МП 9.1.2.10.2.1-149-2007

МП 9.1.2.10.2.1-149-2007 Епідеміологія, лабораторна діагностика та профілактика легіонельозу. Методичні рекомендації

ЗАТВЕРДЖЕНО наказом МОЗ України від 8 серпня 2007 р. N 463 Методичні рекомендації "Епідеміологія лабораторна діагностика та профілактика легіонельозу" Методичні рекомендації призначені для лікарів-епідеміологів лікарів-інфекціоністів лікарів-бактеріологів лікарів-терапевтів лікарів інших спеціальностей. Методичні рекомендації розроблені відповідно до існуючих положень з епідеміології діагностики та профілактики легіонельозу з урахуванням сучасних досягнень та нових відомостей. Вперше запропоновано проведення протиепідемічних заходів з метою своєчасного виявлення можливого формування резервуару збудників легіонельозу у водяних системах замкнутих циклів водокористування дано рекомендації щодо термінів технічного обслуговування систем кондиціонування та охолодження. Відповідно до стандартів епіднагляду рекомендованих ВООЗ пропонуються критерії лабораторної діагностики та методики їх проведення. Рекомендовано застосовувати бактеріологічний та біологічний методи діагностики у бактеріологічних лабораторіях що мають дозвіл на роботу з мікроорганізмами II групи патогенності серологічні методи діагностики спрямовані на виявлення специфічних антитіл до збудника легіонельозу - у бактеріологічних лабораторіях що мають дозвіл на роботу з мікроорганізмами III групи патогенності. 1. Епідеміологія легіонельозу Легіонельоз - гостре інфекційне захворювання яке характеризується високим показником летальності - до 40 %. Назва хвороби походить від спалаху невідомого гострого респіраторного захворювання що виник у 1976 році серед учасників конгресу організації Американський легіон штат Філадельфія . Захворіло 221 5 % з 4500 присутніх померло 34 особи 15 2 % . Легіонельоз реєструється у всіх країнах світу. У 1993 році в Європі захворювання було виявлено у 19 у 1998 році - у 28 країнах. У США в період з 1976 по 2004 рік зареєстровано 12 спалахів легіонельозу з 582 випадками захворювань з яких 40 6 82 % закінчились летально. Відповідно до інформації Американської адміністрації професійної безпеки і здоров'я щороку близько 100 тис. випадків респіраторних захворювань що реєструються у країні викликані легіонелами. За даними ВООЗ понад 25 % випадків легіонельозу пов'язані з перебуванням у готелях та транспорті під час міжнародних туристичних подорожей тому виявлення джерела інфікування у кожному з випадків є проблематичним. Результати епідеміологічного розслідування спалахів і спорадичних випадків легіонельозу зареєстрованих на суднах Чорноморського пароплавства України у 1986 - 1991 роках Ахтирському заводі "Сільгоспмаш" Сумської області у 1990 році сімейний спалах легіонельозу в Одесі у 2001 році підтверджують що виникнення захворювання зумовлене використанням у промисловості і побуті систем рециркуляторного типу які використовувались як джерела водяного аерозолю. Етіологія. Збудник легіонельозу відноситься до грам-негативних бактерій родини Legionellaceae з характерними морфологічними біохімічними і генетичними ознаками які відрізняють його від раніше відомих патогенних і непатогенних бактерій. Родина Legionellaceae складається тільки з одного роду Legionella що утворює генетично споріднену таксономічну структуру. Відомо 42 види легіонел епідемічне значення має вид L. pneumophila що включає 16 серогруп. Більшість випадків легіонельозу пов'язані з 1 4 і 6 серогрупами L. pneumophila. Екологія. Легіонели розмножуються і накопичуються у природних і штучних водоймищах із різноманітними фізичними хімічними і біологічними характеристиками у т. ч. широким діапазоном температури води від 5 7 до 63° pH - 5 5 - 8 1 та концентрацією хлорофілу 0 7 - 2 4 г/м3. Легіонели є симбіонтами фотосинтезуючих синьо-зелених водоростей Fisherella Oscillatorium що значно підвищує їхню стійкість та сприяє аерозольному поширенню збудника. В асоціаціях із синьо-зеленими водоростями легіонели можуть розповсюджуватися при розпиленні на відстань до 30 - 50 км. Внутрішньоклітинне паразитування легіонел у найпростіших ґрунтових і водяних амебах роду Acanthamoela Naeglaria джгутикових створює сприятливі умови для розмноження збудника у природних і штучних екосистемах. Амеби що містять легіонели перешкоджають швидкій дегідратації збудника і забезпечують високу інфікуючу дозу бактеріального агенту одна амебна клітина може містити понад 1000 легіонел . При несприятливих умовах легіонели можуть тривалий час зберігатися в цистах амеб що захищає їх від дії високих концентрацій дезінфекційних засобів. У джерелах господарсько-побутового водопостачання частота виявлення легіонел складає 3 68 ± 2 89 %. За даними різних авторів легіонели можуть зберігатися у рідинах при температурі 25° C до 112 днів при 4° C - 150 днів. Кількість легіонел значно зростає при підвищенні температури води до 36° C. Оптимальні умови для існування та розмноження легіонел є у водяних системах де постійно підтримується температура 40 - 55° C. Виявлено контамінацію легіонелами штучних екосистем що знаходяться на промислових і комунальних об'єктах механічні вугільні фільтри накопичувальні резервуари води питні титани оборотні реформінги градирні системи вентиляції та кондиціонування повітря фонтани басейни душові . Високі показники заселення легіонелами води зареєстровано на підприємствах у технологічний цикл яких входять системи рециркуляторного типу 12 68 ± 7 74 % що свідчить про їхню значну потенційну епідемічну небезпеку. Рівень колонізації поверхонь різного санітарно-технічного устаткування залежить від виду матеріалу. Концентрація легіонел у воді що містить гуму і тефлон зростає на декілька порядків. У меншій мірі мікробній колонізації піддаються мідні силіконові та сталеві поверхні. Чутливість легіонел до дезінфекційних та антисептичних препаратів у бактеріальних суспензіях не відрізняється від більшості неспорових форм бактерій. Збудник легіонельозу швидко інактивується під впливом 70° спирту 1 % розчину формаліну розчину амонію 1:8000 хлорнуватистої кислоти 2 5 частини на 1 млн. глутарового альдегіду 0 125 % . Однак структура біоплівки в штучних екосистемах де знаходяться легіонели забезпечує бактеріям підвищену стійкість до несприятливих умов та обумовлює їх високу життєздатність. Механізм шляхи і фактори передачі інфекції Зараження людини відбувається при вдиханні контамінованого легіонелами дрібнодисперсного водного аерозолю що утворюється в процесі роботи різноманітних технічних систем куди легіонели потрапляють із природних екосистем. Шляхи передачі легіонел - повітряно-пиловий та повітряно-крапельний. Факторами передачі легіонел може бути повітря пил дрібнодисперсний мікробний аерозоль що утворюється при експлуатації водяних систем. При аналізі причин захворюваності встановлено що хвороба легіонерів легіонельозна пневмонія розвивається у 5 - 10 % осіб які знаходилися в зоні дії контамінованого легіонелами аерозолю. Гарячка Понтіак гостре респіраторне захворювання легіонельозної природи уражає 80 - 100 % таких осіб. Високий ризик зараження є у персоналу який здійснює технічне обслуговування та ремонт водяних систем охолодження і кондиціювання. При порушенні правил експлуатації устаткування його несправності та наявності сприятливих умов для розповсюдження контамінованого мікробного аерозолю зараженню можуть піддаватися інші групи населення. Сприйнятливі до інфекції частіше особи літнього віку та діти. Факторами ризику є різні імунодефіцитні стани та порушення клітинного імунітету внаслідок тривалого застосування імунодепресантів. У відділеннях онкології та трансплантації при контамінації легіонелами водяних систем частота легіонельозу в етіологічній структурі нозокоміальних пневмоній складає 15 - 20 % а летальність - понад 30 %. Людина є біологічним тупиком для збудника. Фактів передачі збудника від людини до людини не доведено. Безсимптомні форми інфекції часто супроводжуються виробленням антитіл. У тварин птахів та членистоногих наявність інфекції у природних умовах не встановлено. Випадки виявлення специфічних антитіл у сироватках крові коней великої рогатої худоби свиней овець ослів мавп та собак не дають можливості припустити участь цих видів у циркуляції легіонел. Клініка легіонельозу. Легіонели при попаданні в організм людини аспіраційним шляхом пошкоджують різні відділи респіраторного тракту частіше нижні бронхіоли і альвеоли. Інкубаційний період легіонельозу становить від 2 до 10 діб в середньому 5 - 7 . Легкі форми перебігу схожі на респіраторну вірусну інфекцію з короткочасною гарячкою до 2 - 5 діб кашлем сухістю та болем у горлі. Легіонельозна пневмонія як правило починається гостро з швидкого підвищення температури тіла до 39 - 40° C з'являється біль у грудній клітці кашель спочатку сухий далі - зі слизисто-кров'яним мокротинням . Швидко наростає задишка з появою ціанозу губ та кінчиків пальців рук хворі приймають вимушене сидяче положення. Розвивається пневмонія і інфекційно-токсичний шок з прогресуючою серцево-судинною і легеневою недостатністю. Перебіг захворювання може бути як гостре респіраторне захворювання без пневмонії гарячка Понтіак і власне "хвороби легіонерів" - тяжкої легіонельозної пневмонії. Діагноз легіонельозу встановлюється на підставі клінічних ознак даних епідеміологічного анамнезу та підтверджується результатами лабораторного дослідження. Враховують факти перебування хворого за 2 тижні до початку захворювання в умовах можливого інфікування готелі транспорті стаціонарі та професійну діяльність. Відповідно до стандартів епіднагляду рекомендованих ВООЗ пропонується при визначенні випадку захворювання враховувати рекомендований клінічний опис як "хвороба що характеризується гострою інфекцією нижніх дихальних шляхів з виявленими при клінічному обстеженні вогнищами пневмонії і/або рентгенологічними ознаками пневмонії". ВООЗ рекомендує враховувати підозрілі та достовірні лабораторні критерії діагностики. Підозрілі лабораторні критерії діагностики - це результати лабораторних досліджень що виявили один або декілька позитивних результатів: - специфічні антигени легіонел в виділеннях респіраторних органів або сечі - збудник легіонельозу з допомогою прямого методу флюоресцентних антитіл МФА в виділеннях респіраторних органів або в легеневій тканині з використанням стандартних моноклональних реагентів - чотирьохкратне і більше зростання титрів специфічних антитіл до легіонел у сироватці крові крім L. pneumophilla серогрупи I при використанні серологічного тесту придатного до використання в даній місцевості. Достовірні лабораторні критерії діагностики - це результати лабораторних досліджень що виявили один або декілька позитивних результатів: - ідентифікацію легіонел із виділень респіраторних органів легеневої тканини плевральної рідини або крові - чотирьохкратне і більше зростання титрів специфічних антитіл до L. pneumophilla серогрупи I при застосуванні непрямої реакції імунофлюоресценції або реакції мікроаглютинації. У більшості європейських країн підтверджуючим тестом є виявлення антигену L. pneumophilla серогрупи I у сечі. Класифікація випадків захворювань легіонельозу рекомендована ВООЗ: Можливий випадок - це випадок що відповідає клінічному опису при наявності підозрілих лабораторних даних. Підтверджений випадок - це випадок що відповідає клінічному опису при наявності достовірних лабораторних даних. 2. Організація епідеміологічного нагляду та аналіз захворюваності на легіонельоз Кожен випадок захворювання на легіонельоз підлягає терміновому епідеміологічному обстеженню з метою визначення джерела факторів передачі інфекції та активного виявлення нових випадків. Епідеміологічне обстеження проводиться лікарями-епідеміологами разом з фахівцями гігієнічного профілю заповнюється карта епідеміологічного обстеження вогнища легіонельозу додається . З метою своєчасного виявлення хворих на легіонельозного попередження масових епідемічних ускладнень необхідно проводити помісячний аналіз захворюваності на ГРЗ та пневмонії населення враховуючи території пори року розподіл випадків по віку професії статі визначення вогнищевості.  При зростанні рівня захворюваності на пневмонії серед окремих верств населення проводять детальний аналіз з метою визначення спільних для хворих факторів передачі та джерела інфекції. При підтвердженні наявності в анамнезі фактів знаходження хворих у місцях дії водних дрібнодисперсних аерозолів проводять відбір зразків з довкілля та лабораторне дослідження. Профілактичні заходи спрямовані на зниження рівня контамінації легіонелами водяних штучних екосистем закритих систем кондиціонування та охолодження попередження розмноження легіонел у водяних штучних екосистемах попередження розбризкуванню води і утворення аерозолів із закритих водяних систем. Зниження рівня контамінації штучних екосистем проводиться шляхом дезінфекції водних резервуарів та інших ємкостей води що входять до цих систем. Для знезараження систем опалення водопостачання чи інших систем циркуляції воду нагрівають до температури понад 80° C протягом доби. З цією метою можна застосовувати сполуки активного хлору що забезпечують концентрацію залишкового хлору 1 - 3 мг/л або інші дозволені до використання дезінфекційні засоби. При необхідності скорочення часу хлорування концентрацію активного хлору можна збільшити до 20 - 50 мг/л. Знезараження промислових та побутових водних резервуарів градирнів ставків систем зворотного водопостачання можна проводити дозами вільного хлору 0 7 - 1 0 мг/л по 1 годині щоденно або з концентрацією 2 - 3 мг/л на протязі 24 - 48 годин. При виявленні легіонел у системах необхідно щокварталу проводити дезінфекційні заходи з подальшим бактеріологічним дослідженням проб води. Необхідно пам'ятати що можливе повторне забруднення легіонелами водних систем. Тому профілактичні заходи повинні забезпечити підтримання їх концентрації на безпечному для зараження рівні - не більше 103 КОО/л. Попередження розмноження легіонел у штучних екосистемах може бути досягнуте шляхом належного технічного обслуговування систем кондиціонування. Більшість стояків що використовують у промислових системах кондиціонування і охолодження функціонують при параметрах температури води які є оптимальними для розмноження легіонел 20 - 45° C . Тому регулярне очищення від мулистих осадів шумовиння слизу шлаків органічних відкладень та інших домішок з наступною дезінфекцію усіх ділянок водяних систем біоцидними препаратами що запобігають розмноженню легіонел є обов'язковим. Попередження розбризкування води та утворення аерозолів із замкнутих водяних систем досягається шляхом усунення технічних поломок ліквідації тріщин у ємкостях і трубопроводах герметизація стиків ремонт регулюючих та контролюючих приладів технічної ізоляції . Для цього необхідно здійснювати постійний нагляд за їх станом. 3. Організація моніторингу на об'єктах високого ризику накопичення та поширення легіонел Необхідно здійснювати поточний санітарно-гігієнічний нагляд з метою своєчасного виявлення можливого формування резервуару збудників легіонельозу у водяних системах замкнутих циклів водокористування при експлуатації яких утворюється дрібнодисперсний водяний аерозоль кондиціонери повітря та промислові охолоджувальні системи; системи гарячого і холодного водопостачання у тому числі душові; спреєві зволожувачі очищувачі повітря водолікарні джакузі та ін. . Кожна система кондиціонування та охолодження повинна мати паспорт з описом принципу дії установки характеру технологічного процесу продуктивності схеми установки з розводящими мережами та графік технічного огляду очищення і дезинфекції водяної системи. Терміни технічного обслуговування систем кондиціонування та охолодження рекомендовані ВООЗ Найменування елементів системи кондиціонування охолодження Мета заходу Періодичність проведення Стояки водяного охолодження випарні конденсатори що розводять конденсаторні водяні мережі підживлюючі ємкості Моніторинг якості води в охолоджувальних системах і використаних засобів Щомісячно Технічний огляд і регулювання приладів керування калібрування сенсорів провідності функції продувки рівномірності розподілу води стану імерсійних нагрівачів вентиляторів і атенюаторів звуку. Кожні 1 - 3 місяці Очищення від мулистих осадів видалення шумовиння і дезінфекція. 1 разу 6 місяців Системи гарячого водопостачання Перевірка температур прямого і зворотного потоків від калориферів. 1 раз на місяць Візуальний огляд технічної ізоляції внутрішніх поверхонь калориферів для виявлення шумовиння і мулистих відкладень. Усунення виявлених недоліків при їх виявленні. 1 раз у рік Системи забезпечення холодною водою Візуальний огляд ємкостей для збереження холодної води перевірка термічної ізоляції виправлення несправностей. 1 раз у рік Душові насадки Розбирання та очищення від шумовиння 1 раз у три місяці Спреєві зволожувачі і повітроочисники Очищення видалення шумовиння дезінфекція 1 раз у 6 місяців 4. Лабораторна діагностика легіонельозу Лабораторну діагностику легіонельозу проводять наступними методами: 1 серологічний з визначенням рівня специфічних антитіл розчинного антигену легіонел у сечі та виявлення легіонел у клінічному і секційному матеріалах; 2 бактеріологічний з виділенням культури збудника - "золотий стандарт"; 3 біологічний з використанням біопробних тварин; 4 молекулярної діагностики з виявленням збудника у клінічному матеріалі за допомогою зондів чи ПЛР. Серологічні дослідження проводяться у лабораторіях що мають право на роботу зі збудниками III - IV груп патогенності. Бактеріологічні та біологічні методи дослідження застосовуються в лабораторіях що мають право на роботу зі збудниками II групи патогенності. Матеріал що підлягає дослідженню. У хворих підозрілих на легіонельоз для лабораторного дослідження відбирають: Матеріал Терміни відбору Кров Парні сироватки: на 5 - 7 день від початку захворювання і далі - на 14 - 21 день Мокротиння При наявності продуктивного кашлю до 10-го дня захворювання Бронхіальні змиви На будь-якому етапі бажано до початку вживання антибіотиків Плевральний ексудат При наявності плеврального випоту Від померлих беруть зразки змінених тканин легень печінки селезінки. Серологічні методи діагностики Реакція непрямої імунофлюоресценції РНІФ що визначає рівень антитіл у сироватці крові найбільш розповсюджений метод лабораторної діагностики який використовується для підтвердження клінічного діагнозу та вивчення імунного прошарку населення. Методика відбору матеріалу. Для одержання сироватки кров беруть з ліктьової вени в кількості 3 - 4 мл. Пробірці відразу надається похиле положення для відшарування кров'яного згустку 15 - 20 хвилин . Можна помістити пробірки у вертикальному положенні на 1 годину в термостат при 37° C. Після цього обводять кров'яний згусток скляною паличкою чи запаяною пастерівською піпеткою і поміщають пробірку на кілька годин у холодильник. Відстояну сироватку переносять в іншу пробірку розводять фосфатно-сольовим буфером pH 7 2 у співвідношенні 1:10 і інактивують на водяній бані при 56° C 30 хвилин. При необхідності збереження сироваток їх запаюють в ампули і поміщають у холодильник. Для запобігання проростання після інактивації до сироватки можна додати до 2 % сухої борної кислоти. Бажано досліджувати парні сироватки крові на 5 - 7 день від початку захворювання і на 14 - 21 день. Техніка постановки. 1 На знежирене предметне скло наносять 3 краплі легіонельозного антигену чи культуру штаму Legionella pneumophila Philadelphia I убиту кип'ятінням; 2 підсушують і фіксують 20 хвилин у ацетоні чи у 96° спирті 20 хвилин після чого підсушують на повітрі; 3 досліджувану сироватку наносять на мазки з легіонельозним антигеном у розведеннях 1:32 1:64 1:128. Поміщають препарат у вологу камеру чашку Петрі зі зволоженим фільтрувальним папером на дні ; 4 інкубують препарат у вологій камері в термостаті при 37° C 30 хвилин; 5 промивають препарат у забуференому фізіологічному розчині pH 7 2 двічі по 5 хвилин чи 5 хвилин під проточною водопровідною водою так щоб струмінь води не попадав безпосередньо на мазок обполіскують дистильованою водою і підсушують на повітрі; 6 наносять на препарат у вологій камері люмінесцентну сироватку проти глобулінів людини в робочому розведенні зазначеному на ампулі; 7 інкубують препарат у вологій камері в термостаті при 37° C 30 хвилин; 8 промивають препарат див. п. 5 підсушують на повітрі. Для гасіння неспецифічного світіння рекомендується зафарбувати препарат методом контрастування. З цією метою на мазки замість люмінесцентної сироватки проти глобулінів людини наносять суміш що складається з цієї сироватки і бичачого альбуміну міченого родаміном. При цьому обидва препарати попередньо розводять до титру зазначеного на ампулах і змішують у рівних обсягах. Подальшу обробку мазків проводять по описаній вище методиці. Облік і оцінка реакції. Мікроскопію проводять у падаючому світлі люмінесцентного мікроскопа імерсійний об'єктив 90 х 1 25 і окуляр х 7 . Перед переглядом на препарат наносять краплю забуференого гліцерину 9 частин гліцерину і 1 частина забуференого фізіологічного розчину чи нефлюоресцентної імерсійної олії. У позитивних випадках коли досліджувана сироватка містить специфічні антитіла до збудника легіонельозу на темному тлі при використанні бичачого альбуміну міченого родаміном - на цегляно-червоному тлі відзначається специфічне яскраве зелено-жовте світіння бактерій . Для оцінки інтенсивності світіння використовують чотирьоххрестову систему: ++++ - яскраве смарагдово-зелене світіння переважно по периферії бактеріальної клітки; +++ - помірне смарагдово-зелене світіння периферії клітки; ++ - слабке зелено-жовте світіння всієї клітки; + - ледь помітне жовто-зелене світіння всієї клітки. Специфічною вважають люмінесценцію на ++++ та +++. Титр антитіл відповідає останньому розведенню сироватки що забезпечує бактеріальній клітині специфічне світіння на ++++ та +++. При дослідженні парних сироваток діагностичним вважається 4-кратне і вище наростання титру антитіл. При дослідженні поодиноких сироваток діагностичний титр специфічних легіонельозних антитіл повинен бути не нижче 1:128. Реакція об'ємної агломерації РАО застосовується для виявлення специфічних антитіл до L. pneumophila Philadelphia I. не потребує спеціального устаткування і додаткової підготовки персоналу що дає можливість її широкого впровадження в практику. До набору інгредієнтів входять: сироватка нормальна кроляча суха НКС ; сироватка контрольна легіонельозна кроляча суха; розчин натрію хлориду 0 9 %; планшет для імунологічних реакцій однократного застосування. Діагностикум легіонельозний серогрупи 1 антигенний полімерний виробник препарату - Ростовський протичумний інститут що являє собою 0 15 % суміш полімерних мікрочастинок сферичної форми ковалентно зв'язаних з антигеном отриманим дезінтеграцією бактеріальної маси L. pneumophila Philadelphia I. Діагностикум має вигляд пористої гігроскопічної маси бузкувато-рожевого кольору. Приготування інгредієнтів для РАО: - вміст флакона із сухим НКС 1:10 розчиняють у 5 мл 0 9 % розчину натрію хлориду pH 7.0 - 7.2 . Приготовлений розчин НКС 1:100 можна зберігати при температурі 6 ± 2° C 3 - 5 днів; - вміст флакона із сухою контрольною легіонельозною кролячою сироваткою розчиняють у 0 2 мл 0 9 % розчину натрію хлориду p 7 0 - 7 2 до розведення 1:10; - вміст флакона з 0 15 % діагностикумом ресуспензують у 4 мл 0 9 % розчину натрію хлориду. Розведений діагностикум при необхідності зберігають при температурі 6 ± 2° C 3 - 5 днів. Розчин натрію хлориду 0 9 % використовують для розведення сухих інгредієнтів для РАО в день проведення реакцій. Досліджувані сироватки одержують і готують для дослідження відповідно до п. 1.1. Техніка постановки: 1 в "U" - подібні лунки планшета для імунологічних реакцій наливають по 50 мкл 1 % розчину НКС; 2 досліджувану сироватку в кількості 50 мкл вносять у першу лунку піпеткою-дозатором і дворазово титрують до розведень: 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560. З останньої лунки 50 мкл видаляють; в усі лунки додають по 1 краплі 25 мкл діагностикуму в робочому розведенні; 3 після додавання діагностикуму вміст лунок змішують погойдуванням планшета протягом 1 хв. і залишають при температурі 20 ± 2° на 1 5 - 2 години. Для контролю діагностикуму на відсутність спонтанної агломерації в 2 - 3 лунки вносять по 25 мкл НКС і діагностикуму в робочому розведенні. Облік і оцінка реакції. За позитивний результат приймають кольоровий яскраво-рожевий агломерат що вистилає все дно лунок рівномірним шаром чи агломерат з чітко обкресленими краями що займає не менш 2/3 сферичної поверхні. У негативних випадках і в контролі утвориться компактне кільце чи "крапка" у центрі лунки. За діагностичний приймається титр не нижче ніж 1:80. Реакція прямої імунофлюоресценції застосовується як експрес-метод для виявлення збудника в клінічному матеріалі. Техніка постановки: 1 на знежирене предметне скло наносять краплю досліджуваного матеріалу і готують тонкий мазок. При дослідженні секційного матеріалу роблять мазки - відбитки тканин; 2 підсушують мазок і фіксують 20 хвилин у ацетоні чи 96° спирті після чого знову підсушують на повітрі; 3 поміщають фіксований мазок у вологу камеру чашку Петрі зі зволоженим фільтрувальним папером на дні і наносять на препарат легіонельозну люмінесціюючу сироватку в робочому розведенні зазначеному на ампулі; 4 інкубують препарат у вологій камері в термостаті при 37° C 20 хвилин; 5 промивають препарат у забуференому фізіологічному розчині pH 7 2 двічі по 5 хвилин чи 5 хвилин під проточною водопровідною водою так щоб струмінь води не попадав безпосередньо на мазок обполіскують дистильованою водою і підсушують на повітрі. Як позитивний контроль можна готувати мазок із суспензії легіонел у забуференому фізіологічному розчині концентрацією 5 х 108 КОО/мл або використовувати позитивний контроль що входить у комерційні діагностичні набори. Облік реакції. Мікроскопію проводять у падаючому світлі люмінесцентного мікроскопу імерсійний об'єктив 90 х 1 25 і окуляр х 7 . Перед переглядом на препарат наносять краплю забуференого гліцерину 9 частин гліцерину і 1 частина забуференого фізіологічного розчину чи нефлюоресцентної імерсійної олії. Для запобігання швидкого вицвітання мазка бажано переглядати препарати з використанням камери. Для цього безпосередньо на мазок перед переглядом наносять краплю нелюмінесцентного імерсійного середовища і накривають покривним склом. Потім на покривне скло наносять краплю цього ж іммерсійного середовища після чого препарат готовий до перегляду. У позитивних випадках виявляють специфічне смарагдово-зелене світіння легіонел. Для оцінки інтенсивності світіння використовують чотирьоххрестову систему п. 4.4 . Виявлення в кожному полі зору хоча б 3 - 5 бактеріальних клітин зі специфічним світінням з яскравістю ++++ і +++ свідчить про наявність легіонел у досліджуваному матеріалі.  Бактеріологічний метод діагностики Забір матеріалу для дослідження краще проводити до початку антибактеріальної терапії. Для виділення і культивування збудника легіонельозу використовують спеціальні середовища що містять L-цистеїн і Fe++. На звичайних поживних середовищах легіонели не ростуть. Відбір матеріалу і підготовка проб для дослідження. Мокротиння бронхіальні змиви плевральний ексудат відбирають у хворих до 10 дня хвороби у кількості 1 - 5 мл. Від померлих беруть зразки патологічно змінених тканин легені печінка селезінка . Проби поміщають у стерильний скляний посуд що не містить слідів дезінфікуючих засобів закривають гумовими корками і пергаментним папером чи целофаном та укладають у металеві бікси. Доставку в лабораторію здійснюють службовим транспортом. Малоконтамінований матеріал бронхіальні змиви плевральний ексудат засівають як рідини. Для розведення використовують 0 07 N калій-фосфатний буфер. При дослідженні мокротиння необхідно розмежувати ріст сторонньої мікрофлори що ускладнює виділення культури легіонел. Для пригнічення росту сторонньої мікрофлори матеріал можна засівати на поживні середовища з додаванням антибіотиків які не впливають або слабко впливають на ріст легіонел наприклад 4 мкг/мл цефамандола або 0 5 мкг/мл ванкоміцину і 8 мкг/мл анизоміцину . До деяких комерційних середовищ додаються відповідні набори антибіотиків. Для деконтамінації можна також використовувати прогрівання досліджуваної проби на водяній бані при температурі 50° C протягом 30 хвилин чи 5-хвилинну кислотну обробку 0 1 N розчином HCl-KCl буфера pH 2 2 при кімнатній температурі. При дослідженні секційного матеріалу зразки тканини масою близько 1 г розтирають у стерильній ступці і готують 10 % суспензію в калійфосфатному буфері. Приготовлену суспензію розводять 1:50 і засівають на поживні середовища. Посів на поживні середовища. Матеріал шпателем розподіляють по поверхні поживного середовища. Посіви культивують при температурі 35° C протягом 10 діб з щоденним переглядом починаючи з 3-ої доби. Для зволоження повітря в термостат поміщають відкриту ємкість з водою. Ріст основної маси колоній при дослідженні клінічного матеріалу звичайно фіксують через 3 - 5 доби але можлива затримка росту до 8 - 9 доби. Частіше це стосується проб з попередньою обробкою для розмежування сторонньої мікрофлори. Первинний ріст має вигляд дрібних колоній що через 24 - 48 годин досягають діаметру 1 - 2 мм. Перегляд посівів і добір підозрілих колоній рекомендується проводити під стереомікроскопом 12 5 х 2 . У косопадаючому світлі колонії легіонел мають малахітово-зеленуватий чи червонясто-сіруватий відтінок із мармуроподібною смуглястістю. Біологічний метод Для виділення збудника легіонельозу можна використовувати біологічну пробу. У якості біопробних тварин використовують морських свинок вагою 250 - 300 г. Досліджуваний матеріал вводять внутрішньочеревно. Тварини занедужують і гинуть від легіонельозної інфекції при наявності в ньому 103 - 104 клітин легіонел. Через 12 - 48 годин у морських свинок відзначають підйом температури до 39 5 - 41° C прострацію іноді ураження очей. При масивній заразній дозі морські свинки гинуть на 3 - 4 добу при меншій інфікованості загибель настає на 5 - 8 добу. За біопробними тваринами спостерігають 10 діб. У більшості випадків при розтині загиблих тварин виявляють характерні патолого-анатомічні зміни. Печінка і селезінка збільшені їх капсули покриті фібринозним нальотом. Тканина селезінки має дрібні вогнища некрозу. Відзначають перитоніт зі скудним фібринозним ексудатом та різку гіперемію очеревини. Характерний розвиток пневмонії без різко вираженого інфільтративного запального процесу набряку і десквамації мезотелію плеври. Після опису патологічних змін внутрішніх органів на 2-х предметних склах роблять мазки-відбитки з легень і селезінки фіксують протягом 1 години в 96° етиловому спирті чи ацетоні. Фарбують препарати по Романовському-Гімза і специфічною люмінесцентною сироваткою. Як правило у мазках виявляють значну кількість легіонел. Із зразків селезінки і легень готують 10 % суспензію в калій-фосфатному буфері і засівають на середовище для культивування легіонел. Ріст культури може з'явитися через 48 - 72 години. Якщо при мікроскопії мазків-відбитків відзначають поодинокі клітини збудника в полі зору посів на поживні середовища може бути негативним. Попередня ідентифікація виділених культур При виявленні на спеціальних поживних середовищах підозрілих колоній їх паралельно засівають на чашку із аналогічним середовищем призначеним для культивування легіонел і на звичайний агар МЛА кров'яний агар і т. д. - "тест росту". Для легіонел характерна наявність росту у другому пасажі на спеціальному середовищі для легіонел і відсутність росту на контрольному середовищі термін спостереження не менш 5 діб . Первинну ідентифікацію для підтвердження виділення культури роду Legionella spp. проводять на підставі термінів появи первинних колоній їхньої морфології і результатів "тесту росту" морфології бактерій при фарбуванні по Граму грамнегативні палички довжиною від 2 - 3 до 10 мк . Остаточну ідентифікацію проводять у референс-лабораторії.   Директор Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду    А. М. Пономаренко    Додаток до розділу 2 Методичних рекомендацій "Епідеміологія лабораторна діагностика та профілактика легіонельозу" Карта епідеміологічного обстеження вогнища легіонельозу 1. П. І. Б. 2. Стать чоловік жін. 3. Домашня адреса: вул. будинок N корп. N кв. N 4. Місце проживання: вул. будинок N корп. N кв. N 5. Місце роботи: 6. Професія: 7. Діагноз: ГРЗ пневмонія ін. гостра легенева патологія із приводу яких звертався за медичною допомогою протягом останнього року : дата захворювання дата і місце звернення діагноз дата і місце госпіталізації попередній остаточний 9. Клінічний перебіг захворювання: 9.1 початок захворювання гостре підгостре і т. д. ; 9.2 основні симптоми в перші дні хвороби; 9.3 важкість перебігу. 10. Застосування антибіотиків: 10.1 найменування препарату: 10.2 дата початку лікування даним препаратом: 10.3 тривалість лікування: 10.4 доза препарату: 11. Діагноз підтверджений:   вид дослідження дата результат 1. клінічно         2. лабораторно 1 бактеріологічний     2. мікроскопічний     3. серологічний     4. біохімічний     Іншими методами          12. Обставини та умови в яких знаходився хворий у межах можливого терміну зараження:  12.1 Участь у будівельних і сільськогосподарських роботах дата проведення вид виконуваних робіт місце проведення . 12.2 Відрядження подорожі приватні поїздки протягом місяця до початку захворювання дата виїзду тривалість поїздки яким видом транспорту місце та умови тимчасового проживання . 12.3 Перебування у стаціонарі дата надходження тривалість перебування одержані процедури маніпуляції: інгаляції оперативні втручання інтубаційний наркоз водяні процедури та ін. . 12.4. Вид професійної діяльності хворого: 12.4.1 найменування об'єкта структурного підрозділу у якому працює хворий; 12.4.2 загальна кількість працюючих у т. ч. у структурному підрозділі; 12.4.3 захворюваність ГРЗ та пневмоніями на підприємстві в установі в абсолютних цифрах: - загальна кількість захворілих протягом року; - загальна кількість захворілих із травня по жовтень; 12.4.4 захворюваність ГРЗ та пневмоніями у структурному підрозділі: - загальна кількість захворілих протягом року; - загальна кількість захворілих із травня по жовтень; 12.4.5 місцеперебування на робочому місці кабінет цех та ін. робота поза приміщенням і його характеристика; 12.4.6 наявність на робочому місці кондиціонерів локальних системних ; 12.4.7 наявність і використання питних фонтанчиків душових установок басейнів накопичувальних баків та ін. і джерело їхнього водозабору; 12.4.8 характеристика системи вентиляції; 12.5 Вид робіт що виконуються 12.5.1 обслуговування градирень промислових кондиціонерів і інших промислових об'єктів технологічні умови яких можуть сприяти утворенню дрібнодисперсного аерозолю землевпорядні роботи; 12.6 Можливі джерела та фактори що сприяють передачі інфекції у побуті: 12.6.1 житлові умови окрема квартира приватний будинок кімната у загальній квартирі гуртожиток готель та ін. ; 12.6.2 джерела водокористування водопровід колонка колодязь загальний приватний відкрита водойма та ін. ; 12.6.3 наявність душу джакузі басейну та ін. 12.6.4 система кондиціонування; 12.6.5 система вентиляції; 12.6.6 захворюваність на ГРЗ пневмонії у членів родини які проживають разом із захворілим. МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ НАКАЗ від 8 серпня 2007 року N 463 Про затвердження Методичних рекомендацій "Епідеміологія лабораторна діагностика та профілактика легіонельозу" З метою удосконалення протиепідемічних та профілактичних заходів з легіонельозу наказую: 1. Затвердити Методичні рекомендації "Епідеміологія лабораторна діагностика та профілактика легіонельозу" додається . 2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України Пономаренко А. М. довести ці Методичні рекомендації до відома керівників установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби лікувально-профілактичних установ наукових закладів епідеміологічного профілю в установленому порядку. 3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду МОЗ України Пономаренка А. М.  Перший заступник Міністра Головний державний санітарній лікар України С. П. Бережнов