МВ 10.10.2.2-132-2006

МВ 10.10.2.2-132-2006 Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria Monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині

ЗАТВЕРДЖЕНО Наказ МОЗ України 11.08.2006 № 559 МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ „ОРГАНІЗАЦІЯ КОНТРОЛЮ І МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ БАКТЕРІЙ LISTERIA MONOCYTOGENES У ХАРЧОВИХ ПРОДУКТАХ ТА ПРОДОВОЛЬЧІЙ СИРОВИНІ” 1. Загальні положення 1.1. Методичні вказівки „Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині" далі - методичні вказівки розроблені на підставі законів України “Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення України” “Про захист населення від інфекційних хвороб” та постанови Кабінету Міністрів України від 22.06.99 № 1109 “Про затвердження Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні”. 1.2. До переліку патогенних мікроорганізмів при контролі харчових продуктів та продовольчої сировини за показниками біологічної безпеки введений новий мікробіологічний показник “Listeria monocytogenes - не допускаються у 25 г продуктів масового призначення й у 50-100 г для продуктів дитячого і спеціалізованого харчування". 1.3. Методичні вказівки встановлюють основні принципи організації контролю і методику проведення лабораторних досліджень харчових продуктів і продовольчої сировини далі – Продукції з метою встановлення в певному об'ємі масі наявності або відсутності бактерій Listeria monocytogenes. 1.4. Методичні вказівки призначені для застосування в установах державної санітарно-епідеміологічної служби України при здійсненні контролю та нагляду за якістю та безпекою харчових продуктів і продовольчої сировини в тому числі тих що надходять за імпортом; проведенні робіт для потреб державної санітарно-епідеміологічної експертизи; бактеріологічній діагностиці захворювань з харчовим шляхом передачі та інших видів робіт що передбачені чинним законодавством а також для лабораторій акредитованих у встановленому порядку на право проведення контролю за якістю та безпекою харчових продуктів і продовольчої сировини. 1.5. Методичні вказівки застосовуються при дослідженні харчових продуктів і продовольчої сировини у ході проведення протиепідемічних заходів при виникненні спалахів харчових отруєнь та гострих кишкових інфекцій а також при здійсненні державного санітарно-епідеміологічного нагляду. 2. Коротка характеристика мікроорганізмів роду Listeria До збудників лістеріозу належать два із шести відомих на сьогодні видів бактерій роду Listeria - L.monocytogenes патогенна для людини і тварин і L.ivanovii патогенна для тварин рідко - для людини . Дев’яте видання «Визначник бактерій Берджі» відносить рід Listeria до 19 групи мікроорганізмів - грампозитивні неспороутворюючі палички правильної форми. Представники цього роду - короткі палички правильної форми розміром 0 4-0 5х0 5-2 мкм із закругленими кінцями іноді майже коки одиничні або в коротких ланцюжках рідше в довгих нитках. Грампозитивні спор і капсул не утворюють не кислотостійкі. Мікроорганізми роду Listeria вирощені при 35-370С рухливі за рахунок перитрихіальних джгутиків при 20-250С ця здатність втрачається. Факультативні анаероби. Хемоорганотрофи метаболізм бродильного типу; зброджують глюкозу з утворенням в основному L + -лактату. Каталазопозитивні оксидазонегативні. Утворюють цитохроми. Можуть перетворюватися в L-форми і паразитувати внутрішньоклітинно що обумовлює недостатню ефективність у ряді випадків антибактеріальної терапії пояснює схильність до затяжного і хронічного перебігу можливість латентної форми і бактеріоносійства. Лістерії дуже стійкі в довкіллі ростуть у широкому інтервалі температур від 3 до 420С рН від < 5 5 до 9 5 добре переносять низькі температури і здатні розмножуватися при температурі 4-6 0С в ґрунті воді на рослинах в органах трупів. У різних харчових продуктах молоко м'ясо тощо розмножуються при температурі побутового холодильника. У ґрунті гної воді на рослинах вони залишаються життєздатними до 600 діб на забруднених поверхнях приміщень сільськогосподарського призначення в літній період 9...220С лістерії зберігають життєздатність до 25 діб а в зимовий період - 2 - 230С до 130 діб. У льоду вони здатні зберігатися від 5 5 міс. до 2 5 років. При температурі 700С гинуть через 20-30 хвилин при 1000С - через 3 -5 хвилин; інактивуються розчинами формаліну 0 5%-1% фенолу 5% хлорного вапна 100 мг активного хлору в 1дм3 . 3. Організація контролю продукції на Listeria monocytogenes 3.1 Лабораторний контроль за відсутністю Listeria monocytogenes у продукції де нормується цей показник проводиться: • в порядку державного санітарно-епідеміологічного нагляду за якістю та безпекою продукції при її виробництві зберігання транспортуванні та реалізації а також наданні послуг у сфері торгівлі і громадського харчування; • при здійсненні державної санітарно-епідеміологічної експертизи з метою надання відповідних висновків свідоцтв дозволів та інших документів що передбачені чинним законодавством; • при здійсненні виробничого контролю за якістю та безпекою продукції; • при проведенні протиепідемічних заходів а також епідеміологічному розслідуванні захворювань. 3.2. Періодичний відбір зразків харчової продукції для дослідження її за показниками біологічної безпеки в тому числі і на наявність Listeria monocytogenes здійснюється відповідно до Положення про державну санітарно-епідеміологічну службу України затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 19 серпня 2002 р. N 1218. 3.3. Порядок контролю і кратність досліджень встановлюються відповідно до нормативних документів затверджених або погоджених у встановленому порядку Міністерством охорони здоров’я України при цьому враховується специфіка виробництва ступінь його епідемічного ризику матеріально-технічне оснащення тощо. Особливу увагу приділяють підприємствам що виробляють продукти дитячого харчування дитячим молочним кухням харчоблокам дитячих лікувально-профілактичних закладів стаціонарів для онкологічних гематологічних хворих будинків дитини пологових будинків будинків-інтернатів пансіонатів для громадян похилого віку інвалідів та дітей тощо. 3.3.1. При проведенні державного санітарно-епідеміологічного нагляду мінімальна рекомендована періодичність вибіркового лабораторного контролю продукції - 1 раз у квартал; для дитячого і дієтичного харчування - 2 рази. 3.3.2. При здійсненні виробничого контролю організація і періодичність лабораторних досліджень продукції за показником Listeria monocytogenes встановлюються виробником і при необхідності узгоджуються з територіальними установами державної санітарно-епідеміологічної служби. При складанні графіка виробничого контролю продукції за показником Listeria monocytogenes рекомендовано визначати періодичність за п.3.3.1. 3.4. Дослідження продукції за показником Listeria monocytogenes здійснюються лабораторіями державної санітарно-епідеміологічної служби або іншими лабораторіями що мають дозвіл на роботу оформлений згідно з вимогами державних санітарних правил ДСП №9.9.5.064.2000 “Порядок видачі дозволів на роботу із мікроорганізмами I-IV груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК” та атестовані/акредитовані МОЗ України у встановленому порядку. 3.5. Дослідженню за показником „відсутність Listeria monocytogenes в 25 г продукції у 50-100 г для продуктів дитячого і спеціалізованого харчування ” підлягають - харчові не консервовані продукти: м’ясо та птиця м’ясопродукти та птахопродукти молоко та молочні продукти сири риба рибопродукти нерибні об’єкти промислу та продукція з них жирові продукти тваринного походження за винятком жирів топлених холодні готові страви що виробляються на об’єктах громадського харчування торгівлі в кулінарних цехах тощо салати супи інші продукти та страви з сирих овочів . 3.6. У харчових продуктах призначених для безпосереднього вживання в їжу для яких відсутні мікробіологічні нормативи або дані про можливість виділення Listeria monocytogenes контроль Listeria monocytogenes не проводиться однак у випадку захворювань людей і/або порушень щодо забезпечення якості і безпеки харчових продуктів зразки таких продуктів повинні бути направлені на лабораторне дослідження. 4. Організація лабораторних досліджень на Listeria monocytogenes Допускається організація лабораторних досліджень шляхом їх поетапного виконання в лабораторіях установ державної санітарно-епідеміологічної служби різних рівнів. При відсутності можливості ідентифікації виділених культур на місці їх передають у лабораторії вищого рівня державної санітарно-епідеміологічної служби що мають відповідну матеріально-технічну базу і кваліфікований персонал для видачі остаточного результату. При передачі культур додержуються вимог “Положения о порядке учета хранения обращения отпуска и пересылки культур бактерий вирусов риккетсий грибов простейших микоплазм бактерийных токсинов ядов биологического происхождения” затвердженого Головним державним санітарним лікарем СРСР 18.05.79. 5. Сутність методу Метод виявлення L.monocytogenes гармонізований з Міжнародним стандартом ISO 11290-1:1996 передбачає визначення наявності або відсутності L. monocytogenes у нормованій масі продукту відповідно до затверджених нормативів виражених в альтернативній формі і заснованими на існуючій системі відбору зразків і оцінки результатів аналізу. Метод виявлення бактерій Listeria monocytogenes складається з наступних етапів: посів певної кількості продукту в рідкі селективні середовища інкубація посівів виявлення в них бактерій здатних рости й утворювати типові колонії на щільних диференційно-діагностичних середовищах. Належність виділених культур до Listeria monocytogenes визначається за біохімічними морфологічними та іншими властивостями. Допускається виявлення бактерій Listeria monocytogenes за допомогою автоматичного імуноаналізатора типу «miniVIDAS» у якості експрес-методу. При проведенні досліджень харчових продуктів на наявність/відсутність L.monocytogenes застосовуються спеціальні селективні і диференційно-діагностичні середовища. Селективність середовищ стосовно супутньої мікрофлори забезпечується включенням до їх складу хлориду літію акрифлавіну циклогексаміду налідиксової кислоти поліміксину або інших антибіотиків. Внесення ескуліну і цитрату амонію заліза дозволяє підтверджувати наявність лістерій за почорнінням середовища за рахунок гідролізу ескуліну в присутності іонів Fe+. Підтверджуючі тести родової і видової належності включають фарбування за Грамом визначення рухливості виділених на щільних середовищах типових за фізіологічними та морфологічними ознаками культур їх здатності відновлювати нітрати до нітритів зброджувати рамнозу ксилозу і маніт гідролізувати лецитин на середовищі з яєчним жовтком а також визначення наявності ?-гемолізу на кров'яному агарі і диференціацію L.monocytogenes від інших гемолізуючих лістерій у САМР-тесті. 6. Апаратура матеріали лабораторний посуд реактиви поживні середовища 6.1. Апаратура та інструментарій Баня водяна з підігрівом в якій підтримується температура 47±2 0 С Бактеріологічні петлі платиново-іридієві нікелево-хромові або петлі одноразового користування діаметром 3 мм Ваги лабораторні загального призначення 2 і 4 класів точності з найбільшою межею зважування 200 г Газова або електрична плитка Годинник механічний сигнальний таймер Гомогенізатор перистальтичного типу “Стомахер” або інших найменувань Імуноаналізатор автоматичний типу «miniVIDAS» Мікроскоп біологічний з фазовим контрастом Опромінювач бактерицидний ОБН-150 або інших видів Пальники газові або спиртівки лабораторні Пінцет медичний рН-метр іономір з поділками шкали до 0 01 рН за температури 250 С погрішність вимірів ±0 1 од. рН Калориметр типу "Денси-ла-метр” Система для отримання очищеної води аналітичної якості або дистилятор що забезпечує якість дистильованої води відповідно до ГОСТ 6709-72 Скальпель хірургічний 15 см Стерилізатори парові медичні з максимальним робочим тиском 0 2МПа Термостати що дозволяють підтримувати робочу температуру в межах 25±1 0С 30±1 та 37±1 0С Холодильник лабораторний або побутовий електричний  Шафа сушильна стерилізаційна що дозволяє підтримувати температуру 160±5 0С  Штативи для пробірок Шпателі металеві або пластикові 6.2. Лабораторний посуд та матеріали Вата медична гігроскопічна Каструлі емальовані Колби плоскодонні конічні чи круглі різної місткості Ковпачки силіконові або металеві Лійки скляні Марля медична Маркери по склу Папір фільтрувальний лабораторний Піпетки місткістю 1 2 5 і 10 см3 Полістиролові планшети U-подібні Пробірки Уленгута поплавці Пробірки Пробки силіконові гумові або ін. що витримують стерилізацію Скельця предметні та покривні для мікропрепаратів Термометр ртутний з діапазоном виміру від 0 до 1000С ціна поділки шкали 10С Циліндри місткістю 100 250 500 см3 або мензурки місткістю 250 500 1000см3 Чашки Петрі скляні або пластикові 6.3. Реактиви та поживні середовища 6.3.1. Реактиви компоненти середовищ нормативний документ фірма-виробник Агар мікробіологічний Акрифлавіну гідрохлорид трипафлавін HiMedia Вода очищена або дистильована ГОСТ 6709-72 Вугілля активоване D-глюкоза ч D-лактоза 1-водна Ескулін Екстракт дріжджовий сухий Жовток курячого яйця Заліза амонійного цитрат Ксилоза Калію гідроксид ГОСТ 24363-80 Калій фосфорнокислий однозаміщенний ч. ГОСТ 4198-75 Калій фосфорнокислий двозаміщенний 3-х водний ГОСТ 2493-75 Кислота соляна х. ч ГОСТ 3118-77 Крохмаль Кислота налідиксова HiMedia Литій хлористий ч. або х. ч. або ч. д. а. ГОСТ 4328-77 Маніт Масло імерсійне для мікроскопії ГОСТ 31739-78 Набір реактивів за Грамом Натрій амоній фосфорнокислий двозаміщенний 4х водний ч або хч ГОСТ 4170-78 Натрію гідроксид чда ГОСТ 4328-77 Натрій лимоннокислий 5 5-водний чда ГОСТ 22280-75 Натрій хлористий ч хч або чда ГОСТ 4233-77 Оцтова кислота ГОСТ 61-75 Парадіметіламінобензоальдегід ТУ 6-09-3272-77 Пептон сухий ферментативний для бактеріологічних цілей Поліміксин “М” або “В” сульфат по 500 000 од. медичний препарат Рамноза Спирт етиловий ректифікований ГОСТ 5962-67 Сульфанілова кислота Феноловий червоний ГОСТ 5853-51 Фенолфталеїн ГОСТ 5850-72 Фуксин основний ТУ6-09-4119-75 Хлороформ технічний ГОСТ2-15-76-72 ?-нафтол Цинк порошкоподібний ГОСТ 3640 Цефазидим Циклогексамід Тест-штами Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua Staphylococcus aureus Rhodococcus equi типові за культуральними морфологічними та біохімічними властивостями 6.3.2. Поживні середовища 6.3.2.1. Для культивування ізолятів Поживний агар - Nutrient Agar - M001* Поживний бульйон - Nutrient Broth - M002* Дріжджовий триптон-соєвий бульйон - Tryptone Soya Yeast Extract Broth TSYEB M1263* Дріжджовий триптон-соєвий агар - Tryptone Soya Yeast Extract Agar TS YEA M1214* 6.3.2.2. Середовища селективного збагачення Бульйон Фрейзера: основа - Fraser Broth Base ростова добавка - Fraser Supplement селективна добавка - Fraser Selective Supplement M1327* FD 141* FD125I* Бульйон збагачення для лістерій - Listeria Enrichment Broth M569* Середовище збагачення для лістерій Середовище UVM - Listeria Enrichment Medium UVM Medium M890* Бульйон збагачення для лістерій модифікований - Listeria Enrichment Broth Modified M888* Бульйон вторинного збагачення для лістерій - Fraser Secondary Enrichment Broth Base Збагачувальна добавка Фрезера – Fraser Enrichment Supplement M1083* FD065* Селективний бульйон для лістерій: основа - Listeria Selective Broth Base селективна добавка - Listeria Selective Supplement M889* FD163I* 6.3.2.3. Диференційно-діагностичні селективні середовища Агар для ідентифікації лістерій ПАЛКАМ : * Основа - Listeria Identification Agar PALCAM * Селективна добавка ПАЛКАМ - Listeria Selective Supplement PALCAM М1064* FD061* Оксфордське середовище для лістерій: * Основа - Listeria Oxford Medium Base * Селективна добавка Оксфордська - Oxford Listeria Supplement M1145* FD172* Селективний агар для лістерій - Listeria Selective Agar M567* Агар Мак-Брайда для лістерій: * Основа - McBride Listeria Agar Base * Добавка Мак-Брайда - McBride Listeria Supplement M386* FD171* Агар Мак-Брайда для лістерій модифікований: * Основа - Modified McBride Listeria Agar Base * Добавка Мак-Брайда - McBride Listeria Supplement M891* FD171* Селективний агар LPM для лістерій: * Основа - LPM Agar Base * Селективна добавка - Moxalactum Supplement M1228* FD151* 6.3.2.4. Диференційні середовища Нітратний агар - Nitrate Agar M072* Нітратний бульйон - Nitrate Broth M439* Набір для визначення сахаролітичної активності лістерій * Бульйон для визначення сахаролітичної активності аналог середовищ Гіса - Carbohydrate Consumption Broth * Диски з вуглеводами у флаконах: Mannitol Маніт Rhamnose Рамноза Xylose Ксилоза Mannose Маноза M1264* DD006* DD010* DD014* DD007* Основа бульйону з бромкрезоловим пурпурним для лістерій - Purple Broth Base M284D* Blood Agar Base - основа кров'яного агару M073* Основа колумбійського кров’яного агару - Columbia Blood Agar Base M144* Тест-системи біохімічні для видової ідентифікації API Listeria BioMerieux *Каталожний номер продукції фірми HiMedia. Допускається використання інших комерційних поживних середовищ ПС та діагностичних препаратів аналогічного призначення для проведення досліджень відповідно до цього документа зареєстрованих та дозволених до застосування в Україні. При їх застосуванні варто керуватися рекомендаціями виробника. 7. Підготовка до дослідження 7.1. Приготування розчинів та реактивів 7.1.1. Пептонно-сольовий розчин За ГОСТ 26669 7.1.2. Ізотонічний 0 85% водний розчин хлориду натрію За ГОСТ 26669 7.1.3. Розчини і реактиви для постановки реакції нітратредукції За ГОСТ 10444.8-99 7.1.4. Розчини і реактиви для фарбування препаратів за Грамом За ГОСТ 10444.1 або відповідно до інструкції щодо застосування 7.1.5.Розчин перекису водню 3 % для визначення каталази За ГОСТ 30425 7.2. Приготування поживних середовищ Загальні вимоги до виготовлення ПС викладені в ГОСТ 10444.1 - 84. З метою підвищення достовірності та якості досліджень перевагу слід віддавати ПС та діагностичним препаратам промислового виробництва зареєстрованих та рекомендованих до використання в Україні. ПС промислового виготовлення названі в п. 6.3.2 готують відповідно до прописів на етикетці або відповідно до рекомендацій фірми виробника. Допускається застосування ПС приготовлених безпосередньо в лабораторії з окремих компонентів за п.п. 7.2.1 - 7.2.10. Готові середовища розливають у стерильний посуд і зберігають у захищених від світла умовах при температурі 2-8 0С. 7.2.1. Поживний агар МПА з 1 % глюкози і поживний бульйон МПБ з 1 % глюкози готують відповідно до ГОСТ 10444.1. 7.2.2. Триптон-соєвий бульйон із дріжджовим екстрактом TSYEB / Триптон-соєвий агар із дріжджовим екстрактом TS YEA . Склад г/дм3 : гідролізат казеїну - 17 0; папаїновий перевар соєвого борошна -3 0; натрій хлористий - 5 0; калію гідрофосфат - 2 5; глюкоза - 2 5; дріжджовий екстракт - 6 0; агар-агар для TSYEA - 15 0. Компоненти розчиняють у 1 дм3 дистильованої води ретельно перемішують установлюють рН 7 3±0 2 і автоклавують при 121±1 0С протягом 15 хвилин. 7.2.3. Середовища селективного збагачення типу бульйону Фрейзера. Приготування основи середовища г/дм3 : ферментативний гідролізат казеїну - 5 0; пептон - 5 0; м'ясний екстракт - 5 0; дріжджовий екстракт - 5 0; натрію хлорид - 20 0; калію дигідрофосфат -1 35; натрію гідрофосфат - 12 0; ескулін - 1 0; літій хлористий -3 0 заліза амонійного цитрат -0 25 розчиняють у 1 дм3 дистильованої води ретельно перемішують встановлюють рН 7 2±0 2 і автоклавують при 121±1 0 С 15 хвилин. Перед застосуванням до основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу: Середовище типу бульйону Фрейзера первинного збагачення* вторинного збагачення налідиксова кислота - 10 мг - 20 мг акрифлавіну гідрохлорид - 12 5 мг - 25 мг *Допускається при приготуванні середовища типу бульйону Фрезера первинного збагачення готувати основу середовища без додавання ескуліну та цитрату заліза амонійного. Спосіб приготування: зазначені компоненти розчинити в 10 см3 стерильного 0 2 N гідроксиду натрію. 7.2.4. PALCAM-агар поліміксин-акрифлавін-літію хлорид-цефтазидім-ескулін-манітол - агар - селективне диференційно-діагностичне середовище для виділення лістерій. Приготування основи середовища г/дм3 : пептон м'ясний ферментативний - 23 0; дріжджовий екстракт - 3 0; крохмаль - 1 0; натрію хлорид - 5 0; ескулін - 0 8; літію хлорид - 15 0; заліза амонію цитрат - 0 5; глюкоза - 0 5; маніт - 10 0; феноловий червоний - 0 08; агар -15 0 розчиняють у 1 дм3 дистильованої води ретельно перемішують установлюють рН 7 0±0 2 і автоклавують при 121±1 0С 15 хв. До стерильної розплавленої основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу: акрифлавін - 0 005; поліміксин “В” - 100 000 од.; цефтазидім - 0 02 у 10 см3 стерильної дистильованої води. Готове середовище розливають у стерильні чашки Петрі. 7.2.5. Селективне диференційно-діагностичне середовище для виділення лістерій типу Оксфордського агару. Приготування основи середовища г/дм3 : пептон м'ясний ферментативний - 23 0; крохмаль кукурудзяний - 1 0; натрію хлорид - 15 0; ескулін - 1 0; літію хлорид - 15 0; заліза амонію цитрат - 0 5; глюкоза - 0 5; агар - 15 0 розчиняють у 1 дм3 дистильованої води ретельно перемішують установлюють рН 7 0±0 2 і автоклавують при 121±1 0С 15 хвилин. До стерильної розплавленої основи середовища додають асептично розчин селективних компонентів наступного складу: акрифлавіну гідрохлорид - 0 005; циклогексамід - 0 4 колістину сульфат* - 0 02 цефатетан* - 0 002 фосфоміцин* - 0 01 мг у 10 см3 50 % етанолу. Готове середовище розливають у стерильні чашки Петрі. *Допускається заміна комплексу перелічених антибіотиків на поліміксин у кількості 500 000 од. на 1 дм3. 4.2.6. Кров'яний агар. До розтопленого й охолодженого до 45-500С поживного агару з 1 % глюкози п. 7.2.1 додають 5 % об’єму дефібринованої крові тварин. Розливають по 15 см3 у чашки Петрі діаметром 90 мм і підсушують при 37±1 0С. Посів роблять у теплі чашки. 7.2.7. Поживний агар з еритроцитами барана. Дефібриновану або стабілізовану цитратом кров барана центрифугують в асептичних умовах 30 хв. при 900 об/хв. Надосадову рідину зливають. Осад суспендують у стерильному фізіологічному розчині до первісного об’єму додають у кількості 5 % об’єму до розтопленого й охолодженого до 45-50 °С поживного агару п. 7.2.1 . Розливають у чашки Петрі діаметром 90 мм по 15 см3 підсушують при 37±1 0С. Чашки використовують для посіву теплими. 7.2.8. Середовище для визначення рухливості: 20 г гідролізату казеїну ферментативного 6 г пептону м'ясного ферментативного і 5 г агару розчиняють у 1 дм3 дистильованої води установлюють рН 7 3±0 2 розливають у пробірки по 5-7 см3 і автоклавують при 121±1 0С 15 хвилин. 7.2.9. Середовища Гіса за ГОСТ 10444.1 з манітом рамнозою ксилозою. 10 г пептону ферментативного і 5 г натрію хлористого розчиняють у 1 дм3 дистильованої води і додають 10 г відповідного вуглеводу. Встановлюють рН 7 1±0 1 вносять 10 см3 індикатора Андреде можливе використання індикатора бромкрезолового пурпурного “ВР” і ін. розливають у пробірки і стерилізують при 112±1 0С 20 хвилин. 7.2.10. Середовище для визначення лецитиназної активності лістерій. До поживного агару п. 7.2.1 перед стерилізацією додають активоване вугілля розтерте до порошкоподібного стану до концентрації 0 5% вага/об’єм . Жовток курячого яйця змішують з 150 см3 фізіологічного розчину і додають 5 % цієї суміші за об’ємом до стерилізованого й охолодженого до 40-500С поживного агару. Розливають у чашки Петрі по 20 см3 і підсушують при 37±1 0С. Аналогічно готують середовище з жовтком але без активованого вугілля. 8. Відбір і підготовка проб харчових продуктів для дослідження 8.1. Загальні положення по відбору і підготовці проб Відбір і підготовку проб продукції здійснюють відповідно до ГОСТ 26668-85 “Методы отбора проб для микробиологических анализов” ГОСТ 26669-85 “Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов” СаНПиН "Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского лечебного и диетического питания и их компонентов" затверджені заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 21.12.1988р №42-123-4940-88 СанПиН "Нормативы и методы микробиологического контроля продуктов детского питания изготовленных на молочных кухнях системы здравоохранения" затверджені заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 31.08.1987г №42-123-4423-87 а також відповідно до діючих ГОСТ і НД на конкретні види продуктів. Маса та об’єм проб що відбираються повинні бути достатніми для проведення дослідження і мінімум вдвічі перевищувати аналітичний зразок. З об'єднаної проби беруть наважку масою 25±0 1 г 50-100 г - для продуктів дитячого лікувального і спеціалізованого харчування . Від продукції в споживчій тарі в дрібній фасовці проби відбирають у кількості однієї або декількох одиниць в залежності від маси або об’єму споживчої тари. Кількість їх повинна бути достатньою для проведення дослідження. Від продукції в транспортній або споживчій тарі великих розмірів або не упакованій проби відбирають з різних місць з різної глибини включаючи поверхню. Для бактеріологічного дослідження проби відбирають до узяття проб на фізико-хімічні й органолептичні дослідження стерильним інструментом у стерильний посуд. При цьому від зразка відбирають кілька проб з різних місць подрібнюють перемішують і з них складають наважку необхідної маси. Заморожені продукти попередньо розморожують до температури усередині продукту 0- -1 0С; продукти що містять жири вершкове масло морозиво тощо нагрівають до температури 40-45 0С і перемішують. Відібрані зразки перемішують і подрібнюють або доводять до однорідної консистенції за ГОСТ 26669 із подрібненої суспензії складають наважку необхідної маси. При посівах висококислотних чи лужних із рН < 6 чи >7 5 рідких і твердих продуктів для запобігання зниження рН поживних середовищ рН продукту перед посівом доводять до 7 0 ± 0 2 . 8.2. Відбір і підготовка проб молока молочних продуктів сирів морозива Відбір і підготовку проб продуктів проводять відповідно ГОСТ 9225 84 “Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа”. Кисломолочні продукти сир сирні вироби і пастоподібні продукти ретельно подрібнюють за допомогою гомогенізаторів і піддають нейтралізації масло вершкове і морозиво розтоплюють до сметаноподібної консистенції. 8.3. Відбір і підготовка проб м'яса м'ясних напівфабрикатів м'яса птахів і птахопродуктів ковбасних виробів і інших м'ясопродуктів Відбір і підготовку проб м'яса субпродуктів м'ясних напівфабрикатів ковбасних виробів і інших м'ясних продуктів проводять за ГОСТ 21237 “Мясо. Методы бактериологического анализа” ГОСТ 26668-85 „Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований” ГОСТ 26669-85 „Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов". Масу наважки відбирають відповідно до п. 9.1. 8.4. Відбір і підготовка проб плодоовочевої продукції Відбір і підготовку до дослідження проб плодоовочевої продукції крім проб поверхнево контамінованих і пюреподібних продуктів проводять відповідно до ГОСТ 26668 ГОСТ 26669 ГОСТ 26313 “Продукты переработки плодов і овощей. Правила приемки методи отбора проб”. Для дослідження поверхнево контамінованої продукції та швидкозамороженої продукції готують суспензію додаванням до наважки масою 100 ± 30 г відібраної з трьох одиниць тари або фасовки 0 1%-ного пептонно-сольового розчину в кількості рівній масі наважки. При цьому 1 см3 отриманої суспензії оцінюють як 1 г см3 продукту. Із подрібнених плодів овочів напівфабрикатів пюреподібних і рідких продуктів відбирають окремо наважку масою по 100 ± 30 г із трьох одиниць тари або фасовки і готують об'єднану пробу масою відповідно до п. 9.1. 8.5. Відбір і підготовка проб риби нерибних об'єктів промислу і продуктів що з них вироблені Відбір і підготовку проб проводять згідно з “Инструкцией по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских безпозвоночных» затверджена заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 22.02.91 №5319-91. Відбір проб свіжої охолодженої і мороженої риби проводять від 2 зразків м'язова тканина в яких складає не менш 100 г за ГОСТ 7631-85. З кожної проби стерильним інструментом вирізують спинні м'язи зі шкірою перемішують і відважують 25 г подрібнюють за допомогою гомогенізатору і гомогенізують у 225 см3 середовища збагачення. 8.6. Відбір і підготовка проб продуктів дитячого лікувального харчування і їх компонентів Відбір і підготовку проб продуктів дитячого лікувального харчування і їх компонентів проводять згідно СаНПиН «Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского лечебного и диетического питания и их компонентов» затверджені заступником Головного державного санітарного лікаря СРСР 21.12.1988 р. №42-123-4940-88. Відібрані проби продуктів перед дослідженням ретельно перемішують кисломолочні продукти нейтралізують на 10 см3/г досліджуваного продукту або його першого розведення для сухих кисломолочних продуктів напою або закваски додають 1 0 см3 стерильного розчину двовуглекислого натрію з масовою концентрацією 100 г/см3 . Сир сирні вироби і пастоподібні продукти ретельно подрібнюють і нейтралізують. Вершкове масло або молочний жир розплавляють при температурі 40-45 0С і перемішують до одержання однорідної емульсії. 9. Порядок проведення дослідження 9.1. Підготовлену відповідно до п 8. наважку досліджуваного продукту гомогенату змиву з поверхні у кількості 25 г см3 вносять в одне із середовищ для первинного збагачення в кількості 225 см3 за п.п. 6.3.2.2 7.2.3. . При необхідності дослідження інших мас продукту їх посів проводять у середовище також у співвідношенні 1:9 за об’ємом. Посіви інкубують при 37±1 0С протягом 24±2 годин. При використанні комерційних поживних середовищ термін та температура інкубації згідно інструкції до застосування . При рості лістерій на середовищах попереднього збагачення які містять ескулін і цитрат заліза амонійного спостерігається почорніння середовища за рахунок гідролізу глікозиду ескуліну до глюкози і ескулетину. Ескулетин реагує з іонами заліза утворює комплекс чорного або маслинового кольору. На інших середовищах почорніння не відзначається. 9.2. Після термостатування продукту в середовищі для первинного збагачення 0 1 см3 суспензії пересівають у 10 см3 одного з рідких середовищ для вторинного збагачення за п.п. 6.3.2.2 7.2.3. Посіви інкубують в термостаті при температурі 37±1 0С протягом 48±2 год. При використанні комерційних поживних середовищ термін та температура інкубації згідно інструкції до застосування. У середовищах з ескуліном відзначають почорніння як ознаку можливої присутності бактерій роду Listeria. 9.3. Із пробірок після термостатування незалежно від наявності або відсутності ознак росту і в т.ч. почорніння роблять пересіви по 0 1 см3 на поверхню двох чашок Петрі з однієї з агаризованих диференційно-діагностичних середовищ за п.п. 6.3.2.3 7.2.4 7.2.5. Посівний матеріал розтирають стерильним шпателем. Допускається проводити пересівання петлею штрихом. Чашки із середовищами попередньо підсушують. Посіви інкубують при температурі 37±1 0С протягом 24-48годин. При використанні комерційних поживних середовищ термін та температура інкубації згідно інструкції до застосування. Чашки з PALCAM-агаром краще інкубувати мікроаеробних умовах. 9.4. Проведення дослідження без етапу вторинного збагачення. При посіві продуктів з низьким вихідним рівнем мікробної контамінації і при відсутності ознак росту в рідкому середовищі помутніння почорніння й ін. допускається проводити пересів на чашки з агаризованими диференційно-діагностичними середовищами відразу після етапу первинного збагачення за п. 9.1. 9.5. При відсутності росту на чашках з диференційно-діагностичними середовищами типу Оксфордського агару Oxford agar і PALCAM-агару дослідження припиняють і дають висновок про відсутність L. monocytogenes у дослідженій пробі продукту. 9.6. При виявленні характерного росту на чашках відбирають 3-5 колоній для їх подальшого вивчення. На середовищах типу PALCAM-агару через 24 год. інкубації лістерії формують дрібні сірувато-зелені або маслиново-зелені колонії з чорним ореолом діаметром 0 5-1 0 мм іноді з чорним центром. Чашки що інкубувалися в мікроаеробних умовах необхідно витримати на повітрі протягом 1 години для відновлення кольору середовища . Через 48 год. колонії діаметром 1 0-2 0 мм набувають зеленого забарвлення з заглибленими центрами оточеними чорним ореолом. Кокова мікрофлора бактерії родів Staphylococcus Enterococcus утворює кольорові колонії від жовтого до червоного за рахунок ферментації маніту. На Оксфордському агарі лістерії вирощені протягом 24 год. дрібні 1 мм сіруваті оточені чорним ореолом. Через 48 год. - більш темні можливо зеленуватий відтінок близько 2 мм у діаметрі з чорним ореолом і заглибленим центром. При появі суцільного росту лістерій роблять пересів бактеріологічною петлею з зон найбільшого почорніння середовища штрихами на 2-3 чашки Петрі із селективним диференційно-діагностичним ПС Оксфордський або PALKAM-агар для одержання ізольованих колоній. Посіви термостатують аналогічно п.9.3. 9.7. Відібрані характерні колонії не менше 5 а у випадку якщо на чашці виросло менше 5 колоній то всі підозрілі на приналежність до Listeria monocytogenes пересівають на середовища: МПА з 1 % глюкози п. 7.2.1 триптон-соєвий агар із дріжджовим екстрактом TSYEA за п. 6.3.2.1 або 7.2.2 для одержання ізольованих колоній які піддають подальшому вивченню. Посіви інкубують в термостаті при температурі 300С протягом 24 годин. 9.8. Ідентифікація виділених культур. Для визначення належності виділених мікроорганізмів до роду Listeria отримані чисті культури фарбують за Грамом мікроскопують визначають наявність у них каталази рухливості при двох температурах інкубації – 250С і 370С здатності до ферментації маніту і ставлять реакцію редукції нітратів. 9.8.1. Фарбування за Грамом. Бактерії роду Listeria є грампозитивними тонкими короткими паличками спор не утворюють. 9.8.2. Каталазну активність культур визначають відповідно до ГОСТ 30425 за здатністю каталази розкладати перекис водню з виділенням пухирців газу. Реакцію ставлять з охолодженою до кімнатної температури добовою культурою на стерильному предметному склі. Ізольовану колонію узяту з поверхні ПС скляною паличкою або платиновою петлею розтирають на склі і піпеткою наносять краплю 3 % розчину перекису водню. При позитивній реакції через 30-60 сек. на склі з'являються пухирці газу. Паралельно ставлять контрольну пробу. Бактерії роду Listeria є каталазопозитивними. 9.8.3. Рухливість культур визначають посівом уколом у середовища за п. 7.2.8 і інкубації при двох температурах – 25±1 0С і 37±1 0С протягом 48-72 год. Бактерії роду Listeria рухливі при 250С утворюють характерний схожий на парасольку ріст навколо лінії уколу і нерухомі або слабко рухомі при 35-37 0С. 9.8.4. Для визначення здатності зброджувати вуглеводи культури пересівають на середовища Гіса за п.п. 6.3.2.3 або 7.2.9. Посіви інкубують 7 діб при 37±1 0С наявність ферментативної активності у відношенні вуглеводів виявляють за зміною кольору середовищ за рахунок утворення кислоти. Більшість бактерій роду Listeria не утилізують маніт за винятком L. grayi та L. grayi subsp. murrayi . 9.8.5. Постановку реакції нітратредукції проводять за ГОСТ 10444.8-88. Бактерії роду Listeria не відновлюють нітрати до нітритів за винятком L. grayi і L. grayi subsp. murrayi . Виявлення в посівах грампозитивних коротких тонких паличок каталазопозитивних що не відновлюють нітрати до нітритів не утилізують маніт рухливі при 250С и нерухомі при 370С вказує на належність виділених культур з до роду Listeria. Для підтвердження належності виділених лістерій до виду L.monocytogenes визначають здатність до ферментації рамнози ксилози наявність лецитиназної і ?-гемолітичної активності і проводять постановку CAMP-тесту. Диференційні ознаки видів роду Listeria наведені в табл. 1. Для видової диференціації виділених культур лістерій рекомендується використовувати біохімічні тест-системи API Listeria фірми “BioMerieux”. При їх застосуванні варто керуватися рекомендаціями виробника. Таблиця 1 Ознака L. monocytogenes L. ivanovii L. seeligeri L. innocua L. grayi L. welshimeri Ферментація: • маніту - - - + - • ксилози - + + - - + • рамнози + - - V - V ?-гемоліз + + + - - - CAMP-тест посилення гемолізу біля штриха S. aureus + - + - - - Лецитиназна активність: • на середовищі з активованим вугіллям + + - - - - • на середовищі без вугілля - + - - - - 9.8.6. Здатність ферментувати рамнозу і ксилозу - визначають аналогічно п. 9.8.4. Бактерії L. monocytogenes утилізують рамнозу з утворенням кислоти і не утилізують ксилозу. 9.8.7. ?-гемолітичну активність досліджуваних культур визначають за утворенням зон просвітління за рахунок розчинення еритроцитів навколо колоній що виросли на поверхні кров'яного агару з дефібринованою кров’ю барана або кроля п.п. 6.3.2.3 7.2.6 . Посіви інкубують при 37±1 0С протягом 24 год. Listeria monocytogenes володіють гемолітичною активністю утворюють вузькі чіткі зони просвітління навколо колоній . 9.8.8. Постановку САМР-тесту проводять для диференціації L.monocytogenes від інших видів лістерій що мають ?-гемолітичну активність. 1 варіант. Для проведення тесту 2-3-добові культури гемолітичних штамів S.aureus і R.equi засівають на кров'яний агар з еритроцитами барана двома паралельними штрихами на відстані 5 0-5 5 см як показано на мал. 1. Мал.1. S - посів Staphylococcus aureus; R - посів Rhodococcus equi. Між вертикальними штрихами S. aureus і R.equi засівають паралельними штрихами досліджувані культури лістерій на відстані один від одного не менше 1 см і від вертикальних штрихів - 0 5 см. У якості контролю використовують тест-штами L. monocytogenes і L. ivanovii. Інкубують 18-24 години при 37±1 0С. Відзначають форму і розміри зон гемолізу біля вертикальних штрихів росту стафілокока і родокока. Listeria monocytogenes дають невелике розширення зони гемолізу до 2 мм біля штриха S. aureus позитивний САМР-тест і має відсутність змін зони гемолізу поруч зі штрихом R. equi негативний САМР-тест . Listeria ivanovii дають широку 5-10 мм смугу „стрілкоподібного” ?-гемолізу біля штаму R. equi. За відсутності тест-штаму R. equi як виключення дозволяється постановка САМР-тесту в наступній модифікації. 2-3-добову культуру гемолітичного штаму S.aureus засівають на кров'яний агар з еритроцитами барана вертикальним штрихом. Перпендикулярними до нього штрихами засівають досліджувані культури лістерій на відстані один від одного не менше 1 см і від вертикального штриха - 0 5 см. У якості контролю використовують тест-штами L. monocytogenes і L. ivanovii. Інкубують 24 години при 37±1 0С. Відзначають форму і розміри зон гемолізу біля вертикального штриха росту стафілокока. L. monocytogenes дають розширення зони гемолізу біля штриха S. aureus позитивний САМР-тест L. ivanovii не дає такого розширення негативний САМР-тест 9.8.9. Для визначення лецитиназної активності дно двох чашок Петрі з поживним агаром з глюкозою що містять: 1 чашка - жовток курячого яйця й активоване вугілля 2 чашка - жовток курячого яйця без активованого вугілля – поділяють на кілька секторів або квадратів досліджувані культури і контрольні штами лістерій пересівають паралельно короткими штрихами на відповідні сектори чашок з вугіллям і без нього. Інкубують 48 год. при 37±1 0С. Чашки переглядають у проходячому світлі і визначають наявність активності в присутності й без активованого вугілля порівнюючи з контрольними висівами музейних штамів. L. ivanovii дає щільну зону помутніння шириною 3-6 мм незалежно від наявності активованого вугілля. L. monocytogenes дає аналогічну зону помутніння в присутності активованого вугілля і не дає її на середовищі без вугілля. Інші види лістерій не дають зони помутніння. 9.9. Облік результатів. Результат оцінюють по кожній дослідженій пробі окремо. У зразку продукту констатують присутність Listeria monocytogenes якщо при посіві на селективні середовища виділені короткі неспороутворюючі грампозитивні палички каталазопозитивні рухливі при 25±1 0С і нерухомі при 37±1 0С які утилізують ескулін зброджують з утворенням кислоти рамнозу і не зброджують маніт і ксилозу не відновлюють нітрати до нітритів володіють ?-гемолітичною активністю дають позитивну реакцію в САМР-тесті з S.aureus і негативну - з R.equi виявляють лецитиназну активність на поживному агарі с додаванням жовтка курячого яйця й у присутності активованого вугілля. Результати виявлення Listeria monocytogenes у визначеній наважці продукту записують: “Listeria monocytogenes виявлені в 25 г см3 у 50-100 г ~ для продуктів дитячого лікувального і спеціалізованого харчування продукту” чи “Listeria monocytogenes не виявлені в 25 г см3 у 50-100 г - для продуктів дитячого лікувального і спеціального харчування продукту”. 10. Виявлення Listeria monocytogenes у реакції наростання титру фага РНФ Реакція наростання титру фага - швидкий специфічний метод виявлення лістерій що забезпечує виявлення збудника в досліджуваному матеріалі без виділення культури і може бути використана як додатковий метод для виявлення L. monocytogenes у харчових продуктах при проведенні протиепідемічних заходів і при епідрозслідуванні . РНФ заснована на властивості індикаторного бактеріофага строго специфічно розмножуватися в клітинах гомологічного мікроба. Розмноження бактеріофага супроводжується збільшенням кількості його часток і підвищенням титру. У реакції застосовують лістеріозні бактеріофаги L2A і L4A. Штами L.monocytogenes I 9-127 і II 9-72 серогруп. Поживні середовища з 0 5 % глюкози: 1 5 % МПБ і 0 7 % МПА. При постановці РНФ із пробами харчових продуктів зважують 25 г досліджуваного матеріалу подрібнюють поміщають у колбу ємністю 1 дм3 і додають 250 см3 МПБ. Суміш протягом 5-10 хв. струшують потім 9 см3 переносять у бактеріологічну пробірку № 1 дослід . Бактеріофаги використовують у робочому розведенні 10 000 фагових корпускул у 1 см3 . Для цього їх розчиняють у МПБ до вихідного об’єму зазначеного на етикетці ампули а потім на МПБ окремими піпетками роблять п'ять послідовних десятикратних розведень в останньому розведенні титр бактеріофага складе 1 х 104 . Суміш фагів готують шляхом змішування рівних об’ємів фагу L2A і L4A у робочому розведенні. Для контролю титру бактеріофага ставлять один на групу аналізів проведених одночасно у пробірку № 2 контроль вносять 9 см3 МПБ. У пробірки № 1 і 2 вносять по 1 см3 суміші фагів в робочому розведенні і витримують їх протягом 16-24 год. при кімнатній температурі після чого в пробірки додають по 1 см3 хлороформу. Вміст ретельно струшують і залишають при кімнатній температурі на 30-40 хв. Хлороформ осідає на дно надосадову рідину піддають подальшим дослідженням. При використанні суміші фагів з дослідної і контрольної пробірок № 1 і 2 беруть по 0 2 см3 і переносять по 0 1 см3 у дві пробірки що містять по 0 9 см3 МПБ один ряд для виявлення фагу L2A а другий - L4A а потім з кожної пробірки готують ще одне десятикратне розведення. Готують суспензії штамів I і II серогруп за стандартом мутності 10 од. шляхом розведення добової агарової культури у фізіологічному розчині. В усі пробірки з розведеним матеріалом додають по 0 1 см3 суспензії штаму 1 серогрупи для виявлення фагу L2A або штаму II серогрупи для виявлення фагу L4A. Вміст пробірок засівають методом агарових шарів за Граціа. Для цього напередодні дня дослідження в чашки Петрі розливають по 10 см3 1 5 % МПА; Якщо МПА розливають у день дослідження то поверхню агару попередньо підсушують протягом 40-50 хв. при 37±1 0С або 2 год. при кімнатній температурі. Для другого шару використовують розплавлений і охолоджений до 48-50 °С 0 7% МПА який варто використовувати протягом години тому що пізніше він набуває желеподібної консистенції і непридатний для дослідження. У пробірки піпеткою вносять по 2 5-3 см3 розплавленого й охолодженого до 48-50 °С 0 7 % МПА. Вміст швидко і ретельно перемішують обертанням пробірки між долонями і виливають у чашку Петрі. Суміш легким погойдуванням чашки рівномірно розподіляють другим шаром на поверхні 1 5%-ного МПА. Чашки залишають на рівному місці на 20-30 хвилин до застигання 0 7 % МПА потім перевертають і інкубують при кімнатній температурі. Облік реакції проводять через 16 24 год. інкубації посівів. У дослідних пробах і контролі титру фага підраховують число негативних колоній у всіх чашках. Негативні колонії - округлі добре помітні на тлі бактеріального росту прозорі ділянки що утворяться в результаті лізису бактерій. При обліку результатів порівнюють кількість негативних колоній на чашках відповідних розведень. Результати реакції оцінюють за збільшенням титру бактеріофага кількості негативних колоній : • збільшення кількості негативних колоній у пробі що досліджується відносно контролю в 5 і більше разів хоча б по одному з розведень оцінюється як позитивний результат менше ніж у 5 разів - негативний; • суцільний лізис або лізис з острівцями оцінюється як позитивний результат. При одержанні позитивного результату РНФ дають висновок що в досліджуваному матеріалі пробі виявлені бактерії роду Listeria. 11. Визначення Listeria monocytogenes за допомогою автоматичного імуноаналізатора типу “miniVIDAS” Дослідження проводять із застосуванням набору VIDAS Listeria monocytogenes ІІ LMO 2 . Для визначення Listeria monocytogenes слід дотримуватись інструкції виробника. Отримання позитивного результату свідчить про наявність у пробі патогенних лістерій. Позитивні результати отримані експрес-методом потребують підтвердження бактеріологічним методом. 12. Біологічні серологічні та молекулярно-генетичні дослідження Біологічні дослідження виділених культур постановка біопроб на мишах і їх серологічну діагностику в реакції аглютинації а також молекулярно-генетичні дослідження біологічного матеріалу проб з об’єктів довкілля проводять у ході протиепідемічних заходів і при епідрозслідуванні захворювань відповідно до методичних рекомендацій “Лабораторная диагностика листериоза животных и людей меры борьбы и профилактики” затверджених МОЗ СРСР 04.09.86. та інструкцій про застосування до відповідних тест-систем або наборів реагентів для молекулярно-генетичних методів досліджень. 13. Вимоги безпеки Дослідження харчових продуктів на наявність Listeria monocytogenes проводять відповідно до державних санітарних правил ДСП 9.9.5.-080-2002 “Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях відділах відділеннях мікробіологічного профілю”. Пам’ятати! Listeria monocytogenes є патогенним мікроорганізмом і вимагає особливо обережного обігу. Вагітним жінкам працювати з культурами Listeria monocytogenes не рекомендується. Ряд реагентів хлорид літію реактиви для нітратного тесту що використовуються при дослідженні небезпечні вимагають обережного обігу. Уникати дотику і вдихання парів. При попаданні на шкіру негайно змити великою кількістю води. 14. Нормативні посилання 1. Основи законодавства України про охорону здоров’я 2. Закон України „Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення” 3. Закон України „Про захист населення від інфекційних хвороб” 4. Закон України „Про безпечність та якість харчових продуктів” 5. Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні затверджене Постановою Кабінету Міністрів України 22.06.99 №1109 в редакції Постанови Кабінету Міністрів України від 19.08.02. №1217 6. ДСП №9.9.5.064.2000 „Порядок видачі дозволів на роботу із мікроорганізмами I-IV груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК” 7. ДСП №9.9.5.-080-2002 „Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях відділах відділеннях мікробіологічного профілю” 8. ГОСТ 26668-85 „Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований” 9. ГОСТ 26669-85 „Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов” 10. ГОСТ 10444.1-84 „Консервы. Приготовление растворов красок индикаторов питательных сред применяемых в микробиологическом анализе” 11. ГОСТ 9225-84 „Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа” 12. ГОСТ 9958-81 „Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа”. 13. ГОСТ 21237-75 „Мясо. Методы микробиологического анализа” 14. ГОСТ 7631-85 „Рыба морские млекопитающие морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки органолептические методы оценки качества методы отбора проб для лабораторных испытаний” 15. Методические рекомендации „Лабораторная диагностика листериоза животных и людей меры борьбы и профілактики” МЗ СССР 04.09.86 16. СанПиН 42-123-4940-88 „Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского лечебного и диетического питания их компонентов” 17. СанПиН 42-123-4423-87 «Нормативы и методы микробиологического контроля продуктов детского питания изготовленных на молочных кухнях системы здравоохранения». 18. Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских безпозвоночных утверждена заместителем главного государственного санитарного врача СССР 22.02.91 №5319-91. 19. МР 4.4.4.-108-2004 Методичні рекомендації „Періодичність контролю продовольчої сировини та харчових продуктів за показниками безпеки”. 20. Положение о порядке учета хранения обращения отпуска и пересылки культур бактерий вирусов риккетсий грибов простейших микоплазм бактерийных токсинов ядов биологического происхождения утверджено главным государственным санитарным врачом СССР 18.05.79. 21. ДСТУ ISO 11290-1:2003 „Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення та підрахування Listeria monocytogenes ч.1. Метод виявлення” 22. ДИРЕКТИВА СОВЕТА 92/46/EEC от 16.06.92 устанавливающая медико-санитарные правила по производству и размещению на рынке сырого молока молока подвергнутого тепловой обработке и продуктов на молочной основе. Заступник Головного державного санітарного лікаря України Л.М. Мухарська Додаток до методичних вказівок „Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині” Рекомендований Поживні середовища промислового виробництва зареєстровані в Україні рекомендовані для виділення Listeria monocytogenes Для культивування ізолятів Поживний агар / бульйон - Nutient Agar / Broth M001 / M002 Склад М001 грам/дм3 М002 грам/дм3 Пептичний перевар тваринної тканини М’ясний екстракт Дріжджовий екстракт Натрію хлорид Агар-агар Кінцеве значення рН при 25?С 7 4 ± 0 2 5 00 1 50 1 50 5 00 15 00 5 00 1 50 1 50 5 00 – Приготування: Розмішати 28 0 г порошку М001 або 13 0 г порошку М002 в 1000 см3 дистильованої води. Прокип’ятити до повного розчинення часток. Розлити у відповідні ємкості. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 121?С протягом 15 хв. Для приготування середовища для культивування лістерій в середовище M001 перед стерилізацією вносять глюкозу 10 0 г і ретельно перемішують або стерильний розчин глюкози асептично додають до кінцевої концентрації 1% в середовище M001 після його стерилізації. Готове середовище має світло-бурштиновий колір прозоре або з легкою опалесценцією. Дріжджовий триптон-соєвий агар / бульйон - Tryptone Soya Yeast Extract Agar / Broth M1214 / M1263 Ці середовища рекомендовані фахівцями комітету ISO для виявлення лістерій а також для культивування і зберігання багатьох гетеротрофних мікроорганізмів. Склад М1214 грам/ дм3 М1263 грам/ дм3 Гідролізат казеїну Папаїновий перевар соєвого борошна Натрію хлорид Калію гідрофосфат Глюкоза Дріжджовий екстракт Агар-агар Кінцеве значення рН при 250С 7 3 ± 0 2 17 00 3 00 5 00 2 50 2 50 6 00 15 00 17 00 3 00 5 00 2 50 2 50 6 00 – Приготування: Розмішати 51 0 г порошку М1214 або 36 0 г порошку М1263 в 1000 см3 дистильованої води. Кип’ятити до повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Готові середовища мають жовтий колір прозорі. Принцип і оцінка результату. За рекомендаціями американських фахівців для виділення Listeria monocytogenes з молочних продуктів досліджуваний матеріал засівають в середовище збагачення і інкубують при 300С протягом 24-48 год. Потім культуру засівають штрихами на Модифікований агар Мак-Брайда для лістерій М891 з циклогексамідом або Агар LPM М1228 з подальшою інкубацією при 350С протягом 48 год. Підозрілі на лістерії колонії відбирають у відбитому світлі 450 після чого їх розсівають на Дріжджовий Триптон-соєвий агар М1263 . Колонії лістерій виглядають щільними білими або веселково-білими нагадуючи бите скло. Колонії інших мікроорганізмів жовті або оранжеві. Середовища селективного збагачення Основа бульйону Фрейзера - Fraser Broth Base M1327 Основа бульйону Фрейзера з добавками FD125I і FD141 рекомендована Міжнародним комітетом стандартизації як первинне а також як вторинне середовище збагачення для виділення і підрахунку Listeria monocytogenes в харчових продуктах. Склад грам/дм3 Ферментативний гідролізат казеїну Пептон М'ясний екстракт Дріжджовий екстракт Натрію хлорид Калію дигідрофосфат Натрію гідрофосфат Ескулін Літію хлорид Кінцеве значення рН при 250С 7 2 ± 0 2 5 00 5 00 5 00 5 00 20 00 1 35 12 00 1 00 3 00 Приготування. Розмішати 54 92 г порошку в 1000 см3 дистильованої води. При необхідності підігріти для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Охолодити до 45–50°С і асептично додати розчинений в 10 см3 0 2 N NaOH вміст 1 флакона селективної добавки Фрейзера FD125I і розчинений в 1-2 см3 стерильної дистильованої води вміст 2 флаконів добавки Фрейзера FD141 до 1000 см3 середовища для первинного збагачення або по 1 флакону FD125I і FD141 до 500 см3 середовища для вторинного збагачення. Добре перемішати і розлити у пробірки флакони . Принцип і оцінка результату. Хлористий літій пригнічує ріст ентерококів. Налідиксова кислота і акрифлавін пригнічують ріст відповідно грамнегативної і грампозитивної флори. Listeria monocytogenes гідролізує ескулін до ескулетину і глюкози. Реагуючи з цитратом заліза ескулетин утворює коричнево-чорний комплекс що приводить до потемніння середовища. Досліджувані зразки засівають в бульйон для первинного збагачення 1 флакон FD125I і 2 флакони FD141 на 1000 см3 Основи бульйону Фрейзера і інкубують протягом 24 годин при 30°С. Після первинного збагачення 0 1 см3 культури пересівають в бульйон для вторинного збагачення 1 флакон FD125I і 1 флакон FD141 на 500 см3 Основи бульйону Фрейзера і інкубують протягом 18 годин при 35–37°С. Культуру висівають на Оксфордський агар або на PALCAM агар для подальшого виділення і підрахунку. Бульйон збагачення для лістерій - Listeria Enrichment Broth М569 Склад: грам/дм3 Частина А: Гідролізат казеїну Пептичний перевар тваринної тканини Глюкоза Натрію хлорид Тіаміну дихлорид Акрифлавіну гідрохлорид Трипафлавін Налідиксова кислота Частина В: Калію роданід Кінцеве значення рН при 250С 7 4 ± 0 2 10 00 10 00 1 00 5 00 0 005 0 01 – 37 50 Приготування. Розмішати 26 0 г порошку частини А і 37 5 г порошку частини В в 1000 см3 дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення часток. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Готове середовище має жовте забарвлення прозоре або з легкою опалесценцією. Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну і пептичний перевар тваринної тканини є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій. Тіамін стимулює ріст лістерій. Роданід і налідиксова кислота пригнічують ріст грамнегативних бактерій. Комбінація селективних речовин і акридинових фарбників пригнічує ріст ентерококів. Контаміновані зразки засівають в Бульйон збагачення для лістерій безпосередньо або проводять холодове збагачення в Триптозному бульйоні М179 після чого культури відсівають на Селективний агар для лістерій. Гемоліз можна перевірити шляхом висіву на кров'яний агар М073 . Середовище збагачення для лістерій UVM – Listeria Enrichment Medium UVM Medium М890 . Склад грам/дм3 Гідролізат казеїну Протеозопептон М'ясний екстракт Дріжджовий екстракт Натрію хлорид Калію дигідрофосфат Натрію гідрофосфат Ескулін Налідиксова кислота Кінцеве значення рН при 250С 7 4 ± 0 2 5 00 5 00 5 00 5 00 20 00 1 35 12 00 1 00 0 02 Приготування. Розмішати 54 37 г порошку в 1000 см3 дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Охолодити до 500С і асептично додати стерилізований фільтруванням розчин акрифлавіну гідрохлориду до кінцевої концентрації 12 мкг/ см3 або 25 мкг/ см3 . Готове середовище має янтарне забарвлення з легкою опалесценцією з голубуватим відтінком. Принцип і оцінка результату. Середовище використовують для двоступеневого селективного збагачення лістерій що дозволяє збільшити висів Listeria monocytogenes з м'ясних продуктів протягом 3-4 днів. Це середовище рекомендують як середовище первинного збагачення для виділення лістерій пошкоджених при термічній обробці. Гідролізат казеїну протеозопептон дріжджовий і м'ясний екстракти є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій. Ескулін надає середовищу диференціюючи властивостей. Налідиксова кислота і акрифлавін пригнічують ріст відповідно грамнегативних і грампозитивних мікроорганізмів що разом з підвищеною концентрацією фосфату додає середовищу селективних властивостей по відношенню до лістерій. Для збагачення до 25 0 г або 25 0 см3 матеріалу додають 225 см3 середовища що містить 12 мкг/см3 акрифлавіну і інкубують при 300С протягом 4 годин після чого висівають 0 2 см3 культури на чашки з Селективним агаром для лістерій. Через 24 год. інкубації 0 1 см3 культури вносять в 10 0 см3 того ж середовища що містить 25 мкг/ см3 акрифлавіну гідрохлориду і через 24 год. знову роблять висів на чашки з Селективним агаром для лістерій. Бульйонні культури лістерій представляють велику небезпеку в порівнянні з колоніями на агарі тому при роботі з ними треба дотримуватися особливої обережності. Бульйон збагачення для лістерій модифікований – Listeria Enrichment Broth Modified М888 Склад: грам/дм3 Триптоза Дріжджовий екстракт М'ясний екстракт Натрію хлорид Натрію гідрофосфат Калію дигідрофосфат Ескулін Налідиксова кислота Акрифлавіну гідрохлорид Трипафлавін Кінцеве значення рН при 250С 7 4 ± 0 2 10 00 5 00 5 00 20 00 9 60 1 35 1 00 0 02 0 012 Приготування. Розмішати 52 0 г порошку в 1000 см3 дистильованої води. Підігріти при необхідності для повного розчинення частинок. Розлити у відповідні ємкості. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Готове середовище має жовте забарвлення прозоре або з легкою опалесценцією з блакитним відтінком. Принцип і оцінка результату. Це середовище використовують для селективного збагачення видів Listeria з молока молочних і інших харчових продуктів. Середовище містить триптозу дріжджовий і м'ясний екстракти які є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій у тому числі вітамінів амінокислот мікроелементів. Хлорид натрію підтримує оптимальний осмотичний тиск середовища а фосфати надають йому буферних властивостей. Налідиксова кислота і акрифлавін пригнічують ріст відповідно грамнегативних і грампозитивних мікроорганізмів за винятком лістерій. Для збагачення до 25 0 г або 25 0 см3 матеріалу додають 225 см3 середовища і при необхідності подрібнюють. Інкубацію ведуть при 300С протягом 7 діб роблячи висів через 1 2 і 7 днів на Селективний агар для лістерій. Основа бульйону вторинного збагачення для лістерій – Fraser Secondary Enrichment Broth Base М1083 Це середовище із спеціальною добавкою рекомендують для виділення культивування і збагачення Listeria monocytogenes з харчових продуктів і об'єктів довкілля. Склад: грам/дм3 Протеозопептон Гідролізат казеїну Дріжджовий екстракт М'ясний екстракт Натрію хлорид Літію хлорид Натрію гідрофосфат Калію дигідрофосфат Ескулін Заліза амонійного цитрат Кінцеве значення рН при 250С 7 2 ± 0 2 5 00 5 00 5 00 5 00 20 00 3 00 12 00 1 35 1 00 0 50 Приготування. Розмішати 57 85 г порошку в 990 см3 дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Остудити до 45-500С і асептично додати розчинений в 10 см3 0 2 N NaOH вміст 1 флакона з однією з добавок Фрейзера FD064 або FD065 . Ретельно перемішати і розлити у відповідний посуд. Готове середовище має жовте забарвлення прозоре з легким преципітатом. Після введення добавки середовище набуває флюоресцентно-жовтого забарвлення і має легкий преципітат. Принцип і оцінка результату. Протеозопептон гідролізат казеїну дріжджовий і м'ясний екстракти є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій. Хлорид літію пригнічує ріст ентерококів. Усі лістерії гідролізують ескулін до ескулетина який з іонами заліза формує коричнево-чорний або чорний комплекс. Цитрат амонійного заліза стимулює ріст Listeria monocytogenes. Цей бульйон засівають матеріалом з середовища первинного збагачення. Культури що виросли на бульйоні Фразера відсівають на щільні середовища для підтвердження присутності лістерій. Основа селективного бульйону для лістерій – Listeria Selective Broth Base М889 Це середовище з додаванням селективних речовин рекомендують для селективного виділення і культивування Listeria monocytogenes. Склад: грам/дм3 Гідролізат казеїну Папаїновий перевар соєвого борошна Дріжджовий екстракт Натрію хлорид Калію гідрофосфат Глюкоза Кінцеве значення рН при 250С 7 3 ± 0 2 17 00 3 00 6 00 5 00 2 50 2 50 Приготування. Розмішати 36 0 г порошку в 1000 см3 дистильованої води. Підігріти для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Охолодити до кімнатної температури і асептично додати розчинений в 5 см3 0 2 N NaOH вміст 1 флакона з Селективною добавкою для лістерій II FD163 або 2 флаконів з Селективною добавкою для лістерій I FD163I . Перед розливом ретельно перемішати. Готове середовище має жовте флуоресціююче забарвлення прозоре без будь-якого преципітату. Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну папаїновий перевар соєвого борошна і дріжджовий екстракт є джерелом необхідних поживних речовин для росту бактерій. Глюкоза є джерелом енергії. Добавки що вносяться надають середовищу селективних властивостей. Циклогексамід пригнічує ріст сапрофітних грибів. Налідиксова кислота і акрифлавін пригнічують ріст відповідно грамнегативних і грампозитивних мікроорганізмів. Для збагачення до 25 0 г або 25 0 см3 матеріалу додають 225 см3 середовища і при необхідності подрібнюють. Інкубацію ведуть при 300С до 7 доби. Вказаний період інкубації підходить для більш ефективного виділення пошкоджених зовнішніми чинниками лістерій з молока і молочних продуктів. Через 1 2 і 7 днів інкубації матеріал висівають на Селективний агар для лістерій. Диференційно-діагностичні селективні середовища Агар для ідентифікації лістерій PALCAM – Listeria Identification Agar PALCAM M1064 Поліміксин Polymyxin – Акрифлавін Acriflavine – Літій Lithium-chloride – Цефтазідім Ceftazidime Ескулін Esculin – Маніт Mannitol агар з добавкою FD061 рекомендований для виділення лістерій з харчових продуктів Склад: грам/дм3 Пептон Крохмаль Натрію хлорид Маніт Заліза амонійного цитрат Ескулін Глюкоза Літію хлорид Феноловий червоний Агар-агар Кінцеве значення рН при 250С 7 0?0 2 23 00 1 00 5 00 10 00 0 50 0 80 0 50 15 00 0 08 13 00 Приготування. Розмішати 34 5 г порошку в 500 см3 дистильованої води. Прокип'ятити до повного розчинення середовища. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Охолодити до 500С і асептично додати розчинений в дистильованій воді вміст 1 флакона з Селективною добавкою для лістерій PALCAM FD061 . Ретельно перемішати і розлити середовище в стерильні чашки Петрі. Готове середовище має червоне забарвлення прозоре із злегка опалесцуючою поверхнею. Принцип і оцінка результату. Середовище є високо селективним через наявність в ньому хлориду літію цефтазідіму поліміксину і акрифлавіну. PALCAM агар - диференційно-діагностичне середовище. Використовуються 2 індикаторні системи: ескулінова і манітна. Listeria monocytogenes гідролізує ескулін на ескулетин і глюкозу. Реагуючи з цитратом заліза ескулетин утворює коричнево-чорний комплекс що приводить до потемніння середовища навкруги колоній. Лістерії не ферментують маніт тому зброджуючі маніт ентерококи і стафілококи формують кольорові колонії від червоного до жовтого . Мікроаерофільні умови обмежують ріст аеробів наприклад представників родів Bacillus і Pseudomonas. Введення до складу середовища яєчного жовтка 2 5% сприяє відновленню пошкоджених клітин. Додавання середовища з кров'ю поверх PALCAM агару дозволяє диференціювати і підрахувати кількість гемолітичних лістерій. Залежно від типу аналізованого зразка перед висівом на PALCAM агар повинне бути проведено збагачення в різних бульйонах для селективного збагачення. Основа Оксфордського середовища для лістерій – Listeria Oxford Medium Base M1145 Рекомендовано для виділення Listeria monocytogenes з клінічного матеріалу і зразків харчових продуктів. Склад: грам/дм3 Пептон спеціальний Літію хлорид Крохмаль кукурудзяний Ескулін Заліза амонійного цитрат Агар-агар Кінцеве значення рН при 250С 7 0?0 2 23 00 15 00 1 00 1 00 0 50 10 00 Приготування. Розмішати 27 75 г порошку в 500 см3 дистильованої води. Прокип'ятити до повного розчинення середовища. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Охолодити до 500С і асептично додати розчинений в 5 см3 50%-го етанолу вміст 1 флакона з селективною добавкою для виділення лістерій FD172 . Ретельно перемішати і розлити середовище в стерильні чашки Петрі. Готове середовище має темно-бурштинове забарвлення з блакитним відблиском. Принцип і оцінка результату. Хлорид літію і антибіотики пригнічують ріст грамнегативної мікрофлори і більшості грампозитивних мікроорганізмів окремі штами Staphylococcus утворюють ескулін-негативні колонії . Listeria monocytogenes гідролізує ескулін на ескулетин і глюкозу. Реагуючи з цитратом заліза ескулетин утворює коричнево-чорний комплекс що приводить до потемніння середовища навкруги колоній. Методика виділення лістерій залежить від досліджуваних зразків. Для всіх зразків рекомендується селективне і холодове збагачення. Для зразків харчових продуктів і матеріалу з об’єктів довкілля звичайно використовують селективне збагачення. Селективний агар для лістерій двокомпонентне середовище – Listeria Selective Agar M567 Середовище запропоновано для культивування і виділення видів Listeria з клінічного і іншого матеріалу Склад: грам/дм3 Частина А: Гідролізат казеїну Пептичний перевар тваринної тканини Глюкоза Натрію хлорид Тіаміну дихлорид Акрифлавіну гідрохлорид Трипафлавін Налідиксова кислота Агар-агар 10 00 10 00 1 00 5 00 0 005 0 01 0 04 13 00 Частина В: Калію роданід 37 50 Кінцеве значення рН при 250С 7 4 ± 0 2 Приготування Розмішати 39 0 г порошку частини А і 37 5 г порошку частини В в 1000 см3 дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Готове середовище має жовте забарвлення прозоре або злегка опалесцує. Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну і пептичний перевар тваринної тканини є джерелом необхідних поживних речовин для росту лістерій. Тіамін вітамін групи В стимулює ріст лістерій. Роданід і налідиксова кислота пригнічують ріст грамнегативних бактерій. Комбінація селективних речовин і акридинових фарбників пригнічує ріст ентерококів. Контаміновані зразки засівають в Бульйон збагачення для лістерій безпосередньо або проводять холодове збагачення в Триптозному бульйоні М179 після чого культури відсівають на Селективний агар для лістерій. Гемоліз можна перевірити шляхом висіву на Кров'яний агар М073 . Основа агару МакБрайда для лістерій / Основа агару МакБрайда для лістерій модифікована – McBride Listeria Agar Base / Modified McBride Listeria Agar Base M386 / M891 Середовище використовують для селективного виділення і культивування Listeria monocytogenes з клінічного матеріалу від персоналу харчових об'єктів і ін. Склад: М386 грам/дм3 М891 грам/дм3 Гідролізат казеїну Пептичний перевар тваринної тканини Триптоза М'ясний екстракт Натрію хлорид Гліциновий ангідрид Літію хлорид Фенілетанол Агар-агар Кінцеве значення рН при 250С 7 3 ± 0 2 – – 10 00 3 00 5 00 10 00 0 50 2 50 15 00 5 00 5 00 – 3 00 5 00 10 00 0 50 2 50 15 00 Приготування. Розмішати 46 0 г порошку в 1000 см3 дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Охолодити до температури нижче 500С і перед застиганням асептично додати в середовище М386 стерильну дефібриновану кров до кінцевої концентрації 5% об/об і в обидва середовища розчинений в 10 см3 0 2 N NaOH вміст 1 флакона з добавкою МакБрайда для лістерій FD171 . Ретельно перемішати і розлити в стерильні чашки Петрі. Середовище має світло-бурштинове забарвлення прозоре або має легку опалесценцію. Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну триптоза м'ясний екстракт пептичний перевар тваринної тканини м'ясний екстракт служать джерелом вуглецю азоту мінеральних речовин вітамінів В мікроелементів і інших важливих чинників для росту лістерій. Фенілетилалкоголь вибірково пригнічує синтез ДНК має бактеріостатичну дію на грамнегативні бактерії. Гліцин пригнічує ріст деяких бактерій включаючи Escherichia coli і Enterococcus faecalis. Хлорид літію також володіє антимікробною активністю. Визначення Listeria monocytogenes істотно поліпшується при використанні одно- або двохетапного збагачення матеріалу на рідкому середовищі. Відповідно до одноетапного методу інфікований матеріал засівають безпосередньо на Збагачувальний бульйон для лістерій. За двохетапним методом спочатку матеріал засівають в Триптозний бульйон М177 і інкубують в холодильнику при 40С протягом декількох тижнів для холодового збагачення лістерії можуть розмножуватися при низьких температурах . Потім інокулюють Збагачувальний бульйон для лістерій і далі роблять висів на селективний агар наприклад модифікований агар МакБрайда. Підозрілі на лістерії колонії відбирають при відбитому 450 освітленні. Колонії лістерій щільні білі або веселково-білі мають вид битого скла. Дрібні колонії мають блакитний відтінок. Колонії інших мікроорганізмів жовто-оранжеві. Агар МакБрайда можна використовувати як основне середовище з додаванням крові або без неї . Основа селективного агару LPM для лістерій - LPM Agar Base M1228 Агар LPM з літієм фенілетанолом і моксалактамом рекомендують для виділення і культивування Listeria monocytogenes з молочних і інших харчових продуктів. Склад: грам/дм3 Гідролізат казеїну Пептичний перевар тваринної тканини М'ясний екстракт Гліциновий ангідрид Літію хлорид Натрію хлорид Фенілетанол Агар-агар Кінцеве значення рН при 250С 7 3 ± 0 2 5 00 5 00 3 00 10 00 5 00 5 00 2 50 15 00 Приготування. Розмішати 50 5 г порошку в 1000 см3 дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 12 хв. Охолодити до 500С і асептично додати добавку FD151. Ретельно перемішати і розлити в чашки Петрі. Готове середовище має жовте забарвлення прозоре або з легкою опалесценцією. Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну м'ясний екстракт і пептичний перевар тваринної тканини є джерелом необхідних поживних речовин для росту. Гліциновий ангідрид хлорид літію і фенілетанол пригнічують ріст грампозитивних коків і грамнегативних паличок. Моксалактам пригнічує ріст грампозитивних і грамнегативних бактерій включаючи стафілококи протеї і псевдомонади. При косому освітленні колонії Listeria monocytogenes виглядають веселковими блакитно-зеленими. Нітратний агар / Нітратний бульйон – Nitrate Agar / Broth M072 / M439 Ці середовища рекомендують для визначення нітратредуктази у бактерій. Склад: М072 грам/дм3 М439 грам/дм3 Пептичний перевар тваринної тканини М'ясний екстракт Калію нітрат Агар-агар Кінцеве значення рН при 250С 5 00 3 00 1 00 12 00 6 8 ± 0 2 5 00 3 00 1 00 – 7 0 ± 0 2 Приготування. Розмішати 21 0 г порошку М072 або 9 0 г порошку М439 в 1000 см3 дистильованої води. Прокип'ятити для повного розчинення частинок. Розлити в пробірки. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Охолодити пробірки з середовищем в нахиленому стані. Готове середовище має світло-бурштиновий колір прозоре або з легкою опалесценцією. Принцип і оцінка результату. Здатність відновлювати нітрат є варіабельною ознакою і може використовуватися для диференціації і ідентифікації бактерій зокрема представників родини ентеробактерій. Неферментуючі бактерії і ряд інших грамнегативних паличок варіюють за здібністю до редукції нітратів. Деякі з них здатні до денітрифікації з відновленням нітрату до газоподібного азоту. Утворення азоту з нітрату є важливим диференціальним тестом для ферментуючих глюкозу грамнегативних бактерій. Відновлення нітрату звичайно відбувається в анаеробних умовах коли мікроорганізми «відщеплюють» кисень з нітрату. Представники Enterobacteriaceae зазвичай відновлюють нітрат до нітриту який реагує з сульфаніловою кислотою і N N-диметил-1-нафтиламіном внаслідок чого розвивається червоне забарвлення реакція Гріса . Якщо мікроорганізм активно редукує нітрат тест треба проводити раніше поки утворений нітрит повністю не перейшов в газоподібний азот. Приготування реактивів для нітратного тесту: 1.Сульфанілова кислота: розчинити 8 0 г сульфанілової кислоти в 1 дм3 5N оцтової кислоти. 2.Альфа-Нафтиламіновий реактив: розчинити 5 0 г ?–нафтиламіну в 1 дм3 5N оцтової кислоти. УВАГА: реактиви токсичні вимагають обережного обігу; уникати піпетування ротом утворення аерозолів попадання реактивів на шкіру. Проведення тесту: Внести декілька крапель кожного реактиву в пробірку з досліджуваною культурою. На відновлення нітрату указує поява червоного або рожевого кольору середовища. Як негативний контроль ставлять тест з незасіяним середовищем. За відсутності почервоніння середовища в пробірку додають щіпку порошку цинку щоб переконатися у присутності нітрату в середовищі. Цинк відновлює нітрат що супроводжується появою червоного забарвлення у присутності тест-реактиву . Слід мати на увазі що внесення дуже великої кількості цинку може привести до хибнонегативної реакції. Нітратний тест не є вирішальним для ідентифікації. Остаточну ідентифікацію проводять з урахуванням морфологічних ознак фарбування за Грамом біохімічних і серологічних характеристик мікроорганізму. Бульйон для визначення цукролітичної активності лістерій – Carbogydrate Consumption Broth М1264 Рекомендується для культивування і диференціації різних видів лістерій. Склад: грам/дм3 Протеозопептон Натрію хлорид М'ясний екстракт Бромкрезоловий пурпуровий Кінцеве значення рН при 250С 6 8 ± 0 2 10 00 5 00 1 00 0 10 Приготування. Розмішати 16 1 г порошку в 990 см3 дистильованої води. Нагрівати при необхідності до повного розчинення компонентів середовища. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Асептично додати 10 см3 стерильного розчину відповідного вуглеводу до кінцевої концентрації 0 5%. Добре перемішати і розлити у пробірки. Готове середовище має пурпуровий колір прозоре не має преципітату. Принцип і оцінка результату. Бульйон для визначення цукролітичної активності використовується для культивування і диференціації лістерій різних видів. Відповідно до рекомендацій FDA і Комітету ISO він має низьку концентрацію бромкрезолового пурпурного. Диференціація лістерій заснована на здатності ферментувати глюкозу дульцит рамнозу рафінозу і саліцин. Пептон і м'ясний екстракт є джерелами вуглецю і азоту включаючи незамінні амінокислоти вітаміни і мікроелементи необхідні для метаболізму бактерій. Бромкрезоловий пурпуровий служить індикатором кислотності середовища і при її закисленні жовтіє. Основа бульйону з бромкрезоловим пурпурним для лістерій – Purple Broth Base M284D Рекомендовано Комітетом ISO для вивчення ферментації цукрів чистими культурами Listeria. Склад: грам/дм3 Протеозопептон Яловичий екстракт Натрію хлорид Бромкрезоловий пурпуровий Кінцеве значення рН при 250С 6 8 ± 0 2 10 00 1 00 5 00 0 02 Приготування. Розмішати 16 г порошку в 1000 см3 дистильованої води. Додати 5-10 г певного вуглеводу і стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 121°С протягом 15 хв. Можливий альтернативний спосіб приготування середовища: до 900 см3 основи бульйону додають 100 см3 5-10% розчину вуглеводу. При стерилізації вуглеводів автоклавуванням слід дотримуватися обережності щоб не допустити гідролізу вуглеводів. Готове середовище має пурпурове забарвлення. Принцип і оцінка результату: Індикатором ферментації вуглеводів служить бромкрезоловий пурпуровий який при закисленні середовища забарвлює його в жовтий колір. Утворення газу констатують за появою пухирців в поплавцях. В бульйон засівають добову чисту культуру лістерій і інкубують протягом 24-72 годин до 7 днів якщо буде потрібно при 35°С. Концентрація вуглеводів що рекомендується - 1%. Основа кров'яного агару - Blood Agar Base М073 Склад: грам/дм3 Настій яловичого серця Триптоза Натрію хлорид Агар-агар Кінцеве значення рН при 250С 500 00 10 00 5 00 15 00 7 3 ± 0 2 Приготування. Розмішати 40 0 г порошку в 1000 см3 дистильованої води. Прокип'ятити для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1 1 атм 1210С протягом 15 хв. Охолодити до 500С і асептично внести до 5% стерильної дефібринованої крові. Ретельно перемішати і розлити середовище в чашки Петрі. Основа середовища має світло-бурштинове забарвлення прозора або з легкою опалесценцією при затвердінні. Після додавання крові середовище повинне мати вишнево-червоний колір з легкою опалесценцією. Принцип і оцінка результату. Це середовище з настоєм серця використовують як основу для приготування кров'яного агару для визначення гемолітичних реакцій. Основа високопоживна і може використовуватись без додавання крові як середовище загального призначення. Заступник Головного державного санітарного лікаря України Л.М. Мухарська МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ НАКАЗ N 559 11.08.2006 м.Київ Про затвердження методичних вказівок „Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині" Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення" НАКАЗУЮ: 1. Затвердити рекомендовані Комітетом з питань гігієнічного регламентування Міністерства охорони здоров'я України методичні вказівки "Організація контролю і методи виявлення бактерій Listeria monocytogenes у харчових продуктах та продовольчій сировині" далі - методичні вказівки що додаються. 2. Департаменту державного санепіднагляду Міністерства охорони здоров'я України довести методичні вказівки до установ та закладів державної санітарно-епідеміологічної служби міністерств та інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку. 3. Контроль за виконанням цього наказу покласти на Директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України Пономаренка А. М. Перший заступник Міністра Головний державний санітарний лікар України С.П.Бережнов 5