МР 9.4.5.-126-2006

МР 9.4.5.-126-2006 Визначення віруліцидної активності дезінфекційних препаратів (Тимчасові методичні рекомендації)

ЗАТВЕРДЖЕНО Наказом МОЗ України від 26.05.2006 № 333 ВИЗНАЧЕННЯ ВІРУЛІЦИДНОЇ АКТИВНОСТІ ДЕЗІНФЕКЦІЙНИХ ПРЕПАРАТІВ тимчасові методичні рекомендації ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ У сучасний період у зв’язку з надходженням в Україну численних дезинфікуючих засобів з різних країн світу назріла нагальна необхідність у виданні методичних рекомендацій призначених для забезпечення стандартизованого підходу до вивчення нових дезінфектантів та дослідження на сучасному рівні їх віруліцидних властивостей. Методичні рекомендації по визначенню віруліцидної активності дезінфекційних препаратів в Україні підготовлені вперше. В їх основу було покладено методики що використовувалися в колишньому Радянському Союзі [1 2] та видані Міністерством охорони здоров’я республіки Бєларусь [3] з урахуванням власних модифікацій та сучасних підходів. Вони призначені для вірусологічних лабораторій які займаються дослідженням віруліцидних властивостей препаратів що використовуються для дезінфекції в осередках вірусних інфекцій для їх профілактики у лікувальних закладах лабораторіях відповідного профілю тощо . Пошук дезінфікуючих засобів щодо вірусів які викликають гострі і особливо хронічні інфекції є актуальною й достатньо складною проблемою. Зазначене обумовлене пріоритетним значенням вірусів в етіологічній структурі інфекційних захворювань. Понад 200 вірусів можуть спричинювати порушення з боку респіраторного тракту. Такі з них як віруси грипу парагрипу респіраторно-синцитіальні адено- риновіруси здатні щорічно викликати епідемічні спалахи. Крім того в останні роки з'явилися повідомлення про випадки ГРВІ етіологічними агентами яких стали генетично змінені віруси з підвищеною вірулентністю чи набутою здатністю до ураження респіраторного тракту людини. Як приклади можна навести нетипову пневмонію SARS що пов’язана з особливо вірулентним коронавірусом та пташиний грип у людей етіологічним агентом якого став вірус що походить від вірусу грипу птахів. Велика група вірусів здатна спричинювати патологію шлунково-кишкового тракту рота- каліци- астро- адено- пікорнавіруси . Особливою проблемою для установ та закладів охорони здоров’я є причетність вірусів до важких уражень нервової системи енцефалітів менінгітів паралітичних захворювань . Відомо що при хронічних вірусних захворюваннях ВІЛ гепатити В С герпетичні інфекції викликані вірусом герпесу простого типів 1 та 2 оперізуючий лишай цитомегаловірусна інфекція Епштейн-Барр тощо вірус тривалий час може циркулювати у складі імунних комплексів у вигляді дефектних часток або інтегрує в геном клітини. Зазначене необхідно враховувати при дезінфекції вірусовмісного матеріалу. Методи вивчення віруліцидної активності в значній мірі залежать від властивостей та області застосування досліджуваних препаратів. При знезаражуванні різних об'єктів вироби медичного призначення посуд білизна поверхні біоматеріал що мають найбільш епідеміологічне значення в поширенні інфекційних захворювань вірусної етіології розробляють ефективніші режими дезінфекції в залежності від концентрації діючої речовини та часу обробки. Вибір тест-вірусів для визначення активності дезінфікуючих засобів Визначення віруліцидної активності дезінфікуючих засобів здійснюється з обов’язковим використанням як ДНК- так і РНК-вмісних вірусів вони повинні легко культивуватися в лабораторних умовах бути відносно безпечними для працюючих та мати певну стійкість до дії фізико-хімічних факторів. Тому як тест-віруси використовують: * Вірус грипу типу А – представник слаборезистентної РНК-вмісної групи вірусів; * Поліовірус типу 2 вакцинний штам – високорезистентний представник РНК-вмісної групи вірусів; * Аденовірус типу 2 або вірус інфекційного гепатиту собак – високо- резистентні представники ДНК-вмісної групи вірусів. Тест-віруси повинні мати типові властивості та високий інфекційний титр у межах 7-8 lg ТЦД50/мл. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ Серед методів визначення віруліцидної активності дезінфекційних засобів найбільш поширені суспензійне дослідження та різні модифікації методу тест-об’єктів. Суспензійний метод дозволяє забезпечити контакт досліджуваного дезінфектанту з концентрованим вірусовмісним матеріалом у той час як створення високого вірусного навантаження на тест-об’єктах є достатньо проблематичним. Перевага суспензійного методу полягає у можливості моделювання дезінфекції біологічних рідин варіант з білковим навантаженням та відносна безпека його виконання для персоналу але інколи його використання неможливо у зв’язку з відсутністю прийнятних способів припинення дії дезінфектанту при завершенні експозиції з вірусовмісною рідиною. Метод тест-об’єктів дозволяє уникнути вказаних недоліків та краще змоделювати ситуацію з використанням реальних предметів що дозволяє безпосередньо вивчати ефективність дезінфекції. Тому нижче наводиться опис техніки виконання суспензійного методу та методу тест-об’єктів. І. Суспензійний метод дослідження віруліцидної активності препаратів І. 1 Культивування вірусів Поліовірус типу 2 вакцинний штам аденовірус типу 2 та вірус інфекційного гепатиту собак культивують на культурі клітин НЕр-2 епідермоїдної аденокарциноми гортані людини та Vero перещеплювальна культура клітин нирок зелених мавп [4]. Як ростові середовища використовують поживні середовища 199 та Ігла МЕМ з додаванням 5-7% ембріональної сироватки великої рогатої худоби. Як підтримуюче середовище використовують середовище 199 та Ігла МЕМ з додаванням 2% ембріональної сироватки великої рогатої худоби. Віруси грипу культивують на перещеплювальній культурі клітин МDСК перещеплювальна культура клітин нирок собак . На 2-7-му добу відбувається максимальне накопичення вірусу що супроводжується їх цитопатичною дією. Для підвищення титру вірусів виконують декілька пасажів. І. 2 Приготування вірусовмісної рідини Клітинні культури з повним цитопатичним ефектом викликаним тест-вірусами з культуральною рідиною переносять до стерильних пробірок заморожують відтаюють. Потім центрифугують при 1000 g протягом 10 хв. Надосадову рідину відсмоктують і використовують у досліді або зберігають при -10°С. Перед використанням визначають титр вірусовмісної рідини який повинен бути не нижчим ніж 7 lg ТЦД50/мл. Обчислення інфекційного титру вірусу проводять за методом Ріда і Менча [5]. І. 3 Приготування розчинів дезінфектантів Дослідний препарат розводять на дистильованій воді. При розведенні необхідно враховувати що дослідна концентрація дезінфектанту повинна міститися у суміші дезінфектанту з вірусовмісною рідиною. І. 4 Виконання суспензійного методу Одну частку вірусовмісної рідини змішують з однією часткою дистильованої води. Потім додають 8 часток розчиненого дезінфектанту у концентраціях в 1 25 разів більшу за кінцеву дослідну концентрацію. Витримують необхідну експозицію. Ефективність дезінфектанту досліджують без білкового навантаження та при його наявності. Концентрації дезінфектанту та тривалість експозиції його в суміші з вірусовмісною рідиною повинні бути підібрані так щоб результати досліду показували віруліцидний ефект дезінфектанту в залежності від концентрації та часу впливу. Після завершення експозиції до суміші вірус - дезінфектант додають рівну кількість розчину нейтралізатору на 5 хв. Після завершення заданих експозицій готують послідовні 10-кратні розведення суміші вірусовмісної рідини і дезінфектанту та інфікують пробірки з моношаром клітинної культури. 1.5 Визначення інфекційних ознак наявності вірусів Після завершення експозиції готують 10-кратні розведення суміші вірусовмісної рідини та дезінфекційного засобу охолодженим культуральним середовищем яким інфікують по 4 пробірки з моношаром клітинної культури. 1.5.1 Титрування мікрометодом Остаточну інфекційність вірусу визначають за його цитопатичною дією. У лунки пластикових мікропанелей заливають вірусовмісну рідину 10 6 кл/мл по 100 мкл у кожну лунку . Панелі інкубують у термостаті при 37° С та 5 0 % СО2 протягом 48-72 годин. Після формування моношару клітин його відмивають від ростового середовища соляним буферним розчином додають по 100 мкл свіжого середовища підтримки і по 100 мкл розведеної суміші вірусу з дезінфектантом. Через 24-48 годин інкубації для оцінки цитопатичної дії вірусу мікропанелі переглядають під інвертованим мікроскопом. 1.6 Вірус імунодефіциту людини вірус гепатиту В У паспортних даних сучасних дезінфекційних засобах містяться дані про їх віруліцидну дію на віруси імунодефіциту людини та гепатиту В. Методи дослідження цієї дії відрізняються від наведених вище. 1.6.1 Вірус імунодефіциту людини Клітини МТ-4 культивують на мікротитрувальних панелях з плоскодонними лунками. Використовують середовище RРМІ-1640 яке вміщує 10 % ембріональної телячої сироватки 0 03 % L- глутаміну 0 01М НЕРЕS 50 мкг/мл гентаміцину. Розведення суміші вірусу та дезінфекційного засобу додають до клітинної культури. Про ефективність дії дезінфекційного засобу судять по наявності цитопатичної дії вірусу утворення синцитіїв кількості живих та мертвих клітин та накопиченню позаклітинного антигену у культуральній рідині у пробах без дезінфектанту та оброблених ним. В останньому випадку використовують комерційну тест-систему для виявлення білку р24. 1.6.2 Вірус гепатиту В Маркерами вірусу гепатиту В якій не вдалося культивувати до теперішнього часу при вивченні віруліцидних властивостей дезінфекційних засобів є антигени та геноми вірусу. Антигенну активність дослідних та контрольних проб оцінюють за допомогою стандартних комерційних імуноферментних тест-систем для виявлення НВs- та НВе- антигенів вірусу гепатиту В у відповідності з інструкціями щодо їх застосування. ДНК вірусу визначають методом молекулярної гібридизації. Про ефективність дезінфекційного засобу судять по втраті або зниженні вмісту антигенів або ДНК вірусу. 1.7 Контролі Кожний дослід супроводжують наступними контролями: 1. Контроль клітинної культури – залишають незараженими по 4 пробірки з клітинним моношаром протягом всього терміну спостереження; 2. Контроль вірусу; 3. Контроль вірусу у суміші з білковим навантаженням; 4. Контроль токсичності суміші дезінфектанту з нейтралізатором; 5. Контроль повноти нейтралізації дезінфектанту. 6. Контроль дезінфікуючої дії референс-дезінфектант : паралельно до основного досліду виконують дослідження формальдегіду при рН 7 0 без сироватки. Концентрація останнього повинна бути 0 7 г/100мл. Для виконання цього контролю одну частину вірусовмісної рідини змішують з 4 частками розчину Хенксу і 5 частками 1 4 % розчину формальдегіду. 2. Вивчення віруліцидних властивостей дезінфікуючих засобів на батистових тест-об’єктах 2.1 Підготовка батистових тест-об'єктів Вірусовмісну рідину для контамінації тест-об’єктів готують як вказано у п. І.2. Тест-об'єкти – це шматочки батисту розміром 1 х 0 5 см попередньо звільненого від крохмалю. Батистові тест-об'єкти кладуть у стерильну чашку Петрі і заливають вірусовмісною рідиною з розрахунку 0 05-0 1 мл рідини на тест-об’єкт. Всі тест-об’єкти добре змочуються. Через 20 хв. тест-об'єкти висушують стерильним фільтрувальним папером а потім підсушують у термостаті при 370С або в ексикаторі з хлористим кальцієм протягом 30 хв. Готові тест-об’єкти повинні бути використані в день приготування щоб запобігти падінню титру вірусу. Кількість вірусу на тест-об’єктах повинна бути максимально можливою що важливо для компенсування його втрати при наступній обробці тест-об’єктів. 2.2 Виконання методу При визначенні віруліцидних властивостей препарату готують 3-5 концентрацій розчину на дистильованій чи дехлорованій водопровідній воді з розрахунку 1 0 мл розчину на кожний тест-об'єкт робочі розчини . У робочі розчини занурюють інфіковані тест-об'єкти з розрахунку 5 штук на кожну експозицію. Легким погойдуванням колби з розчином досягають повного змочування всіх тест-об'єктів. Змочування тест-об'єктів вважають початком досліду. З цього моменту відраховують час експозиції. Колбу залишають при кімнатній температурі 18-20°С . Після закінчення визначених експозицій стерильним охолодженим пінцетом чи петлею витягають по 5 тест-об'єктів занурюють їх у пробірку з 5 мл стерильного розчину нейтралізатора на 5 хв. для галоїдовміщуючих препаратів перекисних сполук як нейтралізатор використовують 0 5-1 0 % розчин гіпосульфіту натрію; для альдегідів - 0 5-1 0 % розчин аміаку чи бісульфіту натрію; для кислот - 0 5% розчин їдкого натрію чи калію або 0 5% розчин бікарбонату натрію; для лугів - 0 5-1 0% розчин оцтової кислоти; для четвертично-амонієвих сполук амфолітів - 0 2% розчин сульфанолу в 10% розчині молока; для препаратів з невідомим нейтралізатором а також для препаратів що добре розчиняються у воді фенольного ряду використовують дворазове промивання у воді. Після цього стерильною петлею тести переносять у пробірку зі скляними кульками та 5 мл стерильного фізіологічного розчину. У цій пробірці струшують тест-об'єкти протягом 10 хв. потім у 4 пробірки на кожне дослідження з моношаром клітинних культур додають 1 мл підтримуючого середовища 0 2 мл рідини відмитої з тестів вміщують у термостат де витримують при температурі 36 5°С протягом періоду спостереження. Облік результатів проводять протягом терміну спостереження переглядаючи пробірки під мікроскопом. Якщо в клітинних культурах не відбувається типової цитопатичної дегенерації то додатково роблять 2 пасажі. При відсутності специфічної зміни в клітинних культурах тест-віруси вважають інактивованими дослід повторюють з меншими концентраціями препарату й експозиціями; при наявності цитопатогенної дії дослід повторюють з більшими експозиціями й концентраціями препарату. Кожний дослід супроводжують наступними контролями: 1 контроль зараженості тест-об'єктів - 5 штук заражених тест-об'єктів занурюють у пробірку зі скляними кульками та 5 мл фізіологічного розчину. Відбивають протягом 10 хв. Відповідною дозою рідини відмитої з тест- об’єктів заражають 4 пробірки з моношаром клітинних культур. Для з'ясування вірусного навантаження при контамінації тест-об’єктів проводять титрування. 2 Контроль збереження життєздатності вірусу - 5 штук заражених тест-об'єктів занурюють у пробірку з розчином Хенксу витримують максимальну експозицію після чого переносять на 5 хв. у 5 мл нейтралізатора а потім у 5 мл фізіологічного розчину де струшують зі скляними кульками і заражають відповідною дозою рідини відмитої з тестів 4 пробірки з моношаром клітинних культур. Для з'ясування кількості збереженого вірусу проводять титрування. 3 Контроль повноти нейтралізації дезінфектанту - 5 штук незаражених тест-об'єктів занурюють на максимальну експозицію в 5 мл розчину дезінфектанту максимальної концентрації після чого переносять тест- об’єкти на 5 хв. у 5 мл розчину нейтралізатора потім - у 5 мл фізіологічного розчину. Відбивають зі скляними кульками протягом 10 хв. Вносять відповідну кількість рідини в 4 пробірки з моношаром клітинних культур. Висновок про повноту нейтралізації дезінфектанту роблять на підставі відсутності токсичної дії на культуру клітин протягом всього періоду досліду. 4 Для контролю клітинних культур - залишають незараженими по 4 пробірки з моношаром клітинних культур і спостерігають максимальний термін досліду. Через 24 години як у дослідних так і в контрольних пробірках змінюють підтримуюче середовище. Упродовж спостереження підтримуюче середовище змінюють у залежності від зміни рН. 5 Контроль дезінфікуючої дії референс-дезінфектант : паралельно основному досліду виконують дослідження формальдегіду при рН 7 0 без сироватки. Концентрація останнього повинна бути 0 7 г/100мл. Для виконання цього контролю одну частину вірусовмісної рідини змішують з 4 частками розчину Хенкса 5 частками 1 4 % розчину формальдегіду. Після встановлення наявності віруліцидних властивостей у дезінфікуючого засобу вивчають залежність ефективності від концентрації діючої речовини часу впливу температури реакції середовища. Кожен дослід повторюють не менше 3 разів. Вплив температури на активність дезінфікуючого засобу вивчають при знезаражуванні інфікованих батистових тест-об'єктів з використанням водяної бані. При вивченні впливу рН середовища на активність препарату готують ряд розведень з різними значеннями рН шляхом підкислення децинормальним розчином оцтової чи іншої кислоти чи підлужуванням децинормальним розчином лугу. Порядок проведення дослідів такий же як з інфікованими тест-об'єктами описано вище . 3. Вивчення віруліцидної активності дезінфектантів при знезаражуванні посуду При знезаражуванні посуду як тест-об'єкти використовують тарілки склянки емальовані кружки виделки ложки. Чистий посуд тарілки склянки контамінують вірусовмісною рідиною що наносять піпеткою з розрахунку 0 5 мл на 100 см2 і рівномірно розподіляють по поверхні стерильним скляним шпателем. Виделки і ложки занурюють у вірусовмісну рідину на 1-2 хв. так щоб ручки залишалися незараженими. Заражений посуд підсушують при кімнатній температурі. Після висихання посуд повністю занурюють у дезінфікуючий розчин. Витрата розчину складає приблизно 2 л на комплект посуду: чашка блюдце 2 тарілки ложка вилка ніж. Через визначені інтервали наприклад 15 30 60 хв. посуд витягають з дезінфікуючого розчину і перевіряють ефективність знезаражування. Для цього стерильними марлевими серветками розміром 3х3 см ретельно протирають заражену частину кожного предмету. Серветки нейтралізують у 5 мл нейтралізатора. Після чого поміщають їх в стерильну широку пробірку з розчином Хенксу та скляними кульками і відмивають шляхом струшування протягом 10 хв. Цією рідиною заражають по 4 пробірки з моношаром клітинної культури. Контролем служить аналогічно контамінований посуд занурений на максимальну експозицію в стерильну або кип'ячену водопровідну воду. Після чого з посуду беруть пробу як і в досліді. Вірусне навантаження визначають титруванням. При одержанні 100% знезаражування чистого посуду переходять до знезаражування посуду забрудненого залишками їжі. Для цього манну кашу зварену на молоці і заправлену вершковою олією змішують з вірусовмісною рідиною з розрахунку 9 г каші на 1 мл суспензії і наносять рівномірно на предмети посуду. Методика знезаражування посуду відбір проб є аналогічним зазначеному для чистого посуду. Рідину після відмивання серветок центрифугують при 1500 g протягом 10 хв. після чого надосадову рідину використовують для зараження пробірок з моношаром клітинної культури. Контролем служить аналогічно контамінований посуд занурений на максимальну експозицію в стерильну або кип'ячену воду. Після чого з посуду беруть пробу як і в досліді. Для з'ясування вірусного навантаження проби титрують. 4. Вивчення віруліцидної активності дезінфектантів при знезаражуванні виробів медичного призначення При знезаражуванні виробів медичного призначення виготовлених з різноманітного матеріалу: скла металу гуми і пластмаси штучно контамінованих вірусами проводять дії аналогічні щодо знезараження посуду. Як білкове навантаження використовують 40 % сироватку великої рогатої худоби. При проведенні знезараження виробів необхідно звернути увагу на важкодоступні для дезінфекційних розчинів місця обробки що може спричинити збільшення експозиції або концентрації дезінфекційного засобу. 5. Вивчення віруліцидної активності дезінфектантів при знезаражуванні білизни При знезаражуванні білизни враховують норму витрати розчину на 1 кг сухої білизни при особливо небезпечних інфекціях витрата розчину складає 5 л/кг при інших – 1 л/кг температуру розчину ступінь і характер забруднення білизни вплив дезінфікуючого розчину на міцність і фарбування білизни. Контроль ефективності знезаражування білизни дезінфікуючим розчином проводять за допомогою батистових тест-об'єктів. Заражені і підсушені тест-об'єкти кладуть у бязеві стерильні мішечки розміром 5х8 см по 5 штук у кожний. Мішечки закривають у вигляді конверту до кута пришивають нитку довжиною близько 0 5 м. Дезінфікуючий розчин готують перед дослідом на стерильній дистильованій водопровідній воді. Білизну старі бязеві халати і рушники занурюють у бак або відро з дезінфекційним розчином послідовно одну річ за іншою стежачи за тим щоб між речами не утворилося повітряних прошарків що перешкоджають процесу дезінфекції. Одночасно між шарами білизни розміщують зверху у середині і знизу мішечки з зараженими тест-об'єктами. Через визначені проміжки часу мішечки з тест-об'єктами виймають одночасно з трьох шарів. Тест-об'єкти достають з мішечка стерильним пінцетом нейтралізують промивають і рідиною відмитою з тест-об’єктів заражають 4 пробірки з моншаром клітинної культури. У контрольних дослідах білизну занурюють у стерильну або кип'ячену водопровідну воду. Мішечки з тест-об'єктами закладають так само як у досліді. При одержанні позитивних результатів 100% інактивація тест-вірусів у дослідах по знезаражуванню чистої білизни контамінованої вірусом переходять до дослідів по знезаражуванню забрудненої білизни. З цією метою при роботі з вірусами з крапельним механізмом передачі до 6 мл вірусовмісної рідини додають 4 мл інактивованої сироватки великої рогатої худоби змішують і заливають 50 штук тест-об?єктів. При роботі з аденовірусом - до 6 мл вірусовмісної рідини додають 4 мл 40 % емульсії фекалій 8 г попередньо простерилізованих автоклавуванням при 1 5 атм протягом 30 хв. фекалії розтирають у ступці з 20 мл води . Отриманою суспензією заражають тест-об'єкти підсушують і використовують у досліді. Ефективним вважають засіб що забезпечує 100% інактивацію вірусу при знезаражуванні білизни. 6. Вивчення віруліцидної активності дезінфектантів при знезаражуванні поверхонь Як тест-об'єкти використовують поверхні розміром 10х10 см із різноманітних матеріалів у залежності від призначення дезінфекційного засобу: дерев'яні заштукатурені пофарбовані масляною або клейовою фарбою обклеєні шпалерою а також поверхні з лінолеуму кахлю металу гуми пластику скла тощо. Поверхні піддають механічному очищенню миють водою з милом і щіткою за винятком поверхонь обклеєних шпалерою і пофарбованих клейовою фарбою. Останні протирають кілька разів стерильною серветкою зволоженою стерильною водопровідною водою. Після підсихання поверхні стерилізують розташовують горизонтально і піпеткою наносять вірусовмісну рідину з розрахунку 0 5 мл на площу в 100 см2 рівномірно розподіляють по поверхні скляним шпателем. Поверхні підсушують при кімнатних умовах температура 18-200С і відносна вологість повітря 50-60% . Дезінфікуючий розчин наносять на поверхню шляхом зрошення з пульверизатора з контролем витраченої рідини. Норма витрат становить 300-500 мл розчину на м2 обробленої площі. Контроль ефективності знезаражування здійснюють через встановлені проміжки часу у такий спосіб: відбір проб проводять шляхом ретельного протирання зрошених поверхонь зволоженою стерильною марлевою серветкою 3x3 см а потім сухою серветки зволожують фізіологічним розчином або розчином Хенкса з антибіотиками . Марлеві серветки відмивають у 5 мл нейтралізатора або в стерильній водопровідній воді протягом 10 хв. струшують зі скляними кульками. Відмивною рідиною заражають 4 пробірки з моношаром клітинної культури. У контрольних дослідах аналогічно заражені поверхні зрошують стерильною або кип'яченою водопровідною водою з того ж розрахунку 300-500 мл/м2 поверхні що і дослідні. Відбір проб та їхню обробку проводять аналогічно дослідним. Для з'ясування вірусного навантаження при контамінації об’єктів проводять титрування. 7. Вивчення віруліцидної активності дезінфікуючих засобів при знезаражуванні сечі При вивченні віруліцидної активності дезінфікуючих засобів у дослідах із сечею враховують співвідношення дезрозчину і сечі концентрацію діючої речовини час обробки температуру. Досліди по знезаражуванні сечі проводять у такий спосіб: беруть декілька колб або пробірок наливають у них по 9 мл прокип’яченої сечі додають по 1 мл вірусовмісної рідини. Розчини досліджуваного дезінфікуючого засобу готують у концентраціях що забезпечують віруліцидний ефект при досліді на тест-об’єктах після 10-15 хв. впливу. Розчини дезінфікуючого засобу додають до сечі в рівному або подвійному в порівнянні з нею об’ємі. Після закінчення експозицій наприклад 15 30 60 хв. піпеткою відбирають зазначену суміш у кількості 1 мл і переносять у пробірки з 5 мл нейтралізатора. Після ретельного змішування заражають по 4 пробірки з моношаром клітинної культури. Контролем служать аналогічно поставлені досліди з додаванням до сечі води замість дезінфікуючого розчину. Результати дослідів враховують відносно контролю. Вірусне навантаження при контамінації сечі в контролі визначають титруванням. Остаточне рішення про ефективність дії дезінфікуючого засобу роблять на підставі не менше 3 дослідів зі співпадаючими результатами. Ефективними вважають засоби що забезпечують 100% інактивацію вірусу. 8. Вивчення віруліцидних властивостей дезінфікуючого засобу при знезаражуванні фекальних мас При розробці режимів знезаражування фекальних мас враховують співвідношення дезінфікуючого засобу до знезараженої маси час обробки температуру консистенцію знезаражених виділень ступінь гомогенізації в процесі знезаражування. Досліди проводять у такий спосіб: 20 г простерилізованих фекальних мас розтирають у ступці й додають 80 мл води; отриману емульсію розливають піпеткою в пробірки по 9 мл і додають по 1 мл вірусовмісної рідини. Досліди починають ставити з концентрацією препарату яка викликає інактивацію тест-вірусів в сечі через 30 хвилин. Отриману емульсію фекалій заливають рівним або подвійним об’ємом дезінфікуючого розчину і надалі відбирають проби так само як і при знезаражуванні сечі. Взяті проби центрифугують при 1500 g протягом 20 хв. після чого заражають по 4 пробірки з моношаром клітинної культури. Контролем служать аналогічно поставлені досліди з додаванням води замість дезінфікуючого розчину. Результати дослідів враховують відносно контролю. Ефективність досліджуваного дезінфекційного засобу оцінюють на основі не менше 3 дослідів зі співпадаючими результатами. Проводять титрування для визначення вірусного навантаження. Ефективним вважають засіб що забезпечує 100% інактивацію вірусу в матеріалі. 9. Вивчення віруліцидної активності аерозольних препаратів Для одержання вірусного аерозолю використовують вірусовмісну рідину п.1.2 . Вивчення віруліцидної активності аерозолів проводять в експериментальній камері в якій за допомогою розпилювача диспергують вірусовмісну рідину. При продуктивності розпилювача 0 25 мл/хв диспергування рідини проводять протягом 5 хв. При цьому в повітрі камери тримається 1 мл/м3 вірусовмісної рідини. Вірусне навантаження змінюють у залежності від розведення вірусовмісної рідини. Для контамінації повітря при вивченні віруліцидної активності препаратів використовують вірусовмісну рідину в розведеннях від 10-1 до 10-3. Для визначення вмісту вірусу в повітрі камери проводять відбір проб повітря за допомогою аспіратора будь-якої системи наприклад насос . Повітря просмоктують зі швидкістю 2-5 л/хв пропускають через прилад Дяконова або ін. у який наливають 5 мл стерильного розчину Хенкса з антибіотиками. Після чого цією рідиною заражають по 4 пробірки з моношаром клітинної культури. Кількість вірусів у пробах визначають титруванням. Після інфікування повітря в камеру диспергують розчини препаратів за допомогою різної розпилюючої апаратури. Дослідження проводять за трьома показниками відносної вологості повітря: 20-25% 50-55% і 80-85% і температурі повітря в межах від 19 до 22°С. Як контроль використовують аерозольні суміші що не містять активнодіючого препарату що розпорошують у камеру в тих же кількостях. При цьому розмір аерозольних часток повинний бути однаковим з розміром часток аерозолю препарату. Контрольні аерозольні суміші що не містять активнодіючої речовини не впливають на вірус незалежно від концентрації останнього в повітрі. 10. Знезаражування води У воду що досліджується вносять вірус у такій пропорції щоб його концентрація у воді становила 10 6ТЦД 50/ мл. Дезінфектант розводять дистильованою водою таким чином щоб після додавання його у досліджувану воду зберігалася необхідна концентрація дезінфектанту. Для цього робоче розведення дезінфектанту повинно бути у стільки разів вищим ніж дослідна концентрація у скільки разів об’єм досліджуваної води більший за об’єм робочого розведення дезінфектанту. Віруліцидну ефективність дезінфектанту при знезаражуванні води досліджують з білковим та без білкового навантаження в 3 групах: без білка з 0 2 % сироваткового альбуміну та 10 % сироватки великої рогатої худоби. Концентрації дезінфектанту та експозиції обирають так щоб результати дослідження показували віруліцидний ефект дезінфектанту в залежності від його концентрації та часу взаємодії. Якщо використовується нейтралізація дії дезінфектанту після завершення експозиції до суміші дезінфектанту та вірусовмісної рідини додають рівну кількість розчину нейтралізатора. Досліди по знезараженню води супроводжують наступними контролями: 1. Контроль вірусу. 2. Контроль вірусу з білковим навантаженням. 3. Контроль токсичності суміші дезінфектанту та нейтралізатора. 4. Контроль повноти нейтралізації дезінфектанту. Оцінити віруліцидну активність дезінфектанту особливо якщо нейтралізація його дії не проводиться можливо за допомогою титрування залишкового вірусу. Одразу після закінчення експозиції готують розведення досліджуваної води з дезінфектантом у кількості необхідній для титрування залишкового вірусу від 10 -1 до 10 -6 якими інфікують клітинний моношар. Визначити віруліцидний ефект дезінфекційного препарату за умови нейтралізації дезінфектанту можливо також за допомогою концентрування вірусних часток сірчанокислим алюмінієм. Осадження вірусних часток. У дослідну воду з розрахунку на 1 0 л додають 2 0 мл 10 % розчину сірчанокислого алюмінію Аl 2 SO 4 3 ретельно перемішують. Обробка осаду. Воду залишають при кімнатній температурі на 4 години або при +4 ±0 1? С на 18 годин для осідання пластівчастого осаду. Надосадову рідину видаляють. Осад центрифугують при 500 g протягом 10-15 хв. Елюція вірусних часток. Надосадову рідину видаляють осад ресуспендують у 3 0-5 0 мл розчину Хенкса рН 7 4. Повторна елюція вірусних часток. У день використання матеріалу для контамінації тканинної культури елюат центрифугують при 500 g протягом 15 хв. надосадову рідину видаляють осад ресуспендують у 4 0 мл розчину Хенкса. Перед інокуляцією клітинної культури ресуспендований осад очищують від бактеріальної флори за допомогою етилового ефіру який додається тонкою цівкою та антибіотиків. Усе ретельно змішують та залишають у пробірках з ватними пробками при температурі +4? С на ніч. Проби води які оброблені сірчанокислим алюмінієм зберігають при температурі +4 ±0 1?С. На кожний дослід використовують по 4 пробірки з моношаром клітинної культури. Протягом строку спостереження пробірки переглядають під мікроскопом. Якщо на клітинної культурі не настає типової цитопатичної дегенерації то проводять 2 пасажу. При відсутності специфічних змін на клітинної культурі вірус вважають інактивованим. КРИТЕРІЇ ОЦІНКИ Основним показником ефективності дезінфікуючих засобів в заданих концентраціях і тривалості експозиції при оціночних сертифікаційних дослідженнях є повна відсутність ознак розмноження вірусу за умов дотримання необхідного титру 7-8 lg ТЦД50/мл у вихідній контрольній суспензії вірусу. При дослідженні з вірусом гепатиту В ефективність оцінюють за втратою або зниженням вмісту антигенів або ДНК вірусу. У скринінгових дослідженнях пошук нових дезінфектантів мінімальною величиною зниження інфекційності вірусу за час експозиції яка свідчить про наявність віруліцидної дії вважають 2 lg ТЦД50/мл. Загальну віруліцидну ефективність розраховували як різницю між титром вірусу в присутності дезінфектанту і його титром в присутності розчинника: Е=ТК-ТД де Е – загальна віруліцидна ефективність; ТК – титр вірусу в контролі; ТД – титр вірусу в суміші вірус/дезінфектант. Директор Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду А.М.Пономаренко ПЕРЕЛІК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ 1. Методические рекомендации по определению вирулицидной активности препаратов - Москва. 1974. – 17 с. 2. Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды – Москва 1982.- 75 с. 3. Исследование вирулицидных свойств дезинфицирующих и антисептических препаратов. Методические рекомендации – Минск 1996. – 50 с. 4. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита – ВОЗ Женева 1998.- 113 с. 5. Ворошилова М.К. Жевандрова В.И. Балаян М.С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. - Москва “Медицина” 1964. – 150 с. НАКАЗ N 333 26.05.2006 м.Київ Про затвердження тимчасових методичних рекомендацій "Визначення віруліцидної активності дезінфекційних препаратів" У відповідності до вимог статей 9 та 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" та з метою науково-методичного забезпечення діяльності державної санітарно-епідеміологічної служби з питань застосування дезінфікуючих засобів зокрема в осередках вірусних інфекцій для їх профілактики НАКАЗУЮ: 1. Затвердити тимчасові методичні рекомендації "Визначення віруліцидної активності дезінфекційних препаратів" додаються . 2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України тимчасові методичні рекомендації "Визначення віруліцидної активності дезінфекційних препаратів" довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби України міністерств інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку. 3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Пономаренка А. М. Перший заступник Міністра головний державний санітарний лікар України С.П.Бережнов 1