мікобактерій табл.3.4 . Крім перерахованих тестів для всіх безпігментних культур необхідно визначати ніацинову пробу і якщо вона негативна перевіряти амідазну активність. Використання описаних тестів дає можливість розділити атипові культури на патогенні для людини і випадкові супутні сапрофіти які не впливають на захворювання. Для клініки особливе значення мають наступні види атипових мікобактерій: M.kansasii M.marinum M.scrofulaceum M.xenopi M.avium M.intracellularae M.fortuitum Для атипових мікобактерій крім вказаних нами особливостей швидкості росту пігментоутворення морфології колоній і паличок температурного оптимуму характерними являються: негативна ніацинова проба відсутність пероксидазної активності при високій активності каталази виражена термостабільність каталази у більшості мікобактерій ріст на живильних середовищах із паранітробензойною кислотою і саліциловокислим натрієм відсутність в більшості випадків корд-фактору. Характерним також для атипових мікобактерій є первинна стійкість до більшості антимікобактеріальних препаратів. Для відрізнення М.tuberculosis і М.bovis від нетуберкульозних мікобактерій відмінності їх один від одного а також для розрізнення атипових мікобактерій всередині груп зручно користуватися розміщеними нижче схемами. Види мікобактерій Тести Результати тесту властиві для даного виду мікобактерій M.tuberculosis Швидкість росту Ніацин Відновлення нітратів Каталаза при 68 град. Цельс. Утворення пігменту в темряві Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл ПНБ Повільний + + - - - M.bovis Швидкість росту Ніацин Відновлення нітратів Каталаза при 68 град. Цельс. Утворення пігменту в темряві Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл ПНБ Повільний - - - - - M.kansasii Швидкість росту Відновлення нітратів Каталаза при 68 град. Цельс. Утворення пігменту після освітлення Гідроліз твіну-80 Повільний + + + + M.scrofulaceum Швидкість росту Каталаза при 68 град. Цельс. Утворення пігменту в темряві Гідроліз твіну-80 Повільний + + - M. Gordonae m.aquae Швидкість росту Відновлення нітратів Утворення пігменту в темряві Гідроліз твіну-80 Повільний - + + M.xenopi Швидкість росту Відновлення нітратів Утворення пігменту в темряві Гідроліз твіну-80 Повільний - + - M.avium Швидкість росту Ніацин Відновлення нітратів Гідроліз твіну-80 Повільний - - - M.intracellulare Швидкість росту Ніацин Відновлення нітратів Гідроліз твіну-80 Повільний - - - M.gastri Швидкість росту Ніацин Відновлення нітратів Каталаза при 68 град. Цельс. Утворення пігменту на світлі Гідроліз твіну-80 Повільний - - - - + M.terrae Швидкість росту Ніацин Відновлення нітратів Каталаза при 68 град. Цельс. Утворення пігменту на світлі Гідроліз твіну-80 Повільний - + - + M.fortuitum Швидкість росту Відновлення нітратів Утворення пігменту в темряві Толерантність до 5 % NaCl Швидкий + - + M.smegmatis Швидкість росту Утворення пігменту в темряві Толерантність до 5 % NaCl Швидкий - + M.phlei Швидкість росту Утворення пігменту в темряві Толерантність до 5 % NaCl Швидкий + + Схема 3.1 - основні тести для відрізнення m.Tuberculosis m.Bovis від інших мікобактерій Тести М.Tuberculosis М.bovis Інші Мікобактерії Ніациновий тест + - - Ріст на середовищі льовенштайна-єнсена із 500 0 мкг/мл паранітробензойної кислоти або саліциловокислого натрію - - + Реакція на термостабільність каталази - - + Каталазна активність у гінк-резистентних штамів + + - - + - + - + + + Схема 3.2 - основні тести що відрізняють m.Tuberculosis від m.bovis Тести M. Tuberculosis M. Bovis Ніацинова проба + - Нікотинамідаза + - Відновлення нітратів + - Схема 3.3 - I група - фотохромогенні мікобактерії 25 град. Цельсію 37 град. Цельсію 45 град Цельсію Відновлення нітратів Гідроліз твіну-80 M.kansasii + + - - + + M.simiae + + - - - + M.marinum + + - - - - Для розрізнення всередині групи необхідні наступні тести: утворення пігменту гідроліз твіну-80 ніацинова проба M.simiae + - відновлення нітратів ріст при 25 і 37 град. Цельсію. Схема 3.4 - II група - скотохромогенні мікобактерії Штами 25 град. Цельсію 37 град. Цельсію 45 град Цельсію Відновлення нітратів Уреаза Гідроліз твіну - 80 M.aquae m.gordonae + + - - - + + M.aquae + + - - - - + M.scrofulaceum + + - - - + - Схема 3.5 - III група - нефотохромогенні мікобактерії основі тести 25 гр Цельс 45 гр Цельс Відновлення нітратів Гідроліз твіну-80 Каталаза 68 град. Цельс. Амідазна активність M.avium + - + - - - + Н; п M.intracellu lare + - + - - - + Н; п M.terrae + - + + + 0 M.triviale + - + + + Н; п; 0* M.xenopi - + - - + Н; п m. Terrae вайна - 0; M.terrae Тсукамура - Н; П Н - нікотинамід П - піразинамід 0 - негативна реакція. Схема 3.6 - IV група - мікобактерії що швидко ростуть основні тести 25 град. Цельсію 37 град. Цельсію 45 град. Цельсію 52 град. Цельсію Гідроліз твіну-80 M.fortuitum + + - - + - M.phlei + + + + + M.smegmatis + + + - + 3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких бактерій Крім широкого використання для диференціації культур біохімічних тестів при встановленні видової належності культур користуються біологічним методом. Відомо що чутливість експериментальних тварин до M.tuberculosis M.bovis i M.avium - різна. Тому в лабораторній практиці експериментальні дослідження проводять на морських свинках кроликах білих мишах і курах. Для зараження морських свинок під шкіру користуються двома дозами: 0 1 мг і 0 01 мг; кроликів - внутрішньовенно 0 1 мг і 0 01 мг і білих мишей - внутрішньовенно дозою 0 1 мг. Курей заражають у вену крила 0 1 мг і 1 0 мг. М.tuberculosis чутливі до препаратів ГІНК призводять до загибелі морських свинок до 2-3-х місяців і білих мишей до 20-30-ої доби. На секції у свинок - картина важкого генералізованого туберкульозу з ураженням внутрішніх органів і лімфатичних вузлів у білих мишей - ураження легень. М.bovis викликають загибель кроликів до 1 5-2-х місяців із ураженням нирок легень а також морських свинок приблизно через 2 місяці і білих мишей на 20-30-у добу . M.avium призводять до загибелі курей на 30-50-у добу кроликів на 20-40-у добу а у білих мишей викликають ураження легень печінки і збільшення селезінки. У свинок відзначається лише інфільтрат під шкірою на місці введення культури а іноді - невелике збільшення регіонарних лімфатичних вузлів. Варто пам'ятати що у курей і кроликів туберкульозні ураження на органах частіше всього відсутні. На секції у кур видно різко збільшену печінку а у кроликів - також і селезінку. Підтвердженням того що причиною загибелі тварин були М.avium є мазки - відбитки з печінки селезінки і кісткового мозку. У препаратах виявляється значна кількість поліморфних кислотостійких мікобактерій. Ідентифікація мікобактерій туберкульозу по культуральним біохімічним і біологічним методам надана в табл.3.5 на стор. 50 . Таким чином для відрізнення мікобактерій туберкульозу від інших кислотостійких мікобактерій використовують комплекс ознак: культуральні властивості відсутність здатності до росту на яєчному середовищі з паранітробензойною кислотою або саліциловокислим натрієм здатність до утворення корд-фактору термолабільність каталази та й ін. Перераховані ознаки відрізняють M.tuberculosis від атипових мікобактерій. Атипові мікобактерії в більшості випадків не патогенні для лабораторних тварин. Патологічні зміни в органах можуть бути отримані в більшості випадків при внутрішньовенному або внутрішньочеревинному зараженні морських свинок кроликів і мишей великими дозами бактерій 1 0 мг і більше . На практиці для відрізнення непатогенних мікобактерій від туберкульозних можна користуватися внутрішньошкірним зараженням морських свинок введенням зависі 0 1 мг мікобактерій у 0 2 мл фізіологічного розчину. На введення М.kansasiі M.scrofulaceum М. intracellulare М. avium і деяких інших розвивається виразка яка самозагоюється на відміну від генералізованого процесу що виникає при внутрішньошкірному введенні M.tuberculosis i M.bovis. При вивченні виділених штамів зустрічаються певні труднощі. Може мати місце одночасне виділення типових і атипових мікобактерій. У такому випадку значення має кратність виділення атипових мікобактерій рясність росту. Особливої уваги заслуговують випадки повторного виділення тільки атипових мікобактерій при відсутності типових. Питання про значення їх у етиології захворювання вирішується на підставі комплексу клініко-рентгено-бактеріологічних досліджень. З усіх приведених методів дослідження жодний сам по собі не може відповісти на запитання про належність штаму до одного із видів. Тільки комплексне застосування ряду бактеріологічних біохімічних біологічних методів дослідження дає можливість правильно ідентифікувати виділені культури. При ідентифікації мікобактерій перед мікробіологами встають наступні питання: чи є виділені мікобактерії туберкульозними і до якого виду вони належать. Якщо виділяються культури відмінні від туберкульозних то необхідно уточнити чи відносяться вони до атипових і до якої групи по Раньону. В залежності від лабораторії що обслуговує туберкульозні заклади об'єм тестів що використовуються при ідентифікації мікобактерій підрозділяється на більш прості і доступні для кожного практичного закладу і більш детальні що включають ряд біохімічних і біологічних досліджень. Останні проводяться у лабораторії при обласному протитуберкульозному диспансері. 1-й комплекс досліджень включає наступні найбільш прості тести на підставі яких вирішується питання про належність штаму до туберкульозних або атипових мікобактерій: - швидкість росту; - утворення пігменту; - каталазо-пероксидазна активність; - термостабільність каталази; - ріст на середовищі з пара-нітробензойною кислотою; - первинна медикаментозна стійкість. 2-й комплекс досліджень включає додаткові бактеріологічні і біохімічні тести: ріст у мікрокультурах утворення ніацину ациламідна активність гідроліз твіну-80 і докладне вивчення культуральних і біологічних властивостей. Біохімічний метод ідентифікації мікобактерій у сполученні з культуральним є швидким доступним і надійним. Він повинен широко застосовуватися в бактеріологічних лабораторіях. У таблиці 3.6 подана ідентифікація ряду видів мікобактерій за комплексом бактеріологічних і біохімічних тестів на стор.50 . Таблиця 3.5 - Ідентифікація мікобактерій туберкульозу культуральними біохімічними біологічними методами Види Мікобак- терій Ріст пасажних культур на різних середовищах  при різних температурах Морфо- логія коло- ній Колір коло- ній Біохімічні тести Вірулентність для тварин Яєчне середо- вище Середо- вище Школь- нікової Агар Гліце- рино- вий Ніаци- новий тест Ката- лаза Віднов- лення нітра- тів Нікотина мідазна актив- ність Корд- фактор Мор- ські сви- нки Кро- лики Миші Кури 25 гр. 37 гр. 45 гр. 37 гр. Ц. 25 гр. 37 гр. M.tuberc ulosis - + - + груба плівка - - R Кре- мовий + + + * + + + + - + - M.bovis - + - + тонка плівка - - Rs Білий сі- рий - + + * - - + + + + - M.avium -/+ + + + придоний ріст - - S Кре- мовий - + + + - - - + - + + + Позначення: + ростуть - не ростуть -/+ деякі культури ростуть; + реакція позитивна - реакція негативна; + вірулентні + - слабо вірулентні - не вірулентні. у чисельнику - більшість штамів у знаменнику - меншість ; * - у штамів чутливих до ізоніазиду. Таблиця 3.6 - ідентифікація кислотостійких мікобактерій бактеріологічними і біохімічними тестами Тести Мікобактерії Туберкульо- зні Атипові I група II група III група IV група M.tube rculos is M.bo vis M.kan sasii M.mar inum M.scrof ulaceum M.gor donae M.avi um M.intrac ellula- rae M.xen opi M.ter rae M.tri viale M.for tui- tim M. phlei M. smegmatis Швидкість росту Повіль но Пові льн. Пові- льн. Пові- льн. Повіль- но Медл. Пові- льн. Повільн. Пові- льн. Пові- льн. Пові- льн. Швид- ко Швид- ко Швидко Ніацин + - - - - - - - - - - - - - Утворення пігменту у темряві - - - - + + - - -/+ - - - + -/+ Утворення пігменту на світлі - - + + - - - - - - - - - - Каталазна активність + + + + + + + + + + + + + + Пероксидазна активність + + - - - - - - - - - - - - Термостабільні сть каталази 680 - - + + + + + + + + + + Гідроліз твіну 80 -/+ - + + - + - - - + + +/- + + Відновлення нітратів + - + - - - - - - + + + + + Уреаза + + + + + -/+ - - - - - +/- + + Нікотинамідаза + - + + + - + + + -/+ - +/- + + Піразинамідаза + -/+ -/+ + + - + + + -/+ - +/- + + Ріст на середовищі з 5 % NaCl - - - - - - - - - - + + + + Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл саліцил. Натрію - - +/- +/- + + +/- +/- +/- + + + + + Ріст на середовищі з 500 мкг/ мл паранітробенз. Кислотою - - +/- +/- + + +/- +/- +/- + + + + + Ріст на середовищі з 2 мкг/ мл тібону - - - - + + + + + + + + + + Утворення корд-фактору + + -/+ -/+ - - - - - - - - - - Ріст на середовищі л.-й. 22-25 гр - - +/- + + + -/+ +/- - + + + + + Те ж 37-38 гр. + + + +/- + + + + + + + + + + Те ж 45 гр.Ц. - - - - - - +/- -/+ -/+ - - - + + Ріст на агарі 22 гр. Цельс. - - - - -/+ +/- - - - - - + + + Те ж 37 гр. Ц. - - - - +/- +/- - - - - - + + + Позначення: Для росту на середовищі: + ріст усіх культур - ріст відсутній +/- більшість культур дають ріст -/+ більшість культур не дає росту. Для утворення пігменту: + культури утворюють пігмент - культури не утворюють пігмент -/+ окремі культури утворюють пігмент. Для біохімічних реакцій: + реакція позитивна - реакція негативна +/- більшість культур дають позитивну реакцію -/+ більшість культур дають негативну реакцію. 4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки BBL MGIT Принцип. Пробірка BBL MGIT для виявлення росту мікобактерій містить модифікований бульйон 7Н9 Міддлбрука доповнений OADC-збагаченням BBL MGIT який підтримує ріст мікобактерій та забезпечує їх виявлення і сумішшю антибіотиків BBL MGIT PANTA. Трубка BBL MGIT містить флуоресцентну сполуку запаяну в силікон на дні круглодонної пробірки розміром 16 0 х 100 0 мм. Ця сполука реагує на присутність кисню розчиненого в бульйоні. Вихідна концентрація кисню не дає яскравого світіння. У випадку присутності в дослідній пробі мікобактерій та їх розмноження відбувається активне поглинання О2 й виділення СО2 що дає можливість спостерігати яскраву флюоресценцію за допомогою 365-нм УФ-трансосвітлювача або довгохвильового УФ-світла лампа Вуда . Реактиви. Індикаторна пробірка BBL MGIT для виявлення росту M.tuberculosis містить 110 0 мкл флуоресцентного індикатора і 4 0 мл бульйону 7Н9 Міддлбрука. Індикатор містить пентагідрат хлористого трис-4 7-дифеніл-1 10-фенантролінрутенію в силіконовій основі. Пробірки промиті 10 0 % СО2 і закриті поліетиленовими ковпачками. Вміст в 1 0 л дистильованої води: модифікований бульйон 7Н9 Міддлбрука - 5 9 г ; казеїновий пептон - 1 25 г ; гліцерин - 3 1 мл. BBL MGIT OADC призначено для збагачення бульйону Міддлбрука з метою швидкого росту мікобактерій і містить 15 0 мл OADC-збагачення. Вміст в 1 0 л дистильованої води: - О - олеїнова кислота - 0 6 г; - А - альбумін бичачий - 50 0 г; - D - декстроза - 20 0 г; - С - каталаза - 0 03 г. Ампула BBL MGIT PANTA містить ліофілізовану суміш антимікробних агентів для пригнічення росту супутньої мікрофлори. Вміст в 1 ампулі ліофілізованої PANTA: поліміксин В - 6000 од.; амфотеріцин В - 600 0 мкг; налидиксова кислота - 2400 0 мкг; триметоприм - 600 0 мкг; азиоцилін - 600 0 мкг. Перед вживанням додати в ліофілізовану ампулу з сумішшю антибіотиків MGIT PANTA 3 0 мл стерильної дистильованої води. Також необхідно перевірити кожну пробірку MGIT з метою виявлення забруднення або пошкодження. Викинути будь-які пробірки якщо вони є непридатними або дають флюоресценцію до використання. Зберігання реактивів. Індикаторні пробірки BBL MGIT для виявлення росту мікобактерій зберігати при 2 - 25 град. Цельсію не заморожувати. Бульйон повинен бути прозорим і безбарвним. Не використовувати бульйон якщо він каламутний. Пробірки MGIT які зберігаються так як вказано на етикетці можна засівати аж до дати закінчення терміну придатності та інкубувати на протязі восьми тижнів. OADC BBL MGIT необхідно зберігати в темряві при 2 - 8 град. Цельсію; уникати заморожування або перегрівання. Не відкривати до вживання. Ампули з ліофілізованою сумішшю антибіотиків зберігати при 2 - 8 град. Цельсію. Після розведення суміш PANTA можна використовувати на протязі 72 годин при 2 - 8 град. Цельсію або на протязі 6 місяців при - 20 або більш низький температурі . Після розморожування суміш PANTA слід використовувати негайно; невикористану частину викинути. Індикаторним експрес-методом на наявність M.tuberculosis можна досліджувати всі види клінічних проб легеневих або позалегеневих крім сечі та крові. Обробку проб слід проводити N-ацетил-L-цистеїном з гідроокисом натрію NALC - NaOH . Хід дослідження. 1. Безпосередньо перед дослідженням приклеїти на пробірку MGIT етикетку з номером проби відкрутити ковпачок пробірки MGIT й в асептичних умовах додати 0 5 мл MGIT OADC і 0 1 мл розведеної суміші антибіотиків MGIT PANTA. 2. Додати 0 5 мл концентрованої суспензії попередньо обробленої проби. Об'єм проби більше 0 5 мл може збільшити обсіменіння неспецифічною мікрофлорою. Після внесення матеріалу пробірки щільно закрити ковпачками і добре перемішати. Інкубувати в термостаті при 37 град. Цельсію. 3. Показання пробірок враховувати щодня починаючи з другого дня інкубації. Для інтерпретації результатів застосовують пробірки з негативним К- і позитивним К + контролем. Як негативний контроль К - використовується закрита незасіяна пробірка MGIT. В К- повинна спостерігатися дуже незначна флюоресценція або зовсім її не повинно бути. Підготовка пробірки для К+: Вилити бульйон Міддлбрука з незасіяної пробірки MGIT наклеїти на пробірку етикетку з написом "Позитивна-контрольна" приготувати 0 4 % розчин сульфіту натрію 0 4 г на 100 0 мл стерильної дистильованої води 5 0 мл цього розчину внести в пробірку MGIT щільно закрити ковпачком й залишити на 1 годину при кімнатній температурі. Контрольні пробірки К + можна використовувати протягом 4 тижнів зберігаючи при кімнатній температурі. В К + повинна спостерігатися яскрава флюоресценція жовтогарячого кольору . Облік показань пробірок. 1. Витягти пробірки з термостату помістити їх під УФ-світло поряд з контрольними пробірками К + і К -. Рекомендується розміщувати під УФ-світлом один штатив з пробірками 4 по 10 пробірок одночасно. 2. Флюоресценція виявляється як яскраво-жовтогарячий відтінок на дні пробірки і дає жовтогаряче відображення на меніску. Потім витягти цю пробірку MGIT з штативу і зрівняти з контрольними пробірками К+ і К-. Якщо флюоресценція в дослідній пробірці MGIT більше схожа на флюоресценцію в контрольній пробірці К+ то ця пробірка з позитивним результатом. Якщо ж флюоресценція більше схожа на флюоресценцію в контрольній пробірці К- то ця пробірка з негативним результатом. Ріст можна також виявити по наявності неоднорідної каламутності дрібних зерен або лусочок в культуральному середовищі. 3. Вміст пробірок з позитивними результатами слід пофарбувати за Цілем-Нільсеном. Наявність в мазку кислотостійких паличок рубінового кольору вказує на передбачувану присутність життєздатних мікобактерій в пробірці. 4. Облік показань пробірок з негативним результатом слід продовжувати щодня на протязі восьми тижнів оскільки флюоресценція в пробірках MGIT може з'явитися протягом певного часу. Пробірки з позитивним результатом можуть містити один або декілька видів мікобактерій. Мікобактерії що швидко ростуть можуть викликати флюоресценцію раніше мікобактерій що ростуть повільно. Цей факт необхідно враховувати при ідентифікації мікобактерій. Морфологію і пігментацію колоній можна визначати лише на щільних середовищах. Матеріал з пробірки MGIT з позитивним мазком кислотостійких паличок можна пересівати як на щільні так і рідкі живильні середовища з метою проведення в подальшому ідентифікації і визначення медикаментозної стійкості. 4.2 Визначення медикаментозної стійкості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів стрептоміцин ізоніазид рифампіцин етамбутол за допомогою системи BBL MGIT AST SIRE Система BBL MGIT AST SIRE являє собою швидкодіючий ручний якісний метод визначення чутливості M.tuberculosis до стрептоміцину ізоніазиду рифампіцину та етамбутолу. Принцип. Індикаторна пробірка BBL MGIT для визначення медикаментозної стійкості M.tuberculosis представляє собою таку ж пробірку як і у випадку для виявлення росту мікобактерій. Система BBL MGIT AST SIRE призначена для якісного аналізу протягом 3 - 14 днів. Цей аналіз грунтується на рості штаму M.tuberculosis в пробірці яка містить антимікобактеріальний препарат при порівнянні з пробіркою без препаратів. Спостереження за пробірками MGIT здійснюють щодня починаючи з третьої доби після інокуляції. Відсутність флюоресценції в пробірці яка містить антимікобактеріальний препарат через дві доби після появи флюоресценції в контрольній пробірці свідчить про чутливість M.tuberculosis до даного антимікобактеріального препарату. Флюоресценція в пробірці яка містить антимікобактеріальний препарат через дві доби або протягом двох діб після появи флюоресценції в контрольній пробірці свідчить про стійкість мікобактерій до дії даного препарату. Реактиви. Комплект BBL MGIT AST SIRE містить по дві ліофілізовані ампули стрептоміцину ізоніазиду рифампіцину та етамбутолу. Вміст в 1 ампулі ліофілізованого стрептоміцину - 160 0 мкг ізоніазиду - 20 0 мкг рифампіцину - 200 0 мкг етамбутолу - 700 мкг. Хід дослідження. В кожну ліофілізовану ампулу BBL MGIT з препаратом додати по 4 0 мл стерильної дистильованої води для отримання основних розведень препаратів: 40 0 мкг/мл для стрептоміцину 5 0 мкг/мл для ізоніазиду 50 0 мкг/мл для рифампіцину 175 мкг/мл для етамбутолу. Для визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням BBL MGIT необхідно попередньо виділити чисту культуру бактерій на щільному живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена або Фінна-2. Далі слід приготувати суспензію M.tuberculosis. 1. Додати 4 0 мл BBL бульйону 7Н9 Міддлбрука в стерильну пробірку розміром 16 5 х 128 мм з ковпачком яка містить 8 Ц 10 скляних кульок. 2. Зняти стерильною лопаткою з щільного живильного середовища якомога більше колоній намагаючись не зачіпити середовище. Суспендувати колонії в бульйоні 7Н9 Міддлбрука. Каламутність суспензії повинна перевищувати стандарт Макфарленда 1.0. 3. Збовтувати суспензію в змішувачі протягом 2 - 3 хвилин для того щоб розбити більш крупні грудочки. 4. Залишити суспензію відстоюватися на 20 хвилин. 5. Надосадну рідину перенести в іншу стерильну пробірку розміром 16 5 х 128 мм з ковпачком уникати переносу будь-якої частини осаду і залишити відстоюватися ще на 15 хвилин. 6. Перенести надосадну рідину вона повинна бути однорідною без грудочок в третю пробірку. 7. Довести суспензію до стандарту Макфарленда 0.5. 8. Розвести 1 0 мл суспензії в 4 0 мл стерильного ізотонічного розчину розведення 1:5 . Інокулят готовий. Для контрольної пробірки з негативним результатом використовується закрита не інокульована пробірка MGIT. Позитивний контроль - пробірка MGIT з якої видалено бульйон Міддлбрука і стерильно внесено 5 0 мл 0 4 % розчину сульфату натрію. Пробірку щільно закривають ковпачком і залишають при кімнатній температурі на 1 годину. Контрольні пробірки не інкубують в термостаті. Їх можна використовувати багаторазово але не більше 4 тижнів в умовах зберігання при кімнатній температурі. Методика інокуляції для визначення чутливості M.tuberculosis. 1. Промаркувати пробірки MGIT STR MGIT INH MGIT RIF MGIT EMB GC Цконтроль росту а також на пробірках відмітити номери проб. 2. В асептичних умовах додати в кожну пробірку 0 5 мл MGIT OADC. 3. В асептичних умовах перенести мікропіпеткою по 100 0 мкл основних розведень антимікобактеріальних препаратів STR INH RIF EMB в промаркіровані пробірки MGIT. В пробірку MGIT GC не додавати ніяких антибіотиків. 4. Інокулювати піпеткою 0 5 мл суспензії у співвідношенні 1:5 див. "Приготування проби" в кожну з п'яти пробірок MGIT. 5. Інкубувати пробірки MGIT при 37 град. Цельсію. Облік показань пробірок MGIT. 1. Витягти пробірки MGIT з термостата на третій день після інокуляції і врахувати показання за допомогою 365-нм УФ-трансосвітлювача або довгохвильового УФ-світла. Примітка. Необхідно враховувати показання пробірок AST щодня починаючи з третього дня до тої пори поки не з'явиться можливість інтерпретувати результати. 2. Порівняти пробірку MGIT GC з контрольними пробірками К- і К+. Контрольна пробірка К+ повинна давати сильну флюоресценцію яскравого жовтогарячого кольору на дні пробірки а також відображення жовтогарячого кольору на меніску . Контрольна пробірка К- повинна давати дуже незначну флюоресценцію. 3. Якщо флюоресценція в пробірці MGIT GC більше схожа на флюоресценцію в К+ ніж в К- то має місце ріст мікобактерій. Як тільки в пробірці MGIT GC з'явиться позитивний результат її використовують для інтерпретації результатів отриманих в пробірках які містять антимікобактеріальні препарати. Інтерпретацію результатів в пробірках що містять препарати проводять в той же день коли був отриманий позитивний результат в пробірці MGIT GC та протягом ще двох додаткових днів. 4. Якщо пробірка MGIT GC не дає флюоресценції і більше схожа на К- повторно інкубувати пробірки і продовжувати враховувати щодня на протязі 12 днів після інокуляції всіх пробірок. Якщо результат в пробірці MGIT GC двоїстий важко визначити присутня або ні флюоресценція жовтогарячого кольору тоді слід вважати результат негативним і повторно інкубувати пробірку. 5. Якщо пробірка MGIT GC не дає позитивного результату на 12 день досліджень це дослідження вважається недійсним. Інтерпретація результатів досліджень. Інтерпретувати результат отриманий в пробірці MGIT як чутливість якщо пробірка яка містить лікарський препарат не дає флюоресценції протягом двох днів після появи флюоресценції в пробірці MGIT GC. Інтерпретувати результат отриманий в пробірці MGIT як стійкість якщо флюоресценція в пробірці яка містить антимікобактеріальний препарат виникає на другу добу або протягом двох днів після появи флюоресценції в пробірці MGIT GC. Результати досліджень не піддаються інтерпретації якщо в пробірці з контролем росту MGIT GC флюоресценція не виникає протягом 12 днів після інокуляції. Таблиця 4.1 - Концентрації медикаментозних препаратів в пробірках MGIT Лікарський препарат Концентрація антимікобактеріальних препаратів після розведення мкг/мл Об'єм доданий в пробірки MGIT для досліджень мкл Кінцева концентрація в пробірках MGIT мкг/мл MGIT STR 40 0 100 0 0 8 MGIT INH 5 0 100 0 0 1 MGIT RIF 50 0 100 0 1 0 MGIT EMB 175 0 100 0 3 5 4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища ВКГ стимулятор росту і середовище ВКГ В.В.Власенко В останні роки у зв'язку з широким використанням антимікобактеріальних препаратів у 19 0 - 20 0 % випадків спостерігається диспропорція між виявленням мікобактерій при бактеріоскопічному дослідженні та їх ростом при посіві патологічного матеріалу на живильні середовища. Це явище зустрічається тому що МБТ які спостерігаються під мікроскопом не ростуть на загальноприйнятих живильних середовищах. Така дисоціація зумовлена впливом на МБТ антимікобактеріальних препаратів. Для отримання більш достовірних результатів можливо використання живильного середовища ВКГ з паралельним використанням традиційних класичних середовищ Льовенштайна-Єнсена та ін. . Ріст перших колоній на середовищі ВКГ через 2-3 доби. М.tuberculosis олігобацилярних форм та клітин зі зниженою життєздатністю і ферментативною активністю також проявляють ріст на вищезгаданому живильному середовищі через 2 - 3 доби. Обов'язковим є постановка досліду по контролю якості живильного середовища ВКГ перед початком використання нової серії живильного середовища. 4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища ВКГ Тритижневі культури M.tuberculosis H37Rv вирощені на середовищі Льовенштайна-Єнсена знімають бактеріологічною лопаткою і змішують зі стимулятором росту з розрахунку 1-2 млн. мікробних тіл в 1 0 мл суспензії. Суспензію витримують у термостаті при 37 град. Цельсію 48 годин після чого пересівають на чашки Петрі зі свіжоприготованим живильним середовищем ВКГ. У чашку Петрі вносять 1 5 мл суспензії і рівномірно розподіляють по всій поверхні середовища чашки Петрі не перевертають і герметично закривають клейкою стрічкою скотчем . Посіви переглядають щодня і інкубують до 10 діб. З появою росту культури відзначають початок росту готують мазок який фарбують водно-спиртовим розчином метиленового синього. З кожної серії живильного середовища і стимулятора відбирають по 3 пробірки зі стимулятором і по 3 чашки з живильним середовищем для контролю стерильності. На живильному середовищі після добової експозиції в стимуляторі росту штам M.tuberculosis H37Rv дає візуальний ріст починаючи з 3 доби рясний газонний ріст культури фіксується на 4-5 добу. При збільшенні експозиції в стимуляторі на 1 добу підсилюється інтенсивність росту штаму M.tuberculosis H37Rv - незначний ріст визначається візуально починаючи з 2-ої доби інкубації газонний ріст культури - на 3-ю добу спостереження. Штам M.tuberculosis H37Rv на щільному живильному середовищі ВКГ має характерні культуральні властивості: колонії соковиті трохи матові з жовтуватим відтінком по консистенції вісково-маслянисті легко відокремлюються від агару. При мікроскопії в першу добу МБТ проростають у вигляді кулеподібних і овоїдних клітин що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми. На 5-у добу виявляється велика кількість паличкоподібних форм що поступово переходять в колбоподібні клітини. За Цілем-Нільсеном мікробні клітини не забарвлюються. Однак добре забарвлюються простими методами - розведеним фуксином і водно-спиртовим розчином метиленового синього. Живильне середовище ВКГ зареєстровано в Україні за № 221/00-300200 000. Перед тим як направляти діагностичний матеріал на посів хворому потрібно не менше ніж на 1 добу відмінити антимікобактеріальні препарати. Передпосівну обробку патологічного матеріалу з метою деконтамінації і покращення гомогенізації проводять згідно загальноприйнятих методик. Після підготовки діагностичного матеріалу його центрифугують отриманий осад для посіву на середовище ВКГ обробляють стимулятором росту який входить до комплексу ВКГ окремий 10 0 мл флакончик з рідиною в співвідношенні 1:1 а взяту в асептичних умовах кров розводять стимулятором росту порівну. Отриману суспензію дослідний матеріал + стимулятор росту інкубують при температурі 37 0 + - 1 0 протягом 24 - 48 годин. Живильне середовище ВКГ готується безпосередньо перед застосуванням. Для цього беруть 9 0 г сухого середовища ВКГ розмішують його в 100 0 мл дистильованої води кип'ятять 2 - 3 хвилини до повного розплавлення агару фільтрують через ватно-марлевий фільтр розливають у відповідний посуд стерилізують 121 0 + - 1 0 протягом 15 хвилин у автоклаві. Після стерилізації розливають в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі шаром 6 0 - 8 0 мм. Готове живильне середовище жовтого кольору і повинно відповідати рН 7 2 + - 0 2. Для цього дистильовану воду для його приготування треба брати з рН 7 2 + - 0 2. Після застигання середовища негайно проводять посів у дозі 1 5 мл за допомогою шприца одноразового використання на чашку Петрі. Засіяний матеріал не перевертаючи чашки поміщають у термостат при температурі 37 0 + - 1 0 для виявлення росту. Для підвищення ефективності культуральної діагностики та доцільності контролю контамінації патологічного матеріалу який підготовлений з стимулятором росту посів проводять за загальноприйнятою методикою на додаткові живильні середовища - 5 0 % кров'яний агар жовточно-сольовий агар. Оцінка результатів. Проводиться візуально щодня протягом 10 діб. Ріст колоній на середовищі ВКГ проявляється у вигляді злегка жовтуватих непрозорих колоній або газонного росту як правило на другу-третю а інколи на четверту добу. Наявність росту колоній на інших живильних середовищах вказує на недостатню обробку патологічного матеріалу для бактеріологічного посіву. Отримані культури на живильному середовищі ВКГ використовуються для приготування мазків за загальноприйнятою методикою та фарбування простими методами. У першу добу мікобактерії проростають у вигляді кулеподібних і овоїдних клітин що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми які поступово переходять у колбоподібні клітини. Для верифікації олігобацилярної культури мікобактерій необхідно зробити її змив. На живильне середовище наносять 2 0 - 3 0 мл стерильної дистильованої води не фізіологічного розчину! та за допомогою пастерівської піпетки відсмоктують отриману суспензію переносять у стерильну центрифужну пробірку додають 12 - 15 крапель 10 0 % розчину їдкого лугу добре струшують до повної гомогенізації і центрифугують при 1500 обертах 10 хвилин. Отриманий осад використовують для посіву на середовища Льовенштайна-Єнсена і Фінна-2 але без малахітового зеленого . Одержати ріст мікобактерій бактеріальні форми стає можливим на середовищі Фінна-2 на 10-16 добу на середовищі Льовенштайна-Єнсена пізніше - на 18-25 добу. Приготовлені мазки культур у початковий період росту на цих живильних середовищах дозволяють знайти велику кількість дрібних і великих кулеподібних форм іноді гіллястих. Однак щоденна мікроскопія показує поступове збільшення паличкоподібних форм які розташовуються зрідка паралельно іноді під кутом чи скупченнями різної форми але частіше зустрічаються нитковидні утворення що складаються з паличок вигнутих по довжині іноді дугоподібних потовщених на одному чи обох кінцях. Клітини в цей період не забарвлюються за Цілем-Нільсеном. У процесі подальшого росту ниткоподібні утворення деструктуризуються і розпадаються з утворенням паличкоподібних форм характерних для мікобактерій тонких паличкоподібних клітин з характерною властивістю кислотостійкості. Запропоновану методику посіву вважають дуже інформативною а в разі необхідності проводять біологічну пробу з використанням морських свинок. Ідентифікація M.tuberculosis. Для швидкої ідентифікації мікобактерій з олігобацилярного матеріалу можна використовувати метод мікрокультивування мікобактерій на скельцях за Прайсом та метод ПЛР. Облік результатів. Проводиться через 8 - 10 діб інкубації в термостаті при 37 град. Цельсію. Після закінчення цього терміну пробірки з мазками автоклавують обережно відмивають водою від крові підсушують фіксують над полум'ям забарвлюють за Ціль-Нільсоном і мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа. При позитивному результаті в мазках одержують характерні мікроколонії що представляють собою забарвлені в червоний колір переплетені джгути так звані "коси" які складаються з великої кількості щільно притиснутих одна до одної клітин. Корд-фактор тригалоза-6 6-диміколат що забезпечує зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях забезпечує ріст у вигляді серпантиновидних "кіс" і має відношення до вірулентності збудника. Слід зазначити що предметне скельце повинно бути лише новим без подряпин добре відмитим обезжиреним в суміші Нікіфорова і простерилізованим. Важливим при диференціації є виявлення відсутності термостабільної каталази що вказує на належність їх до M.tuberculosis або M.bovis. Докладний опис мікробіологічного дослідження на туберкульоз з використанням середовища ВКГ зі стимулятором росту приведено в методичній розробці УМікробіологічні методи обстеження хворих на "туберкульоз" Методичні рекомендації В.В.Власенко і співавт. 2001. - 24 с. . 4.4 Генодіагностика: визначення наявності ДНК M.tuberculosis і M.bovis у діагностичному матеріалі від хворих на туберкульоз за допомогою полімеразної ланцюгової реакції ПЛР В ряду сучасних генетичних технологій метод полімеразної ланцюгової реакції ПЛР займає особливе місце. Метод ПЛР піднімає генодіагностику на принципово інший рівень - рівень визначення ДНК чи РНК що дозволяє провести пряме виявлення інфекційного агента або генетичної мутації. За допомогою ПЛР одна молекула ДНК певного інфекційного агента може бути виявлена в присутності мільйонів інших молекул ДНК. Особливо ефективним виявилося застосування методу в медицині де в останній час використовується велика кількість різних комерційних наборів для ПЛР-діагностики. Особливо наочні переваги методу для діагностики позалегеневих форм туберкульозу та визначення резистентності M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів. Принцип. Полімеразна ланцюгова реакція ПЛР - це метод ампліфікації in vitro за допомогою якого протягом декількох годин можна виділити і розмножити визначену послідовність ДНК у кількості що перевищує вихідну в мільйони разів. ПЛР - це процес що протікає в одній пробірці та складається з повторних циклів ампліфікації розмноження копіювання специфічної послідовності молекули ДНК із метою одержання достатньо великої кількості копій що можуть бути виявлені звичайними методами детекції. Одним із ключових компонентів реакції є "праймери" - синтетичні олігонуклеотиди що складаються з 15-30 основ комплементарних "сайтам" ділянкам відпалення приєднання на матричній ДНК що ідентифікується. Процес підбору ефективних праймерів для ПЛР включає дизайн синтез перевірку якості синтезованих праймерів а також аналітичну і клінічну чутливість і специфічність ПЛР. Праймери підбираються на консервативні ділянки ДНК інфекційного агента таким чином щоб забезпечити ампліфікацію тільки обраного специфічного фрагмента. Кожен цикл ПЛР складається з трьох стадій що протікають при різних температурах: денатурації відпалення та подовження. Під час 1-ої стадії - денатурації - відбувається плавлення ДНК при температурі 95 град. Цельсію при цьому нитки ДНК роз'єднуються та стають доступними для праймерів. При відпаленні "anneling" реакційна суміш охолоджується до температури що є оптимальною для приєднання "праймерів" до нитки ДНК. Подовження починається від праймерів і каталізується ферментом ДНК-полімеразою при оптимумі температури 72 град. Цельсію. Полімеразна ланцюгова реакція протікає автоматично в програмованому термостаті- термоциклері ампліфікаторі . Трьохступінчатий цикл у результаті якого виходять точні копії ділянки матричної ДНК що ідентифікується повторюється 30-50 разів відповідно до заданої програми термоциклера. З кожним новим циклом число молекул матричної ДНК подвоюється тобто кількість копій наростає в геометричній прогресії. Хід дослідження. Виявлення збудників туберкульозу в клінічних ізолятах методом ПЛР може бути виконано за допомогою "Набору реактивів для виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти M.tuberculosis М.bovis "MYC - TEST" що складається з трьох комплектів: № 1 - для виділення ДНК із клінічного матеріалу № 2 - для ампліфікації ДНК M.tuberculosis М.bovis № 3 - для поділу ДНК методом електрофорезу в гелі агарози. Набір MYC - TEST забезпечує ампліфікацію фрагмента інсерційного елемента IS 6110 хромосоми M.tuberculosis М.bovis і дозволяє знайти 50 клітин мікобактерій. Процедури підготовки проб та аналізу матеріалу прості у виконанні не вимагають дорогого обладнання що робить можливим застосування методу ПЛР для ідентифікації комплексу M.tuberculosis М.bovis на базі обласних протитуберкульозних диспансерів у найближчі часи. Використання методу підрощуваня при дослідженні харкотиння на рідкому живильному середовищі у системі MGIT з наступним добором проб і визначенням у них ДНК M.tuberculosis/bovis методом ПЛР істотно підвищує чутливість діагностичного методу та надає йому додаткові переваги в порівнянні з традиційними культуральними методами. Процедура аналізу клінічного матеріалу складається з 3-х етапів. 1 етап - відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики ДНК методом ПЛР Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу. Клінічний матеріал - зразки культур харкотиння кров сечу відбирають лише одноразовими інструментами та в одноразові пластикові пробірки або контейнери з кришкою кров збирають у пробірку з консервантом 1/10 об'єму 3 0 % ЕДТА або 4 0 % цитрату натрію . Відібрані зразки пакують у окремі пакети щоб уникнути контамінації і доставляють у лабораторію у ізотермічному контейнері з охолоджувачем або льодом при температурі нижчій 0 град. Цельсію протягом доби. Відібрані зразки зберігають при температурі +4 0 град. Цельсію не більше доби а при -20 0 град. Цельсію не більше 1 місяця. Допускається одноразове заморожування та розморожування матеріалу. Кров не заморожують і зберігають при температурі +4 0 град. Цельсію не більше 1 доби до проведення дослідження. Попередня обробка матеріалу. Культура мікроорганізмів. 100 0 мкл суспензії зразка культури мікроорганізмів внести в пробірку ємністю 1 5 куб. см і використовувати для виділення ДНК. Харкотиння. До 500 0 мкл харкотиння додають 500 0 мкл спутолізина і залишають при кімнатній температурі на 30 хвилин. Центрифугують при 10 000 об/хв 5 хвилин. Надосадну рідину видаляють. Сеча. 1 куб. см сечі помістити в пробірку центрифугувати при 10 000 об/хв. протягом 5 хвилин. Надосадову рідину обережно видалити залишаючи над осадом 100 0 мкл рідини. Якщо осаду практично не видно тоді в цю ж пробірку додати ще 1 куб. см сечі та повторити процедуру центрифугування. Розчинити осад у рідині що залишилася в пробірці та використовувати цю завись для виділення ДНК. Кров. Для виділення ДНК використовують 100 0 мкл суцільної консервованої крові. Як консервант антикоагулянт використовують 3 0 % ЕДТА або 4 0 % цитрат натрію в кількості 10 0 % до об'єму крові. Примітка. При використанні деяких наборів можуть бути передбачені спеціальні рекомендації по підготовці матеріалу для дослідження. У цьому випадку потрібно керуватися інструкцією що додається до даного набору. Виділення ДНК із клінічного матеріалу може проводитись за допомогою набору реактивів № 1 із набору MYC - TEST. Порядок проведення робіт. 1. До осаду підготовленого матеріалу додати 400 0 мкл "Буфера ЛБФ і прогріти в термостаті при температурі 100 град. Цельсію на протязі 15 хвилин кришки пробірок повинні бути щільно закритими та охолодити при кімнатній температурі. 2. Додати в пробірки по 10 0 мкл старанно перемішаного до однорідної зависі магнітного сорбенту та перемішати. 3. Витримати 10 хвилин при кімнатній температурі періодично 2-3 рази струшуючи пробірку. 4. Помістити сорбент у магнітний штатив для осадження сорбенту на стінці пробірки. При відсутності магнітного штатива - осадити сорбент центрифугуванням 15 - 20 секунд при 1500 - 2000 об/хв. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником. 5. До осаду в пробірці додати 300 0 мкл "Буфера ПБ 1" струсити на центрифузі-вортексі протягом 5 - 10 секунд до гомогенного стану зависі та помістити пробірку в магнітний штатив для осадження магнітного сорбенту. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником. 6. До осаду в пробірці додати 500 0 мкл "Буфера ПБ 2" струсити на вортексі протягом 5 - 10 секунд до гомогенного стану та помістити пробірку в магнітний штатив для осадження магнітного сорбенту. Надосадну рідину видалити піпеткою зі змінним наконечником. 7. Повторити операцію 6. Звернути увагу на повне видалення надосадної рідини та уникати відсмоктування часток магнітного сорбенту. 8. Помістити пробірки в термостат при температурі 65 град. Цельсію на 10 хвилин залишаючи пробірки відкритими для випаровування залишкової кількості промивної рідини. 9. Додати до осаду 30 0 мкл "Буфера ТЕ" пробірки закрити струсити на вортексі протягом 10 секунд та інкубувати в термостаті при темпратурі 65 град. Цельсію протягом 5 хвилин. 10. Пробірки струсити на вортексі протягом 10 секунд і помістити в магнітний штатив для осадження сорбенту. Відібрати для аналізу надосадну рідину що містить виділену ДНК. Зберігати виділену ДНК при температурі -20 град. Цельсію або -70 град. Цельсію. Умови проведення робіт. Не допускається повторного використання пробірок і наконечників. При проведенні робіт слід використовувати одноразові рукавички маски й халати. Форма випуску та пакування. Компоненти набору кількість пробірок їх вміст і маркерування наведені в табл.4.2. NN Найменування компонентів в упаковці напис на етикетці Номіналь- ний об'єм куб. см Вид пакування К-сть штук 1 Буфер ЛБ 30 Пластикова пробірка ємністю 50 куб. см 1 2 Буфер ПБ 1 30 Пластикова пробірка ємністю 50 куб. см 1 3 Буфер ПБ 2 50 Пластикова пробірка ємністю 50 куб. см 2 4 Буфер ТЕ 2 Пластикова пробірка ємністю 2 куб. см 1 5 Сорбент 1 1 Пластикова пробірка ємністю 2 куб. см 1 2 етап - власне полімеразна ланцюгова реакція. Здійснюється за допомогою комплекту № 2 який використовується для аплікації ДНК M.tuberilosis M.bovis у пробах що аналізуються і отримані після виділення ДНК Порядок проведення робіт. 1. Підпишіть і розставте в штатив необхідну кількість що відповідає числу проб котрі аналізуються пробірок майстер-мікс і пробірок позитивного К + та негативного К - контролів. 2. Додайте в кожну пробірку по 20 0 мкл плр - буфера. Закрийте пробірки та залишіть їх у штативі при кімнатній температурі на 10 - 15 хвилин. 3. Струсіть кожну пробірку на вортексі або центрифузі-вортексі протягом 10 - 20 секунд до повного розчинення кольорового осаду. 4. Внесіть у пробірки для проб по 5 0 мкл відповідного матеріалу що аналізується. В контролі пробірки К + і К - і додайте по 5 0 мкл дейонізованої води . 5. Закрийте пробірки та перемішайте їх вміст на вортексі або центрифузі-вортексі протягом 5 сек. Примітка. При наявності крапель рідини на стінках пробірки помістіть пробірки в центрифугу-вортекс і центрифугуйте їх при 1500 - 2000 об/хв. Протягом 5 хвилин. 6. Додайте в кожну пробірку по 30 0 - 40 0 мкл мінерального масла 1 краплю . 7. Закрийте пробірки розмістіть їх у термоциклер ампліфікатор і запустіть програму ампліфікації табл.4.3 . Таблиця 4.3 - програма ампліфікації Етапи апмпліфікації Температура град. Цельс. Час хв. Кількість циклів 1 95 5 1 2 94 1 65 1 5 74 1 3 94 0 5 65 0 5 35 73 0 5 4 72 5 1 5 Зберігання Умови проведення робіт. Роботи з набором повинні проводитись у спеціалізованій лабораторії з дотриманням загальних і спеціальних вимог роботи на обладнанні що використовується. Не допускається повторного використання пробірок і наконечників. При проведенні робіт слід використовувати одноразові рукавички маски й халати. Для якісного проведення реакції ампліфікації забезпечення необхідної чутливості специфічності й відтворюваності рекомендується використання ампліфікаторів термостатів програмних з наступними основними парметрами: - швидкість нагрівання не менш ніж 2 0 град. Цельсію за секунду в діапазоні 40-97 град. Цельсію - швидкість охолоджування не менш ніж 2 0 град. Цельсію за секунду в діапазоні 50-97 град. Цельсію; об'єм пробірок - 0 5 - 0 6 куб. см. Таким параметрам на цей час відповідають ампліфікатори виробництва країн СНД - тільки МС-2 "Терцик" Росія інших країн - типу "Mastercecler 5330 plus" Eppendorf Німеччина "Progen" Techne Великобританія або аналог. Форма випуску й пакування. Комплектність набору для ампліфікації ДНКднк M.tuberculosis M.bovis наведена в табл.4.4. Таблиця 4.4 - комплектність набору для ампліфікації ДНК M.tuberculosis M.bovis N Найменування компонентів в упаковці напис на етикетці Номіналь- ний об'єм куб. см Вид пакування К-сть Штук 1 Плр - буфер 1 Пластикова пробірка ємністю 2 куб. см 2 2 Пробірки Майстер-Мікс маркування кольором Суха суміш Блакитна пластикова пробірка ємністю 0 5 куб. см 100 3 Масло мінеральне Мін. масло 2 Пластикова пробірка ємністю 2 куб. см 2 4 Вода дейонізована дд-вода 2 Пластикова пробірка ємністю 5 куб. см 1 5 Позитивний контроль К + Суха суміш Червона пластикова пробірка ємністю 0 5 куб. см 5 6 Негативний контроль К - Суха суміш Безбарвна пластикова пробірка ємністю 0 5 куб. см 5 3 этап - детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу Порядок проведення робіт. 1. Приготування буферного розчину для електорофорезу БЕ . Розчинити вміст пакета з написом "Буфер для електрофорезу" в 200 куб. см дистильованої води й довести об'єм розчину до 1 л. Після приготування зберігати розчин при температурі плюс 4 0 град. Цельсію. 2. Приготування гелю агарози. В конічну термостійку колбу ємністю 250 куб. см внести вміст одного пакета з агарозою додати 200 куб. см БЕ та помістити колбу на електричну плитку. Довести вміст колби до кипіння і через 10 - 20 хвилин після того як агароза повністю розчиниться колбу з розплавленою агарозою зняти з плитки. Розчин агарози що отримали повинен бути прозорим і не повинен містити окремих нерозплавлених часток. 3. Підготовка електрофоретичної камери до заливання гелю агарози. Встановити кришку з ванночкою на камеру а платформу для заливання гелю помістити у ванночку. Встановити гребінчик можна встановити 2 і навіть 4 гребінчики залежно від кількості проб що аналізуються на платформу. 4. В колбу з розчином агарози внести 5 0 мкл етідіума броміду старанно й обережно перемішати вміст колби рівномірними обертовими рухами. Після цього розплавлену агарозу охолодити до 50 град. Цельсію при кімнатній температурі. 5. Охолоджену до 50 град. Цельсію агарозу вилити на платформу. Товщина шару агарози повинна бути не меншою за 4 мм. 6. Після застигання гелю агарози приблизно через 25 - 30 хвилин обережно витягнути гребінчик не пошкодивши при цьому карманів платформу з агарозним гелем перенести з ванночки в електрофоретичну камеру. 7. Залити 800 куб. см розчину БЕ в електрофоретичну камеру так щоб він вкривав агарозний гель шаром 5 - 6 мм. 8. Додати в пробірку з "Контрольним зразком ДНК" 50 0 мкл бідистильованої води. Перемішати вміст до повного розчинення осаду. Додати в розчин 10 0 мкл фарби-лідера. Внести рекомендовану кількість фарби-лідера в проби що аналізуються та перемішати. Внести в одну лунку з гелем під шар БЕ 5 0 мкл приготованого "Контрольного зразка ДНК" і в інші по 5 0 - 20 0 мкл проб що аналізуються з попередньо внесеною фарбою-лідером так щоб вміст заповненого пробою карману не перетікав у інший. 9. Проведення електрофорезу. Встановити кришку на камеру підключити електрофоретичну камеру до джерела живлення встановити на джерелі живлення напругу в 200 V не більш 15 V/см . Через 25 - 35 хвилин електрофоретичну камеру відключити від джерела живлення від'єднати дроти та тільки після цього зняти кришку з електрофоретичної камери. Дістати платформу з гелем з електрофоретичної камери дати рідині стекти й обережно промити гель дистильованою водою. Примітка. При роботі з гелем агарози при додаванні етідіуму бромідіу і подальшому дослідженні слід обов'язково надягати гумові рукавички! 10. Облік результатів. Після проведення електрофорезу гель агарози виймають з приладу для електрофорезу продивляються або і фотографують на фотоплівку типу "Мікрат 300" або "Ізопан" в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 254 або 310 нм з використанням флуоскопа. Продукт ампліфікації на фотоплівці видно у вигляді темної смужки. Допускається використання інших методів аналізу електрофореграм використання цифрових або телекамер сканування гелю . Особливістю тест-системи що пропонується є наявність у "ПЛР-пробірках" ДНК внутрішнього стандарту ВС . ВС дозволяє контролювати проходження реакції у кожній пробірці яка утримує ДНК досліджуваного зразка що виключає отримання помилково-негативних результатів аналізу. Чутливість визначення - 50 геном/екв. Розмір амплікона мішені - 229 н.п. Розмір амплікона ВС - 335 н.п. Можливі варіанти електрофорезу продуктів ампліфікації наведені на рис. 4.1. 1        2      3      4      5      6       7       8 |...   |.....  |..... |..... |..... |.....  |.....  |.....|                | |      |       |      |      |      | К +   | ММ    |К -  |    ----------- | |      | ----- |      |----- |      |-----  |       |-----| <--|ВС       | | |      | ----- |      |----- | ---- |-----  |       |-----|    ----------- | |      |       |----- |      |      |       | ----- |     |    ----------- | |      |       |----- |      | ---- |       | ----- |     | <--|Мішень   | |                                                               ----------- | Примітки: 1. 1 - 5 - клінічні зразки; 2. 6 - 7 - позитивний контроль; 3. 8 - негативний контроль;     4.    -----------  - смужка в гелі що відповідає розміру        <--|ВС       |    амплікона внутрішнього стандарту;           -----------     5.    -----------  - смужка в гелі що відповідає ділянці        <--|Мішень   |    ДНК M. tuberculossis М. bovis           -----------    яка ампліфікується. Рис. 4.1 - Можливі варіанти електрофорезу продуктів ампліфікації На рисунку 4.1 в колонці 1 смужки ампліконів відсутні. Це означає що реакція не пройшла і аналіз необхідно повторити. В колонці 2 видно тільки смужку ВС. Це означає що результат негативний у досліджуваному зразку ДНК M. tuberculosis М. bovis відсутня або її кількість менша ніж 50 геном/екв у 5 0 мкл розчину виділюваної ДНК . В колонці 3 видно тільки смужку амплікона мішені - результат позитивний. ВС пригнічений великою кількістю мішеней. В колонці 4 видно смужки ампліконів ВС та мішені. Це означає що реакція позитивна в 5 0 мкл розчину виділеної ДНК знаходиться 50-1000 геном/екв мікобактерій . Співвідношення інтенсивності смужок може бути різним. В колонці 5 видно слабке світіння смужок амплікона мішені та ВС. Це свідчить що можливо в реакції присутній інгібітор. Необхідно повторити аналіз. В колонці 6 - позитивний контроль реакції К+ пройшов нормально і вказує на те що в пробі присутня невелика кількість мішені. В колонці 7 - контроль пробірок Майстер-Мікс ММ . Позитивний контроль реакції пройшов нормально. В колонці 8 присутня тільки смужка ВС це означає що негативний контроль реакції КЦ пройшов нормально *. * Примітка. Якщо негативний контроль проходить за варіантами 6 або 7 то необхідно з'ясувати джерело контамінації та повторити аналіз. Форма випуску й пакування. Компоненти набору кількість пробірок їх вміст і маркерування наведені в табл.4.5. Таблиця 4.5 - Комплектність набору для поділу ДНК методом електрофорезу в гелі агарози Найменування компонентів в упаковці напис на етикетці Номінальна кількість Вид пакування К-сть штук Етідіума бромід 30 0 мкл Пластикова пробірка 2 куб. см 1 Фарба-лідер 500 0 мкл Пластикова пробірка 2 куб. см 1 Буфер для електрофорезу 18 0 г Пластиковий пакет флакон 20 куб. см 1 Агароза 4 0 г Пластиковий пакет флакон 20 куб. см 2 Матеріали обладнання: - термостат ампліфікатор програмний типу МС-2 "Терцик" Росія Mastercecler 5330 plus Eppendorf Німеччина; Techne Великобританія або аналог; - термостат для мікропробірок що підтримує температуру 65 + - 2 град. Цельсію типу Dri-block-BLD-701-010X фірма Techne Великобританія або аналог; - мікроцентрифуга що розвиває прискорення 14 000 об/хв. типу А 14 JOUAN S.A. Франція кат. № 11174542 або аналог; - вихровий змішувач типу Вортекс CV-1500 Росія або аналог; - електрофоретична камера типу SE-1 SE-2 Росія або аналог; - джерело постійного струму типу ЭЛЬФ 4 ЭЛЬФ 8 Росія або аналог; - трансілюмінатор ультрафіолетовий типу Т-16-365 Росія або аналог; - холодильник побутовий; - піпетки напівавтоматичні одноканальні зі змінними наконечниками з перемінним або фіксованим об'ємом що дозволяють відбирати об'єми рідини 5 15 20 80 мкл атестовані за значенням середньої дози й східністю результатів піпетування похибка не більше + - 3 0 % ; - мікрохвильова піч; - плитка електрична; - мікропробірки ампліфікаційні ємністю 0 5 куб. см Кат. № 00301210023 фірма Eppen-dorf Німеччина або аналог; - колба конічна ємністю 250 куб. см за ДСТ 25336; - колба конічна ємністю 1000 куб. см за ДСТ 25336; - колба конічна ємністю 500 куб. см за ДСТ 25336; - папір фільтрувальний лабораторний за ДСТ 12026; - рукавички гумові хірургічні за ДСТ 3-88; - спирт етиловий ректифікований за ДСТ 5962; - штатив магнітний; штатив для мікропіпеток. Необхідно пам'ятати що існують набори для виявлення МБТ і інших фірм тому можливо використання наборів реагентів для виявлення МБТ за допомогою ПЛР і інших фірм зареєстрованих в Україні відповідним чином. 5. Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів 5.1 Критерії стійкості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів Визначення спектра і ступеня стійкості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів має суттєве значення для тактики хіміотерапії хворих для контролю за ефективністю лікування і визначення прогнозу захворювання. Зміна чутливості мікобактерій відзначається до усіх антимікобактеріальних препаратів проте відрізняється за ступенем частотою і швидкістю появи стійких варіантів. Чутливими до антимікобактеріальних препаратів вважаються ті мікобактерії туберкульозу на які препарат у концентрації що досягається у вогнищі інфекції спричиняє бактеріостатичну або бактеріцидну дію незалежно від поза- або внутрішньоклітинного їх розташування. Відповідно до цього критерії чутливості мікобактерій туберкульозу залежать від концентрації медикаментозного препарату у вогнищі ураження величини максимальної терапевтичної дози препарату його фармакокінетики. Чутливість мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів корелюється з мінімальною концентрацією препарату що затримує інгібує ріст мікобактерій при стандартних умовах постановки досліду. Розподіл мікобактерій туберкульозу на чутливі і стійкі відбувається на підставі критеріїв що встановлені клініко-лабораторними дослідженнями табл.5.1 . Визначення медикаментозної чутливості виділених культур M.tuberculosis у вперше виявлених хворих необхідно обов'язково проводити до стрептоміцину ізоніазиду етамбутолу рифампіцину. В випадку наявності стійкості до цих препаратів рекомендується проведення тесту медикаметозної чутливості до етіонаміду або протіонаміду канаміцину та фторхінолонам. У хворих з хронічним перебігом туберкульозу необхідно проводити визначення медикаментозної чутливості M.tuberculosis до всіх препаратів з урахуванням результатів попередніх досліджень. Таблиця 5.1 - Критерії оцінки медикаментозної стійкості M.tuberculosis на яєчних середовищах в мкг/мл ПРЕПАРАТИ Метод пропорцій Метод абсолютних концентрацій Стрептоміцин Ізоніазид Етіонамід або протіонамід Етамбутол Рифампіцин Канаміцин 4 0; 8 0 0 1; 0 2; 1 0 20 0; 40 0 1 0; 2 0; 3 0 20 0; 40 0 - 5 0 1 0 30 0 5 0 20 0 30 0 Піразинамід Фторхінолони ципрофлоксацин Циклосерин ПАСК 1 0; 2 0; 4 0 4 0 16 0 0 5 - 10 0 16 0 1 0 Визначення медикаментозної чутливості мікобактерій туберкульозу може проводитися бактеріологічними методами в щільному або в рідкому живильному середовищі. Існують модифікації обох методів. Модифікації методу визначення медикаментозної чутливості в рідкому середовищі представлені методом глибинного посіву мікобактерій за Школьниковою і методом мікрокультивування на скельцях за Прайсом . Методи визначення чутливості мікобактерій у рідких середовищах більш трудомісткі вимагають додаткового приготування мазків їх фарбування і мікроскопіювання. Проте результати визначення одержують у більш короткі терміни від 8 до 12 діб . Метод мікрокультивування на скельцях і метод глибинного посіву застосовуються як правило для прямого визначення чутливості мікобактерій безпосередньо з патологічного матеріалу. При цьому в патологічному матеріалі повинно міститися не менше 1-5 мікобактерій у полі зору. Для непрямого визначення чутливості з вирощеної культури потрібно приготувати завись в ізотонічному розчині хлористого натрію відцентрифугувати протягом 2-3 хвилин і з надосадної рідини стерильною пастерівською піпеткою нанести 2 краплі на відстані 1 0 см одна від одної на 1/3 вузького скельця. Далі роблять так само як і при прямому визначенні чутливості. Модифікації методу визначення медикаментозної чутливості на щільному середовищі представлені методом абсолютних концентрацій і методом пропорцій. Ці методи менш трудомісткі але визначення проводиться з вже виділених культур непрямий метод . Ця обставина подовжує терміни одержання результатів. При методі пропорцій визначення чутливості відбувається шляхом засіву дозованої кількості мікобактерій що дозволяє більш точно визначити ступінь їх чутливості. Вибір методу залежить від можливостей лабораторії що виконує дослідження. Для визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів використовується середовище Льовенштайна-Єнсена яке прийнято за міжнародний стандарт ВООЗом. 5.1.1 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах Принцип методу полягає у вирощуванні мікобактерій виділених від хворого на щільних живильних середовищах що містять "критичні" концентрації препаратів критерії резистентності . Приготування зависі суспензії культури. Готують гомогенну бактеріальну суспензію в 0 9 % розчині NaCl. Для цього культуру що виросла на твердому живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена знімають тампоном попередньо змоченим у стерильному 0 9 % розчині NaCl при цьому тампон повинен стикатися з усією поверхнею середовища. Потім тампон занурюють в пробірку що містить 2 0 мл стерильного 0 9 % розчину NaCl змивають культуру в рідину попередньо розтираючи по внутрішнім стінкам пробірки. Пробірку залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі для осадження крупних часточок культури. Суспензію культури стандартизують по бактеріальному стандарту каламутності 5 ОД. Для цього суспензію без осаду обережно не торкаючись дна пробірки відсмоктують піпеткою в іншу пробірку та розводять її ще в 10 разів в ізотонічному розчині NaCl. Приготування щільного живильного середовища. У флакони з яєчним середовищем Льовенштайна-Єнсена до згортання додають розведення антимікобактеріальних препаратів. Розведення препаратів готують створюючи в середовищі їх "критичні" концентрації із таблеток або ампул для парентерального введення препарату ці розведення можна зберігати в холодильнику протягом 2 - 3 тижнів. Важливо відмітити що для отримання точних та якісних результатів тесту медикаментозної чутливості в Україні буде здійснюватися поступовий перехід від таблетованих та рідких лікарських форм на більш якісні хімічно чисті субстанції лікарських препаратів провідних світових виробників Sigma Fatol-Arzneimittel та інш. . 5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів Розрахунки робляться на 50 0 і 100 0 мл середовища яке після внесення розведення відповідного препарату розливається приблизно по 5 0 мл. Таким чином отримують середовище з препаратом для визначення чутливості відповідно до 10 - 20 культур мікобактерій. Для розведень всіх препаратів користуються стерильною дистильованою водою. Стрептоміцин Для визначення медикаментозної чутливості до стрептоміцину використовують дигідрострептоміцинсульфат. 1-е розведення - 100 0 мг/мл: флакон що містить 500 0 мг 0 5 г стрептоміцину + 5 0 мл води; якщо флакон містить 1000 0 мкг/мл стрептоміцину 1 0 г відповідно додають 10 0 мл води. 2-е розведення - 10 0 мг/мл 10 000 мкг/мл : 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 2500 0 мкг/мл: 3 0 мл 2-го розведення + 9 0 мл води. 4-е розведення - 250 0 мкг/мл: 1 0 мл 3-го розведення + 9 0 мл води. Після додавання 1 0 мл 4-го розведення до 49 0 мл середовища отримаємо в ньому 5 0 мкг/мл стрептоміцину. До 98 0 мл середовища відповідно додають 2 0 мл розведення. Ізоніазид Беруть ампулу 5 0 мл 10 0 % розчину препарату. Вона містить в 1 0 мл 100 0 мг ізоніазиду. 1-е розведення - 10 0 мг/мл: 1 0 мл із ампули + 9 0 мл води. 2-е розведення - 1 0 мг/мл 1000 мкг/мл : 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 250 0 мкг/мл: 3 0 мл 2-го розведення + 9 0 мл води. 4-е розведення - 50 0 мкг/мл: 2 0 мл 3-го розведення + 8 0 мл води. Після додавання 1 0 мл 4-го розведення до 49 0 мл середовища отримаємо 1 0 мкг/мл препарату. До 98 0 мл середовища відповідно додають 2 0 мл розведення. Етіонамід або протіонамід 1-е розведення - 25 0 мг/мл: таблетку що містить 250 0 мг етіонаміду або протіонаміду обережно розтирають в порцеляновій ступці до однорідного порошку +1 0 мл етилового спирту для дезинфекції + 9 0 мл води. 2-е розведення - 5 0 мг/мл: 2 0 мл із ступки + 8 0 мл води. 3-є розведення - 1 0 мг/мл 1000 0 мкг/мл : 2 0 мл 2-го розведення + 8 0 мл води. Якщо внести 1 5 мл 3-го розведення в 48 5 мл середовища отримаємо концентрацію препарату 30 0 мкг/мл. До 97 0 мл середовища відповідно додають 3 0 мл розведення. Канаміцин Беруть ампулу канаміцину що містить 500 0 мг в 2 0 мл розчину тобто 250 0 мг/мл. 1-е розведення - 25 0 мг/мл: 1 0 мл із ампули + 9 0 мл води. 2-е розведення - 5 0 мг/мл: 2 0 мл 1-го розведення + 8 0 мл води. 3-є розведення - 1 0 мг/мл 1000 0 мкг/мл : 2 0 мл 2-го розведення + 8 0 мл води. Якщо внести 1 5 мл 3-го розведення в 48 5 мл середовища отримаємо концентрацію препарату 30 0 мкг/мл. До 97 0 мл середовища відповідно додають 3 0 мл розведення. Рифампіцин рифадин мікобутин 1-е розведення - 15 мг/мл: 150 0 мг розчинного порошку рифампіцину що міститься в ампулі для парентерального введення розчиняють в 10 0 мл води. Якщо ампульного рифампіцину немає беруть капсулу що містить 150 0 мг препарату висипають в стерильну пробірку + 1 0 мл етилового спирту для дезинфекції + 9 0 мл води. Ретельно розмішують піпеткою отриману завись щоразу перед кожним розведенням ретельно перемішують. 2-е розведення - 1 5 мг/мл 1500 мкг/мл : 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 1000 0 мкг/мл: 2 0 мл 2-го розведення + 1 0 мл води краще брати вдвічі більший об'єм - 4 0 мл + 2 0 мл води . Внести 1 0 мл 3-го розведення в 49 0 мл середовища отримаємо 20 0 мкг/мл або 2 0 мл в 98 0 мл середовища . Етамбутол 1-е розведення - 20 0 мг/мл: таблетку що містить 400 0 мг препарату ретельно розтирають в ступці + 1 0 мл етилового спирту + 19 0 мл води. 2-е розведення - 2 0 мг/мл 2000 0 мкг/мл : 1 0 мл із ступки + 9 0 мл води. 3-є розведення - 250 мкг/мл: 1 0 мл 2-го розведення + 7 0 мл дистильованої води. Внести 1 0 мл 3-го розведення в 49 0 мл середовища отримаємо 10 0 мкг/мл або 2 0 мл в 98 0 мл середовища . Хід дослідження. Живильне середовище з різними концентраціями антимікобактеріальних препаратів розливають у пробірки приблизно по 5 0 мл і згортають у скошеному вигляді при 85 градусів Цельсію протягом 30 хвилин в апараті для згортування сироватки крові. Середовище з антимікобактеріальними препаратами можна зберігати в холодильнику при температурі 2 - 4 градуса Цельсію не більше 1-го місяця. Але краще готувати свіже середовище щотижня. Пробірки з приготованими середовищами що містять медикаментозні препарати і одну контрольну пробірку із середовищем що не містить препаратів засівають приготованою зависсю культури по 0 2 мл у кожну пробірку див. вище . Пробірки поміщають у нахиленому стані в термостат при 37 градусів Цельсію на другий день закривають гумовими корками замість ватно-марлевих або парафінують щоб запобігти висиханню середовища і ставлять вертикально. Посіви переглядають щотижня. Через 2 - 3 тижні після посіву реєструють отримані результати. При бідному рості в контролі пробірки ставлять ще на тиждень у термостат після чого дають остаточну відповідь. Оцінка результатів. Культура вважається чутливою якщо в пробірці із середовищем що містить препарат виросло менше 20 колоній при рясному рості в контролі. Тільки при наявності більше 20 колоній культура розцінюється як стійка до тієї концентрації препарату що міститься в середовищі. При будь-якому методі визначення чутливості мікобактерій до антимікобактеріальних препаратів необхідно кожну серію приготованого живильного середовища з препаратами перевірити засіваючи завідомо чутливою культурою мікобактерій туберкульозу. Для контролю можна користуватися чутливим лабораторним штамом M.tuberculosis H37Rv або будь-якою старанно перевіреною чутливою культурою M.tuberculosis. Контрольна культура засівається так само як і та що випробовується. Якщо середовища з препаратами приготовані правильно контрольна культура не повинна рости при критичних концентраціях препарату при яких не ростуть чутливі до медикаментозних препаратів штами. Поява росту контрольного штаму в пробірці з препаратом вказує на допущення помилок при приготуванні середовища з цим препаратом або на неправильне приготування бактеріальної суспензії. 5.1.2 Визначення стійкості МБТ до антимікобактеріальних препаратів методом пропорцій метод Канетті Данний метод широко застосовується в усьому світі є коректним інформативним і точним. Принцип методу полягає у виявленні пропорції між чутливими та стійкими особинами в популяції штаму МБТ виділеному від хворого. Якщо кількість стійких особин до якогось антибактеріального препарату в популяції буде менше 1 0 % такий штам вважається чутливим до даного препарату. Якщо стійкість особин в популяції більше 1 0 % - штам вважається стійким до даного препарату. I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів Для приготування розведень використовуються хімічно чисті х/ч субстанції препаратів. Субстанції розводять стерильною дистильованою водою наважка яких перераховується згідно вказанному на етикетці коефіцієнту потенції для кожної хімічно чистої речовини. Ізоназид INH субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL Розчин I: концентрація 5000 мкг/ мл - 50 0 мг INH - порошку розчинити в 10 0 мл води. Розчин II: концентрація 100 0 мкг/ мл - 2 0 мл розчину I + 98 0 мл води. Розчин III: концентрація 10 0 мкг/ мл - 5 0 мл розчину II + 45 0 мл води. Кінцева концентрація в середовищі Льовенштайна-Єнсена Концентрація мкг/мл 8 0 4 0 0 2 0 1 Середовище Льовенштайна- Єнсена мл 450 0 90 0 450 0 90 0 Дистильована вода мл 10 0 0 40 0 9 0 Розчин II мл 40 0 0 0 0 Розчин III  мл 0 10 0 10 0 1 0 За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації 0 1 мкг/мл 0 2 мкг/мл і 1 0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 0 2 мкг/мл вдповда невисокому ступеню стійкості. Рифампцин RMP субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL Рифампцин-натрій коефіцінєт поправки = 1 04 х/ч речовини Розчин I: концентрація 4000 мкг/ мл - 62 4  мг RMP - порошку розчинити в 15 0 мл води. Розчин II: концентрація 400 0 мкг/ мл - 10 0 мл розчину I + 90 0 мл води. Розчин III: концентрація 200 0 мкг/ мл - 5 0 мл розчину II + 5 0 мл води. Кінцева концентрація в середовищі Льовенштайна-Єнсена Концентрація мкг/мл 40 0 20 0 10 0 1 0 Середовище Льовенштайна- Єнсена мл 450 0 450 0 45 0 45 0 Дистильована вода мл 10 0 30 0 0 2 5 Розчин II мл 40 0 20 0 0 0 Розчин III  мл 0 0 10 0 2 5 За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 20 0 мкг/мл і 40 0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі 40 0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості. Стрептоміцин SM субстанція фірми SIGMA Дигідрострептоміцинсульфат коефіцієнт поправки = 1.25 х/ч речовини Розчин I: концентрація 5000 мкг/мл - 50 0 мг  порошку розчинити в 8 0 мл води. Розчин II: концентрація 100 0 мкг/мл - 2 0 мл розчину I + 98 0 мл води. Розчин III: концентрація 20 0 мкг/мл - 2 0 мл розчину II + 18 0 мл води. Кінцева концентрація в середовищі Льовенштайна-Єнсена Концентрація мкг/мл 8 0 4 0 2 0 1 0 0 5 Середовище Льовенштайна- Єнсена мл 450 0 450 0 45 0 45 0 45 0 Дистильована вода мл 10 0 30 0 0 2 5 3 75 Розчин II мл 40 0 20 0 0 0 0 Розчин III  мл 0 0 5 0 2 5 1 25 За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 4 0 мкг/мл і 8 0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 4 0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості. Етамбутол EMB субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL Етамбутол-2HCl коефіцієнт поправки = 1 36 х/ч речовини Розчин I: концентрація 1000 мкг/мл - 136 0  мг EMB - порошку розчинити в 100 0 мл води. Розчин II: концентрація 20 0 мкг/мл - 2 0 мл розчину I + 98 0 мл води. Розчин III: концентрація 5 0 мкг/мл - 10 0 мл розчину II + 30 0 мл води. Кінцева концентрація в середовищі Льовенштайна-Єнсена Концентрація мкг/мл 2 0 1 0 0 5 Середовище Льовенштайна- Єнсена мл 450 0 450 0 40 0 Дистильована вода мл 0 25 0 5.0 Розчин II мл 50 0 25 0 0 Розчин III  мл 0 0 5 0 За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 1 0 мкг/мл; 2 0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі 2 0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості. Протіонамід PTH аналог етонаміду субстанція фірми FATOL-ARZNEIMITTEL Розчин I: концентрація 4000 мкг/мл - 40 0 мг PTH - порошку розчинити в 5 0 мл DMSO диметилсульфоксид . Розчин II: концентрація 400 0 мкг/мл - 10 0 мл розчину I + 90 0 мл води. Розчин III: концентрація 200 0 мкг/мл - 10 0 мл розчину II + 10 0 мл води. Кінцева концентрація в середовищі Льовенштайна-Єнсена Концентрація мкг/мл 40 0 20 0 10 0 5.0 Середовище Льовенштайна- Єнсена мл 450 0 450 0 45 0 45.0 Дистильована вода мл 0 25 0 2.5 3.75 Розчин II мл 50 0 25 0 0 0 Розчин III  мл 0 0 2.5 1.25 За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації 20 0 мкг/мл і 40 0 мкг/мл. "Критична" концентрація в середовищі - 20 0 мкг/мл відповідає невисокому ступеню стійкості. Амід нікотиново кислоти NSA аналог празинамду субстанця фрми FATOL-ARZNEIMITTEL Розчин I: концентрація 40 000 мкг/мл - 2000 мг NSA - порошку розчинити в 50 0 мл води. Розчин II: концентрація 20 000 мкг/мл - 25 0 мл розчину I + 25 0 мл води. Розчин III: концентрація 10 000 мкг/мл - 25 0 мл розчину II + 25 0 мл води. Кінцева концентрація в середовищі Льовенштайна-Єнсена Концентрація мкг/мл 4 0 2 0 1 0 0 5 0 25 Середовище Льовенштайна- Єнсена мл 225 0 225 0 225 0 90 0 90 0 Дистильована вода мл 0 0 0 5 0 7 5 Розчин  I мл 25 0 0 0 0 0 Розчин II мл 0 25 0 0 0 0 Розчин III  мл 0 0 25 0 5 0 2 5 За рекомендаціями ВООЗ досліджуються концентрації: 1 0 г/л; 2 0 г/л і 4 0 г/л. "Критична" концентрація в середовищі 1 0 г/л відповідає невисокому ступеню стійкості. II Приготування суспензії культури МБТ Готують гомогенну бактеріальну суспензію в 0 9 % розчині NaCl. Для цього культуру що виросла на твердому живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена знімається тампоном попередньо змоченим у стерильному 0 9 % розчині NaCl при цьому тампон повинен стикатися з усією поверхнею середовища. Потім тампон занурюють в пробірку що містить 2 0 мл стерильного 0 9 % розчину NaCl культуру змивають в рідину попередньо розтираючи по внутрішнім стінкам пробірки. Пробірку залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі для осадження крупних часточок культури. Суспензію культури стандартизують по бактеріальному стандарту каламутності 1 McF. Для цього суспензію без осаду обережно не торкаючись дна пробірки вдсмоктують ппеткою в іншу пробірку з 0 9 % розчином NaCl. З цієї суспензії готуються наступні розведення: - 1:10 0 9 мл 0 9 % розчину NaCl + 0 1 мл суспензії ; - 1:100 - контроль 1 К1 1 8 мл 0 9 % розчину NaCl + 0 2 мл розведення 1 ; - 1:1000 - контроль 2 К2 1 8 мл 0 9 % розчину NaCl + 0 2 мл К1 ; - 1:10000 - контроль 3 К3 1 8 мл 0 9 % розчину NaCl + 0 2 мл К2 . Пробірки маркують. З кожної пробірки К1 К2 К3 робиться висів бактеріальної суспензії в кількості 100 0 мкл 0 1 мл на середовище Льовенштайна-Єнсена. Це контрольні пробірки. З розведения 1:100 = К1 по 100 0 мкл 0 1 мл суспензії культури засваться на пробірки з середовищем Льовенштайна-Єнсена що містять вказан вище концентрації препаратів. Пробірки маркрують і поміщають в горизонтальному положенн в термостат при 37 град. Цельсію наступного дня перекривають стерильними гумовими корками для запобігання висихання середовища і ставлять вертикально. Посіви проглядають щотижня. Через 2-4 тижн. після посіву максимум через 6 тижнів реєструють отримані результати. Оцінка результатів. При обліку результатів за методом Канетт кількість колоній що виросли в контрольній пробірці К1 вихідне розведення мікробної суспензії 1:100 приймається за 100 %; кількість колоній що виросли в К2 відповідає 10 % усі бактеріальній популяції; кількість колоній що виросли в К3 відповідає 1 % бактеріально популяції. Якщо в контрольних пробірках К1 К2 К3 при посіві досліджуваного штаму МБТ спостерігається ріст відповідно до вищезгаданих пропорцій можна робити облік результатів стійкості в пробірках з препаратами. При цьому в К3 повинно бути більше 30 не більше 100 колоній. Інтенсивність росту в контролях в пробірках з препаратами оцінються в такий спосіб: - - до 10 колоній; 1 + - 10-20 колоній; 2 + - 20-100 колоній між колоніями можна бачити острівці середовища; 3 + - більше 100 колоній. Культура МБТ є "чутливою" якщо в пробірці з "критичною" концентрацією препарату нема росту або спостерігаться до 10 колоній тобто менше 1 % бактеріальної популяції. Культура МБТ є "стійкою" якщо в пробірці з "критичною" концетрацією препарату спостерігаться більше 10 колоній тобто більше 1 0 % бактеріальної популяції. Дослідження потрібно повторити якщо: - нема пропорційності росту між К1 К2 К3; - К3 - негативний або виросло менше 30 колоній; - К1 К2 К3 або один з них забруднено; - забруднені пробірки з препаратами. Результати визначення резистентності вносяться в таблицю: Дослідження мікобактерій на чутливість до антимікобактеріальних препаратів Концентрація в живильному середовищі мкг/мл 0 2 0 5 1 0 2 0 4 0 8 0 16 0 20 0 32 0 40 0 Оцінка Ізоназид INH х Рифампцин RMP х Стрептомцин SM х Етамбутол EMB х Протонамд PTH х Амід нікотинової кислоти NSA г/л х Контролі Позначення результату: Оцінка росту: 1......... 2......... 3......... - Ч - чутливі; - С - стійкі. - 3+ - більше 100 колоній; - 2+ - 20-100 колоній; - 1+ - 10-20 колоній; - до 10 колоній. Примітка: х - позначені критичні концентрації препаратів в середовищі Льовенштайна - Єнсена. 5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів Відомо що бактеріальна популяція виділена з патологічного матеріалу часто містить суміш стійких і чутливих мікобактерій. Крім того вона може містити особини з неоднаковим ступенем стійкості до одного або до декількох медикаментозних засобів а також мікобактерії з мульти- і полірезистентністю. Монорезистентною вважається культура M.tuberculosis зі стійкістю до будь-якого одного препарату першого ряду. До першого ряду антимікобактеріальних препаратів відносять ізоніазид рифампіцин етамбутол і стрептоміцин. До полірезистентних культур відносять штами M.tuberculosis які резистентні до двох і більше антимікобактеріальних препаратів першого ряду. Мультирезистентні варіанти M.tuberculosis - це специфічний тип полірезистентності який спостерігається при одночасній резистентності до ізоніазиду і рифампіцину з або без резистентності до інших антимікобактеріальних препаратів The European Respiratory Jornal. - 2000. - V. 16. - P. 364 - 371 . Визначення чутливості M.tuberculosis як правило проводиться окремо до кожного антимікобактеріального препарату. Стійкість культури до двох або декількох препаратів може бути обумовлена декількома причинами: або всі мікробні особини даної культури стійкі до двох препаратів для них введено термін "істинна" подвійна стійкість або культура складається із суміші мікробних особин із яких одна частина стійка до одного препарату а інша - до іншого для цієї категорії культур введений термін "помилкова" подвійна стійкість . Для визначення "істинної" і "помилкової" подвійної стійкості M.tuberculosis був запропонований метод перехресних пересівів а також пересівів стійкої культури на середовища що містять суміш препаратів до яких була визначена подвійна стійкість. Наприклад виявлена стійкість до 5 0 мкг/мл стрептоміцину і до 1 0 мкг/мл ізоніазиду. При методі перехресних пересівів культуру яка виросла на щільному середовищі що містить 5 0 мкг/мл стрептоміцину пересівають на середовище що містить 1 0 мкг/мл ізоніазиду. Культуру що виросла на середовищі з ізоніазидом пересівають на середовище що містить стрептоміцин. При визначенні медикаментозної стійкості мікобактерій до суміші препаратів стійку культуру засівають у пробірку із середовищем що містить суміш препаратів в тих концентраціях до яких була виявлена стійкість. При "істинній" подвійній стійкості культура росте при пересіві на середовища що містять окремо обидва препарати і на середовищі з сумішшю. При "помилковій подвійній стійкості культура не росте на середовищі що містить суміш препаратів і не росте при перехресних пересівах. Схема 5.1 - "Істина" та "помилкова" подвійна резистентність M.tuberculosis Медикаментозна стійкість M.tuberculosis Препарати в середовищі Стрептоміцин Ізоніазид 5 0 мкг/мл   1 0 мкг/мл Стрептоміцин Ізоніазид 5 0 мкг/мл  +1 0 мкг/мл Подвійна "істинна" + \      / + \  / /\ +  /    \  + --      -- + Подвійна "помилкова" + \      / + \  / /\ -  /    \  - --      -- - Примітка: "+" - ріст M.tuberculosis;               "-" - відсутність росту M.tuberculosis; \      /   \  /         - перехресний пересів культур M.tuberculosis.    /\  /    \ --      -- 5.4 Визначення чутливості M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров'яного живильного середовища Роблять змив культури яку отримали на яєчному живильному середовищі Льовенштайна-Єнсена за методикою описаною вище. З надосадної рідини концентрація мікробних тіл у якій приблизно відповідає стандарту каламутності 5 одиниць на вузьке скельце у кюветі наноситься 2 краплі на 1/3 скельця. Далі роблять те саме що і при культивуванні мікобактерій. Мазки занурюють у пробірки з живильним середовищем у якому розведені різні концентрації антибактеріальних препаратів а також у 2-3 пробірки з середовищем без препаратів контролі . Зроблені в такий спосіб посіви культури в кров'яне середовище що містить антибактеріальні препарати і контролі інкубуються при 37 град. Цельсію 8-12 діб. Підготовка мазків до обліку робиться за загальноприйнятою методикою - метод Прайса . Через 8 днів виймають 1 з контролів фарбують за Цілем-Нільсеном мікроскопують. Якщо під малим збільшенням мікроскопа видно рясний ріст мікроколоній - "кіс" можна робити облік результатів. Якщо ріст в контролі недостатній - пробірки залишають в термостаті ще на 2 дні після чого фарбують інший контроль. Облік результатів: а якщо мікроколонії виявляються тільки в контрольних мазках а в інших мазках спостерігаються лише поодинокі клітини то вони є чутливими до данної концентрації препарату. б якщо в мазках що культивувалися в середовищі з антибактеріальним препаратом виявляються такі ж мікроколонії як і в контрольних мазках то такі мікобактерії є стійкими до данного препарату. в якщо в мазку що культивувався в середовищі з яким-небудь препаратом виявляються мікроколонії поряд з поодинокими клітинами це значить що дана популяція мікобактерій містить як чутливі так і стійкі мікобактерії. При відсутності росту чи наявності лише поодиноких мікроколоній у контрольних мазках облік не проводять і дослід варто повторити. Результати досліду також не враховуються при відсутності МБТ у контрольних мазках незважаючи на можливий ріст або інгібування МБТ у мазках які культивувалися в середовищах з препаратами. 5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих Експериментальні дослідження і клінічні спостереження показали що є чітка залежність лікувальної дії антимікобактеріальних препаратів від їх концентрації в крові. У свою чергу рівень бактеріостатично активного препарату в крові і вогнищах уражень залежить від фізико-хімічних властивостей ліків умов їх всмоктування розподілу біотрансформації і швидкості елімінації тобто від фармакодинаміки і фармакокінетики препарату. Велике значення має також доза препарату метод введення і комбінації його з іншими медикаментозними засобами. Тому визначення фармакокінетики препарату в крові хворого може допомогти клініцистам у прогностичній оцінці ефективності терапії уточненні її тактики та способу введення препарату його оптимальних дозувань і найбільш ефективних комбінацій препаратів. Раціональним є паралельне визначення концентрації препарату в крові хворого і визначення чутливості виділених M.tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів. Співставлення результатів цих визначень може підказати клініцистам більш правильну тактику подальшого лікування хворого. Визначення концентрації в крові застосованих у клініці антимікобактеріальних препаратів раціонально визначати мікробіологічним методом тому що останній дозволяє визначати не тільки антимікобактеріальну дію самого препарату але й всю сукупність метаболітів що мають бактеріостатичну активність що у більшості випадків неможливо визначити хімічними методами. При мікробіологічному методі як тест-мікроб використовують лабораторний штам M.tuberculosis. 5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі Принцип. Приготування серійних розведень зразка крові хворих що одержали тест-дозу антимікобактеріальних препаратів у рідкому живильному середовищі з наступним внесенням у кожне розведення дозованої кількості тест-мікробів. Після періоду інкубації відзначають наявність або відсутність росту мікобактерій в кожному з розведень. Метод дозволяє визначити максимальне розведення крові що затримує ріст тест-мікробів із відомою чутливістю до даного препарату. Концентрація препарату в крові обчислюється множенням показника розведення крові на мінімальну інгібуючу концентрацію МІК препарату по відношенню до тест-штаму в контрольному досліді. Компоненти: 1. Синтетичне середовище Проскауера - Бека: - L-аспарагін - 5 0 г або глікокол - 8 0 г ; - калій фосфорнокислий однозаміщений - 5 0 г; - калій сірчанокислий - 0 5 г; - гліцерин - 20 0 мл; - лимоннокисла магнезія * - 1 5 г; - дистильована вода - до 1000 0 мл. * Примітка: лимоннокисла магнезія додається до середовища після встановлення рН 7 0 - 7 1 для цього середовище підлужується 40 0 % розчином їдкого натрію . Середовище автоклавують 20 хвилин під тиском 0 5 атм. або піддають дрібній стерилізації. 2. Сироватка нормальна коняча. Вноситься в середовище Проскауера-Бека безпосередньо перед дослідом в кількості 1:10 10 0 % . 3. Тонка плівка тест-штаму M.tuberculosis пересіяна на середовище за 8 - 12 днів перед дослідом молода культура . Підготовка до визначення. Досліди проводять у бактеріологічних пробірках в які розливають по 3 0 мл середовище Проскауера - Бека що містить 10 0 % нормальної конячої сироватки. На кожний дослід використовують ряд пробірок числом від 6 до 10 в залежності від активності препарату концентрацію якого визначають . Якщо дослідження проводиться в період лікування хворого то якнайменше за 1 добу відміняють всі антибактеріальні препарати. В день дослідження хворому вранці натщесерце дають тест-дозу препарату як правило разову терапевтичну дозу . Через 2 години після перорального прийому ізоніазиду рифампіцину етамбутолу канаміцину фторхінолонів або через 3 години після прийому етіонаміду із ліктьової вени беруть рівно 3 0 мл крові і виливають її в асептичних умовах в стерильну пробірку що містить 1 0 мл 5 0 % стерильного розчину цитрату натрію як антикоагулянта . В лабораторії в пробірку з цитратною кров'ю додають рівно 2 0 мл стерильної дистильованої води ретельно перемішують. Отримують розведення крові 1:2. Далі мірною кінцевою піпеткою ємністю 5 0 мл відсмоктують 3 0 мл і переносять у пробірку з 3 0 мл середовища отримують розведення 1:4 і т.д. - серійні розведення крові. У останню пробірку кров не вносять - контроль. Для кращого перемішування крові з середовищем перед тим як перенести кров в наступну пробірку треба тричі перемішати її піпеткою. Далі на поверхню кожної пробірки починаючи з контрольної бактеріологічною лопаткою поміщають невеличкий шматочок заздалегідь за 8-12 днів вирощеної плівки тест-штаму M.tuberculosis найчастіше користуються лабораторним штамом H37Rv або Academia . Пробірки поміщають в термостат при 37 градусів Цельсію на 7 - 10 днів поки в контрольній пробірці плівка розростеться займаючи всю поверхню живильного середовища. Паралельно проводиться дослід по визначенню МІК препарату по відношенню до даного тест-штаму. Для цього роблять розведення препарату щоб отримати серію випробовуваних концентрацій. 5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення МІК Ізоніазид 1-е розведення - 10 0 мг/мл: наважку 100 0 мг препарату заливають 1 0 мл етилового спирту для дезинфекції або беруть 1 0 мл 10 0 % розчину що також містить 100 0 мг ізоніазиду + 9 0 мл води. 2-е розведення - 1 0 мг/мл 1000 0 мкг/мл : 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 100 0 мкг/мл: 1 0 мл 2-го розведення + 9 0 мл води. 4-е розведення - 10 0 мкг/мл: 1 0 мл 3-го розведення + 9 0 мл води. 5-е розведення робоче Ц 0 4 мкг/мл: 0 4 мл 4-го розведення 4 0 мкг + 9 6 мл води. Далі роблять серійні розведення препарату в середовищі Проскауера-Бека що містить 10 0 % конячої сироватки заздалегідь розлите в ряд пробірок по 3 0 мл. Тобто із 5-го робочого розведення беруть 3 0 мл і вносять в 3 0 мл середовища отримуючи концентрацію 0 2 мкг/мл і т.д. - до концентрації 0 003 мкг/мл сьома пробірка . Восьма пробірка препарату не містить і служить контролем. Рифампіцин рифадин мікобутин 1-е розведення - 15 0 мг/мл: капсулу що містить 150 0 мг препарату висипають в стерильну пробірку + 1 0 мл етилового спирту + 9 0 мл води. 2-е розведення - 1 5 мг/мл 1500 мкг/мл : 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 150 0 мкг/мл: 1 0 мл 2-го розведення + 9 0 мл води. 4-е розведення робоче - 15 0 мкг/мл: 1 0 мл 3-го розведення + 9 0 мл води. Беруть 2 0 мл робочого розведення 4-го додають 4 0 мл середовища Проскауера-Бека отримуючи концентрацію 5 0 мкг/мл далі - серійні розведення в середовищі до 0 03 мкг/мл. Остання пробірка без препарату контроль . Етамбутол 1-е розведення - 20 0 мг/мл: таблетку етамбутолу що містить 400 0 мг препарату ретельно розтирають в ступці + 1 0 мл етилового спирту + 19 0 мл води. 2-е розведення - 2 0 мг/мл 2000 мкг/мл : 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 200 0 мкг/мл: 1 0 мл 2-го розведення + 9 0 мл води. 4-е розведення робоче - 20 0 мкг/мл: 1 0 мл 3-го розведення + 9 0 мл води. Беруть 3 0 мл робочого 4-го розведення і додають 3 0 мл середовища Проскауера-Бека в якому створюється концентрація препарату 10 0 мкг/мл. Далі - ряд серійних розведень у середовищі до 0 07 мкг/мл. Остання пробірка без препарату контроль . Етіонамід або протіонамід 1-е розведення - 25 0 мг/мл: таблетку що містить 250 0 мг препарату ретельно розтирають в стерильній ступці + 1 0 мл етилового спирту + 9 0 мл води. 2-е розведення - 2 5 мг/мл 2500 мкг/мл : 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 250 0 мкг/мл: 1 0 мл 2-го розведення + 9 0 мл води. 4-е розведення - 25 0 мкг/мл: 1 0 мл 3-го розведення + 9 0 мл води. 5-е розведення робоче Ц 5 0 мкг/мл: 1 0 мл 4-го розведення + 4 0 мл води. Далі роблять серійні розведення в середовищі заздалегідь розлитому по 3 0 мл шляхом внесення 3 0 мл робочого 5-го розведення. Отримують ряд пробірок з концентрацією від 2 5 мкг/мл до 0 04 мкг/мл у 7-й пробірці . Восьма пробірка - без препарату контроль . Канаміцин Беруть ампулу канаміцину що містить 500 0 мг в 2 0 мл тобто 250 0 мг/мл . 1-е розведення - 25 0 мг/мл: 1 0 мл із ампули + 9 0 мл води. 2-е розведення - 2 5 мг/мл 2500 мкг/мл : 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 250 0 мкг/мл: 1 0 мл 2-го розведення + 9 0 мл води. 4-е розведення робоче - 25 0 мкг/мл: 1 0 мл 3-го розведення + 9 0 мл води. Із 4-го робочого розведення що має концентрацію 25 0 мкг/мл беруть 1 0 мл додають 4 0 мл середовища Проскауера-Бека отримуючи концентрацію 5 0 мкг/мл далі - серійні розведення в середовищі до 0 31 мкг/мл 5 пробірок . Шоста пробірка - без препарату контроль . Фторхінолони ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин 1-е розведення - 25 0 мг/мл: таблетку ретельно розтирають у ступці + 1 0 мл етилового спирту. Якщо таблетка містить 250 0 мг препарату додають 9 0 мл стерильної дистильованої води якщо таблетка містить 500 0 мг - додають 19 0 мл води. 2-е розведення - 2 5 мг/мл 2500 мкг/мл: 1 0 мл 1-го розведення + 9 0 мл води. 3-є розведення - 250 0 мкг/мл: 1 0 мл 2-го розведення + 9 0 мл води. 4-е розведення робоче - 25 0 мкг/мл: 1 0 мл 3-го розведення + 9 0 мл води. Беруть 1 0 мл робочого розведення 4-го і додають 4 0 мл середовища Проскауера-Бека отримують концентрацію в середовищі 5 0 мкг/мл. Далі - ряд серійних розведень у середовищі до 0 07 мкг/мл. Остання пробірка без препарату контроль . Хід дослідження такий самий як і при визначенні концентрації препарату в крові хворого. Оцінка результатів. Результати досліду враховуються по інтенсивності росту плівки тест-штаму. Якщо плівка займає всю поверхню пробірки ріст оцінюється трьома хрестами + + + якщо плівка займає приблизно половину поверхні середовища - двома хрестами + + якщо ріст на 1/3 поверхні середовища - одним хрестом + . Найменша концентрація препарату що затримала ріст плівки і буде мінімальною інгібуючою концентрацією МІК цього препарату. При обчисленні концентрації препарату в крові величину МІК препарату множать на найбільше розведення крові хворого яке затримало ріст плівки. Наприклад у хворого визначають концентрацію ізоніазиду в крові після прийому разової дози препарату. Ріст плівки тест-штаму був затриманий розведенням крові 1:128 у наступному розведенні 1:256 уже був ріст плівки + + . Якщо МІК ізоніазиду відносно того ж тест-штаму за однакових умов дослідження та ж партія середовища і т.п. 0 025 мкг/мл то концентрація ізоніазиду в крові буде: 0 025 мкг/мл х 128 тобто 3 1 мкг/мл. 5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові БАК після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів туберкулостатична проба Суть дослідження полягає в тому що після прийому хворим будь-якого антимікобактеріального препарату кров набуває туберкулостатичної активності і при розведенні в 2 4 8 і т.д. раз затримує ріст M.tuberculosis. Про ступінь БАК судять по максимальному розведенню крові яке ще спроможне затримати ріст M.tuberculosis. БАК залежить від ряду факторів головним чином від дифузійних властивостей препарату прийнятої дози та чутливості до нього тест-штаму мікобактерій. Дослідження проводиться за тією ж методикою якою користуються при визначенні концентрації протитуберкульозного препарату в крові хворого тільки не визначають при цьому МІК препарату . Кров береться після прийому разової дози препарату на передбачуваному піку його концентрації в крові тобто при внутрішньом'язовому або внутрішньовенному введенні - через 1 годину якщо препарат вводиться крапельним способом фторхінолони Ц в кінці крапельниці після перорального прийому - через 2 - 3 години. Всі препарати хворий приймає після їжі крім рифампіцину який приймається перед їжею. Користуються двома способами визначення БАК. При одному з них тест-штамом який наноситься у вигляді плівки на розведення крові хворого в живильному середовищі Проскауера-Бека являється лабораторний штам M.tuberculosis H37Rv або будь-який інший штам M.tuberculosis чутливий до всіх антимікобактеріальних препаратів. Цей спосіб має свої недоліки: при його застосуванні не враховується чутливість чи стійкість мікобактерій самого хворого. Тому ступінь БАК препарату може бути високою при відсутності терапевтичного ефекту від його застосування у випадку резистентності збудника до даного препарату. Тому у випадках коли хворий виділяє мікобактерії стійкі до якогось препарату але все ж цим препаратом з якихось причин продовжують лікувати хворого застосовують другий спосіб. При цьому наносять на розведення крові плівку вирощену заздалегідь з штаму M.tuberculosis який виділяють у даного хворого. Цей спосіб менш поширений через певні складнощі в його застосуванні: необхідно мати культуру M.tuberculosis хворого на щільному середовищі і отримати з неї плівку на рідкому середовищі що вимагає значних затрат часу. Хворі на туберкульоз завжди приймають комбіновану антибактеріальну терапію. Тому особливо при дослідженні з використанням мікобактерій від самого хворого доцільно визначати сумарну БАК яка буде відображати істинну активність крові що створюється після прийому кількох препаратів. Оскільки препарати приймаються не одномоментно а з різними інтервалами між їх прийомом найбільш доцільно для визначення сумарної БАК брати кров 2 рази протягом дня. Перший раз - після 1-го прийому групи препаратів через 1 - 3 години. Наприклад: 1. Хворий отримав рифампіцин о 8 30 годин ранку і стрептоміцин внутрішньо-м'язово або ізоніазид внутрішньовеново об 11 00 годині. Кров при цьому треба взяти о 12-й годині. 2. Якщо рифампіцин був прийнятий о 8 30 годин ранку а етіонамид або інший таблетований препарат крім піразинаміду об 11 00 годині то кров беруть о 13 00 - 14 00 годині. 3. Якщо хворий отримує комбінований препарат то кров беруть через 2 - 3 години після його прийому. Вдруге кров беруть через 2 - 3 години після прийому другої групи препаратів. Наприклад: хворий отримав ізоніазид о 15 00 годині етамбутол о 19 00 годині; кров беруть о 21 00 годині. У тих випадках коли вся денна доза препаратів приймається через короткі проміжки часу майже одночасно перший раз кров беруть через 2 - 3 години а другий раз - через 10 - 12 годин після прийому препаратів. При сумарній БАК враховується синергійний вплив препаратів на збудника. Визначення БАК відносно лабораторного штаму M.tuberculosis або іншого чутливого до ліків штаму доцільно застосовувати у вперше виявлених хворих у яких передбачається чутливість збудника до антибактеріальних препаратів. Кров хворих які раніше не лікувались як правило буває високоактивною так само як і у хворих які вже приймали антимікобактеріальну терапію але їх M.tuberculosis все ще чутливі до препаратів. В останній групі можуть з'являтися хворі з чутливими M.tuberculosis але з низькими показниками БАК що в деяких випадках може пояснювати так звану клінічну медикаментозну стійкість. Визначення БАК відносно штаму M.tuberculosis самого хворого демонструє ступінь чутливості його мікобактерій до індивідуальної БАК препаратів яка створюється в його крові при певному режимі специфічної терапії. Данні БАК допомагають в корекції індивідуального режиму лікування. В тих випадках коли вже відомо що M.tuberculosis хворого стійкі до якихось препаратів при визначенні сумарної БАК з використанням лабораторного тест-штаму треба виключати ці препарати із тієї комбінації препаратів що їх дають хворому безпосередньо перед дослідженням БАК. У відповіді з лабораторії про дослідження БАК має значитись час прийому препарату і його доза для кожного препарату окремо час взяття крові який і є часом показника її активності за який приймається максимальне розведення крові яке ще затримало ріст плівки M.tuberculosis. Наприклад після прийому ізоніазиду хворим ріст плівки був затриманий в розведеннях крові від 1:2 до 1:128 в наступному розведенні 1:256 уже реєструється ріст плівки. Відповідь: Хворий о 8 30 прийняв 0 3 ізоніазиду. БАК об 11 00 - 1:128. БАК вважається високою якщо ріст M.tuberculosis затримує розведення крові 1:64 і вище задовільною при затримці росту в розведенні крові 1:16 - 1:32 низькою при затримці росту в розведенні 1:4 - 1:8. Затримка росту тільки в розведенні крові 1:2 не розцінюється як специфічна оскільки сама кров має певну антибактеріальну активність. В талиці 5.1 приведено середній діапазон показників БАК до кожного з антимікобактеріальних препаратів після прийому оптимальних доз при дослідженні у хворих з чутливими M.tuberculosis. Таблиця 5.1 - Діапазон БАК після прийому одного з препаратів у хворих з M.tuberculosis чутливих до антимікобактеріальних препаратів Препарат Дози в мг/кг після яких досліджувалась БАК Через який час брали кров Активність крові Ізоніазид Рифампіцин Стрептоміцин Етамбутол Етіонамід Канаміцин Офлоксацин або ципрофлоксацин 5 0 - 10 0 5 0 - 10 0 15 0 в/м 15 0 - 20 0 10 0 - 15 0 15 0 в/м 7 5 - 15 0 2 - 3 год 2 - 3 год 1 год 2 - 3 год 2 - 3 год 1 год 2 - 3 год 1:64 - 1:256 1:64 - 1:256 1:32 - 1:128 1:8 - 1: 32 1:8 - 1: 16 1:16 - 1: 64 1:8 - 1: 32 Визначення БАК може служити допоміжним методом контролю за ефективністю застосування того чи іншого препарату а також допомогає встановити індивідуальну активність нового препарату який передбачається призначити хворому.