И 4400-87

И 4400-87 Инструкция по определению витамина А и бета-каротина в пищевых продуктах

Утверждаю Заместитель Начальника Главного санитарно-эпидемиологического управления Минздрава СССР А.И.ЗАИЧЕНКО 10 июля 1987 г. N 4400-87 ИНСТРУКЦИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА A И БЕТА-КАРОТИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов. Колориметрический метод определения витамина A с треххлористой сурьмой широко используется для определения содержания витамина A в пищевых продуктах как в нашей стране так и за рубежом. Для определения содержания бета-каротина провитамина A применяют спектрофотометрический метод после отделения его от каротиноидов на окиси алюминия или других адсорбентах. Методы прошли широкую апробацию в различных лабораториях отраслевых институтах пищевой промышленности и кафедр гигиены и питания медицинских институтов одобрены Минздравом СССР и рекомендованы для практического использования Междуведомственной комиссией по составлению таблиц "Химический состав пищевых продуктов". Принцип метода определения витамина A. Метод основан на реакции витамина A с треххлористой сурьмой в хлороформе с образованием синей окраски интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию витамина A. Предварительно проводят щелочной гидролиз жира экстракцию витамина A органическим растворителем и отделение его от других соединений с помощью адсорбционной хроматографии. Принцип метода определения бета-каротина. Метод основан на измерении интенсивности светопоглощения растворов бета-каротина. Как соединения с сопряженными двойными связями каротиноиды имеют характерные спектры поглощения в видимой области. Бета-каротины экстрагируют органическим растворителем отделяют от других каротиноидов с помощью адсорбционной хроматографии и измеряют поглощение его растворов на спектрофотометре при 450 - 452 нм. При анализе молока мяса рыбы и блюд из них приготовляемых без добавления растительных продуктов возможно определение витамина A и бета-каротина из одного экстракта после их разделения на одной колонке с окисью алюминия. При анализе продукта состоящего из животного и растительного сырья определение витамина A и бета-каротина возможно из одного экстракта но после выделения этих соединений на разных колонках. Оборудование. Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г поверочной ценой деления не более 0 5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г поверочной ценой деления не более 50 мг; роторный испаритель; водяная баня с закрытым электрическим обогревом; фотоэлектроколориметр; спектрофотометр; гомогенизатор; шкаф сушильный. Посуда. Ступка с пестиком; воронки фильтровальные 3; 5 - 7 5 см; воронки делительные вместимостью 250 - 500 куб. см; колбы мерные вместимостью 50 и 100 куб. см; колбы конические вместимостью 100 и 250 куб. см; колбы круглодонные вместимостью 50 100 250 500 куб. см со шлифом 14 5 и 29 мм; холодильник обратный водяной со шлифом 14 5 мм; хроматографическая колонка - стеклянная трубка длиной 9 - 11 см внутренний диаметр 10 мл в нижний конец колонки впаяна трубка с внутренним диаметром 5 - 6 мм постепенно суживающаяся до 1 5 - 2 0 мм колонка заканчивается отводом для создания разрежения и шлифом 14 5; пробирки со шлифом 14 5 градуированные на 5 10 15 куб. см; пипетки градуированные на 1 2 5 и 10 куб. см; микропипетки градуированные на 0 1 и 0 2 куб. см; цилиндры мерные на 50 100 200 куб. см; стаканы на 50 100 250 куб. см. Реактивы. Ретинола ацетат Госфармакопея СССР 10 изд. ст. 578 ; аскорбиновая кислота Госфармакопея СССР 10 изд. ст. 6 ; алюминия окись по Брокману II нейтральная; калия гидроокись; натрий сернокислый безводный; сурьма треххлористая; фенолфталеин; ацетон; гексан; спирт этиловый ректификованный; уксусный ангидрид; хлороформ; эфир этиловый; бумага фильтровальная. При работе с эфиром ацетоном гексаном хлороформом соблюдать правила техники безопасности с органическими растворителями. Приготовление реактивов. 1. Стандартные растворы ретинола ацетата с массовой концентрацией 2900 МЕ/куб. см и 58 МЕ/куб. см. Растворяют 0 1000 г ретинола ацетата в мерной колбе на 100 куб. см в хлороформе и доводят хлороформом до метки раствор с массовой концентрацией 2900 МЕ/куб. см . Для приготовления раствора 58 МЕ/куб. см 1 куб. см раствора с концентрацией 2900 МЕ/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят до метки хлороформом. Соединения ретинола ацетата очень неустойчивы к кислороду воздуха и свету поэтому растворы готовят сразу при вскрытии ампулы и в день построения калибровочного графика. 2. Раствор треххлористой сурьмы реагент Карр-Прайса . Отвешивают 20 г SbCl в конической колбе вместимостью 250 куб. см в которую предварительно отмерено 100 куб. см хлороформа в случае большой навески после взвешивания добавляют необходимое количество хлороформа и растворяют при слабом не выше 40 °C нагревании на водяной бане периодически встряхивая. Раствор охлаждают добавляют 2 - 3 куб. см уксусного ангидрида колбу плотно закрывают и оставляют на ночь для отстаивания. Затем прозрачный раствор осторожно сливают в темную склянку с плотно закрывающейся крышкой. SbCl 3 токсична и коррозионна необходимо защищать от попадания кожу глаза дыхательные пути. 3. Раствор гидроокиси калия 50%. 50 г KOH растворяют в 50 куб. см дистиллированной воды. 4. Окись алюминия. Для приготовления окиси алюминия определенной степени активности отвешивают в бюксе 6 г адсорбента и ставят в сушильный шкаф t = 160 - 180 °C на 60 - 90 мин. Затем окись алюминия дезактивируют быстро добавляя воду микропипеткой с массовой долей 1% 0 06 куб. см или 3% 0 18 куб. см . Бюкс закрывают крышкой и встряхивают до тех пор пока масса не станет однородной. Подготавливают адсорбент и заполняют им колонку перед нанесением на нее исследуемого раствора. 5. Растворы ацетона в гексане 4; 4; 10 15% объем/объем . 6. Раствор фенолфталеина спиртовый с массовой концентрацией 1%. Ход определения. 1. Щелочной гидролиз. Интервал определяемых массовых концентраций витамина A составляет 1 5 - 10 МЕ 0 4 - 3 0 мкг /куб. см хлороформного экстракта используемого для реакции с треххлористой сурьмой. Массу навески продукта и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций. Масса навески продукта должна находиться в диапазоне 1 - 20 г с массовой концентрацией витамина A 2 - 20 мкг. Массу образца помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 или 250 куб. см соединенную шлифом с обратным водяным холодильником добавляют 40 - 60 куб. см этилового спирта 0 1 - 0 2 г аскорбиновой кислоты и 50% раствор KOH. Доля добавляемого раствора KOH зависит от вида продукта и от массовой доли и состава в нем жира. При анализе продукта с низкой массовой долей жира менее 6% и витамина A мясо рыба и готовые блюда из них на 10 г массы образца добавляют 2 - 4 куб. мм раствора KOH. При более высокой массовой доли жира в этих продуктах на 10 г образца добавляют 6 - 10 куб. см раствора KOH. Для продуктов с более высокой массовой долей витамина A яйцо творог и готовые блюда из них и жира > 10% на массу образца 5 - 7 г берут 5 - 7 куб. см щелочи. При анализе молока и молочных продуктов с низкой массовой долей жира и витамина A массу навески увеличивают до 20 г щелочь добавляют 5 - 7 куб. см. Для продуктов с высокой массовой долей жира 30% и выше сыры масло сливочное и др. на массу образца 3 - 5 г берут 4 - 8 куб. см щелочи. После добавления щелочи смесь нагревают на водяной бане с обратным водяным холодильником при температуре кипения смеси в течение 30 мин. Затем смесь охлаждают и переливают в делительную воронку. В воронку добавляют воду чтобы окончательная концентрация этилового спирта была около 30 - 35%. Признаком полного омыления служит то что после добавления воды смесь остается прозрачной. При образовании мути увеличивают массовую долю щелочи при омылении. 2. Экстрагирование. Неомыляемый остаток экстрагируют этиловым эфиром 4 раза сначала объемом эфира равным объему добавленной воды а затем объемами на 20% меньшими. Ополаскивают эфиром колбу после омыления. Объединенный эфирный экстракт отмывают от щелочи водой по фенолфталеину при добавлении фенолфталеина промывная вода не должна окрашиваться . Экстракт фильтруют через слой безводного сернокислого натрия в круглодонную колбу роторного испарителя вместимостью 250 или 500 куб. см медленно чтобы над сернокислым натрием не образовывался слой раствора сернокислый натрий промывают эфиром. Затем эфир отгоняют под вакуумом и неомыляемый остаток растворяют в 5 куб. см гексана. 3. Хроматография. В суконный конец хроматографической колонки помещают капроновую ткань промытую гексаном. Затем непрерывной струей насыпают в колонку окись алюминия с массовой долей воды 3% см. "Приготовление реактивов" уплотняя ее легким постукиванием по колонке стеклянной палочкой. На верх адсорбента добавляют слой безводного сульфата натрия 0 5 - 1 0 см . Подготовленную колонку промывают 10 куб. см гексана и наносят 5 куб. см испытуемого экстракта. Затем снова пропускают 10 куб. см гексана фракция 1 . При анализе продуктов не содержащих растительные продукты молочные мясные и т.д. после гексана пропускают через колонку раствор ацетона в гексане с массовой долей 4% до тех пор пока элюат не станет бесцветным фракция 2 . В этом случае фракцию 1 и 2 объединяют выпаривают под вакуумом на роторном испарителе остаток растворяют в гексане 5 - 10 куб. см и в растворе определяют бета-каротин V . 1 При анализе образца содержащего продукты животного и растительного происхождения после гексана через колонку пропускают раствор ацетона в гексане с массовой концентрацией 10% 30 куб. см . Витамин A элюируют последующим пропусканием через колонку 30 куб. см раствора ацетона в гексане с массовой концентрацией 15% фракция 3 . Пропускают раствор через колонку при небольшом разрешении 2 5 - 3 0 куб. см/ мин. . Фракцию 3 содержащую витамин A выпаривают в роторном испарителе под вакуумом и растворяют остаток в хлороформе 2 - 6 куб. см V . 2 4. Определение витамина A. 1 Проведение определения. Вносят 0 4 куб. см хлороформного раствора витамина A в кювету помещают ее в кюветодержатель фотоэлектроколориметра добавляют 4 куб. см раствора треххлористой сурьмы и быстро измеряют оптическую плотность так как окраска неустойчива и начинает исчезать через 5 - 6 сек. Измерение проводят при длине волны 620 нм. После измерения наблюдают за окраской раствора: синяя окраска должна исчезнуть и после этого раствор не должен быть окрашенным или мутным. Помутнение возможно в случае попадания воды с испытуемым раствором или с раствором сурьмы. Наличие окраски раствора через 15 с после проведения реакции свидетельствует о недостаточно полном отделении витамина A от мешающих соединений. В том и другом случае анализ необходимо повторить учтя вышеуказанные замечания. 2 Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора ретинола ацетата с массовой концентрацией 58 МЕ/ куб. см готовят разведения с массовой концентрацией 1 2 МЕ/ куб. см 1 куб. см стандартного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят объем до метки хлороформом ; 2 9 МЕ/ куб. см 0 5 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 10 куб. см и доводят объем хлороформом до 10 куб. см ; 5 8 МЕ/ куб. см 1 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 10 куб. см и доводят объем хлороформом до 10 куб. см ; 11 6 МЕ/куб. см 1 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 5 куб. см и доводят объем хлороформом до 5 куб. см . Приготовленные растворы хорошо перемешивают. Из каждого разведения отбирают по 0 4 куб. см раствора и проводят колориметрическую реакцию так же как при анализе испытуемых растворов. Для построения калибровочного графика по оси ординат откладывают полученные значения оптической плотности а по оси абсцисс - соответствующие им количества витамина A в 1 куб. см раствора в МЕ. 3 Расчет. Массовую долю витамина A в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле: K x V x 100 2 X = ------------ 1 3300 x a где: K - массовая концентрация витамина A в 1 куб. см испытуемого раствора определяемая по стандартной кривой МЕ; V - общий объем раствора в хлороформе куб. см; 2 100 - пересчет на 100 г продукта; 3300 - пересчет на МЕ в мг; a - масса образца г. Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 15% от среднего арифметического значения. 5. Определение бета-каротина. 1 Экстрагирование каротина из растительного материала свежие и сухие овощи плоды ягоды . Интервал определяемых концентраций бета-каротина составляет 0 1 - 1 мкг/ куб. см раствора оптическую плотность которого измеряют на спектрофотометре. Массу навески продукта 1 - 15 г с массовым содержанием бета-каротина 0 01 - 0 05 мг и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций. Массу исследуемого образца взятую из средней пробы переносят в ступку или стакан смесителя добавляют 0 1 - 0 2 г аскорбиновой кислоты и растирают с небольшим количеством измельченного стекла или гомогенизируют в смеси ацетон-гексан 1:1 . Затем смеси дают отстояться и сливают прозрачный экстракт в делительную воронку. Экстракцию повторяют до тех пор пока раствор не станет бесцветным. Отмывают объединенный экстракт от ацетона 3 раза порциями воды равными объему ацетона использованного при экстракции. Экстракт фильтруют через слой сернокислого безводного натрия в круглодонную колбу от роторного испарителя вместимостью 250 или 500 куб. см медленно и промывают слой сернокислого натрия на фильтре 2 раза небольшими порциями гексана. Выпаривают гексан на роторном испарителе до объема 4 - 5 куб. см если раствор интенсивно окрашен его не выпаривают и измеряют объем раствора V . 3 2 Хроматография бета-каротина при анализе растительного сырья. В хроматографическую колонку непрерывной струей насыпают окись алюминия с массовой долей воды 1% уплотняя ее легким постукиванием по колонке стеклянной палочкой. На верх адсорбента добавляют слой безводного сернокислого натрия высотой 0 5 - 1 0 см. Колонку промывают 10 куб. см гексана и наносят 5 куб. см раствора бета-каротина в гексане полученного раздел 2 при анализе продуктов из животного и растительного сырья или раздел 5.1 в дальнейшем необходимо следить чтобы верхний слой колонки был всегда покрыт раствором . Каротиноиды на высоте колонки сверху вниз располагаются в следующем порядке: хлорофилл ксантофиллы ликопин и каротины бета и альфа . Альфа- и бета-каротины из всех каротиноидов обладают на окиси алюминия наименьшей адсорбционной способностью и их элюируют пропуская 10 куб. см гексана или пропуская после гексана раствор ацетата в гексане с массовой концентрацией 1% до тех пор пока вытекающий с колонки раствор не станет бесцветным. После элюции каротина с колонки измеряют объем элюата V . 1 3 Спектрофотометрическое определение бета-каротина и расчет на спектрофотометре определяют оптическую плотность растворов бета-каротина в гексане полученных в разделах 3 и 5.2 при длине волны 450 - 45 нм и 1% рассчитывают содержание используя коэффициент удельного поглощения E . 1 см Массовую долю бета-каротина в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле: 10 x Д x V x 100 1 X = ----------------- 2 1% E x a 1 см где: 10 - содержание каротина в 1 куб. см 1% раствора мг; Д - оптическая плотность испытуемого раствора куб. см; V - объем элюата куб. см; 1 100 - пересчет на 100 г продукта; 1% E = 2580; 1 см a - навеска г. При анализе растительного материала массовую долю бета-каротина в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле: 10 x Д x V x V x 100 1 3 X = ---------------------- 3 1% E x 5 x a 1 см где: V - общий объем испытуемого раствора куб. см; 3 5 - объем раствора нанесенный на колонку куб. см; остальные обозначения что и к формуле 2 . Полноту отделения бета-каротина от ликопина проверяют путем снятия спектра при длинах волн 420 - 430 нм с интервалами 5 нм. Если полученные максимумы соответствуют максимуму поглощения для бета-каротина в гексане 450 - 451 475 нм то следовательно бета-каротин отделен от ликопина. Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 15% от среднего арифметического.