МР 4-18/1890

МР 4-18/1890 Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств левомицетина в продуктах животного происхождения

Утверждаю Заместитель главного государственного врача БССР В.Г.ЖУКОВСКИЙ 20 мая 1991 г. N 4-18/1890 МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Разработаны Институтом питания АМН СССР кафедрой общей гигиены Белорусского Государственного института усовершенствования врачей Минздрава СССР. Предназначены для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах санитарно-эпидемиологическими станциями а также заводскими и сельскохозяйственными лабораториями. Введение Среди ряда посторонних веществ которые могут загрязнять различные пищевые продукты важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками лекарственных препаратов применяемых для профилактики и лечения животных и птицы ускорения их роста улучшения качества и сохранности кормов и т.п. Номенклатура лекарств используемых в животноводстве и ветеринарии постоянно расширяется. К сильнодействующим лекарственным препаратам используемым в ветеринарии и животноводстве относятся антибиотики. Известно большое число антибиотиков природных и полусинтетических обладающих различными свойствами механизмом и спектром действия распределением в организме животного характером метаболизма и др. Широкое применение антибиотиков в ветеринарии и животноводстве создает определенные проблемы с точки зрения гигиены питания требует проведения соответствующих мероприятий для снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах животноводства. При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции нарушение обмена веществ дисбактериоз подавлять активность некоторых ферментов изменять микрофлору способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке мяса рыбы молока и других продуктов кроме того наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения. В мясе печени почках молоке твороге сметане сыре яйце рыбе меде и других продуктах довольно часто обнаруживают остаточные количества антибиотиков что предопределяет необходимость проведения выборочного периодического или систематического их контроля. Некоторые из перечисленных продуктов являются диетическими молоко творог сметана и др. поэтому отсутствие в них токсических и лекарственных соединений особенно важно. В СССР остаточные количества ряда антибиотиков регламентированы предельно допустимыми концентрациями ПДК <*>. К ним относятся тетрациклины 0 01 ед./г пенициллины 0 01 ед./г и стрептомицин 0 5 ед./г . -------------------------------- <*> Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М. Издательство стандартов 1990 г. Для контроля уровней этих антибиотиков Минздравом СССР утверждены микробиологические методы определения которые позволяют обнаруживать и идентифицировать группы указанных веществ на уровне ПДК. Левомицетин хлормицетин хлорамфеникол - эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия запрещен к использованию в животноводстве и ветеринарии для лечения скота птицы мясо молоко и яйца которых предназначены для питания людей. Это связано с токсичностью левомицетина проявляющейся в аллергических реакциях поражении кроветворных органов и др. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах. Микробиологические методы неэффективны для анализа этого антибиотика в пищевых продуктах т.к. найденные тест-культуры малочувствительны и не позволяют осуществлять контроль за остаточными количествами левомицетина хотя бы на уровне ПДК других антибиотиков разрешенных к применению. В связи с этим за рубежом наиболее часто применяют химические методы определения левомицетина в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения. В настоящих Методических рекомендациях впервые в СССР предпринята попытка применения для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах простого химического метода анализа основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем концентрировании экстракта отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде производного с n-деметиламинобензальдегидом. Доступность реактивов и оборудования позволяет рекомендовать этот метод для серийных анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций заводских и сельскохозяйственных лабораторий. Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5 - 10 нг в зоне. Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0 4 при спектрофотометрическом - 0 2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании его 0 05 мг/кг продукта и выше. Метод состоит из следующих основных стадий: 1. Отбор и подготовка пробы. 2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрированного экстракта. 3. Хроматографическое разделение идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте. 4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе. 5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте. Аппаратура материалы и реактивы Гомогенизатор тканей по <...> Спектрофотометр СФ-26 или аналог Термостат ТС-80М-2 или аналог Азот поверочный нулевой газ Центрифуга настольная по <...> 375-4261 или аналог Ротационный испаритель с крышкой по ТУ 25-11-917 Баня масляная или глицериновая Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой например стеклянный четырехгранный сосуд 195 x 195 x 200 мм завода "Дружная горка". Пластины для тонкослойной хроматографии "Силуфол" размером 15 x 15 см ЧСФР или Сорбфил 100 x 100 г. Краснодар ТУ 26-11-17-89 Ножницы Весы технические по ГОСТ 24104 Весы аналитические по ГОСТ 24104 Линейка Карандаш графитовый М или аналог Цилиндры мерные вместимостью 25 и 100 мл по ГОСТ 1770 Колбы плоскодонные на 250 и 500 мл с НШ N 14 5 по ТУ 48-52 Колбы мерные на 25 мл по ГОСТ 1770 Пипетки на 5 и 10 мл по ГОСТ 20292 Колбы для упаривания на <...> мл с НШ N 14 5 по ГОСТ 10394 Микрошприц на 10 и 25 мкл Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166 Серная кислота по ГОСТ 14262 <...> 1 н Этилацетат по ГОСТ <...> Натрий хлористый по ГОСТ <...> насыщенный раствор в воде Натрий углекислый по ГОСТ <...> 2% водный раствор Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-87 Петролейный эфир фракции <...> Метанол бета-глукуронидаза водный раствор 1 мг/мл Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 Кислота соляная конц. по ГОСТ 3118 Хлорид олова II восстанавливающий реактив: 3 мл 15% раствора SnCl 2 в воде + 15 мл HCl + 180 мл H O конц. 2 Левомицетин Однозамещенный фосфат калия Двузамещенный фосфат натрия 1. Отбор и подготовка проб Способ отбора и подготовки проб должен быть указан в нормативно-технической документации на конкретную продукцию. 2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрирование экстракта Мясо <*>. 10 +/- 0 1 г гомогенизируют с 15 мл 0 025 М фосфатного буфера pH 6 88 0 34 г KH PO и 0 36 г Na HPO растворяют в 100 мл 2 4 2 4 дистиллированной воды добавляли 200 мкл водного раствора бета-глукуронидазы и инкубировали 1 5 часа при 37 °С. Гомогенат экстрагировали 3 x 30 мл этилацетата при необходимости применяя для расслоения суспензии центрифугирование 5 - 10 мин. при 4000 об./мин. Этилацетатный слой объединяли. -------------------------------- <*> Аналогично извлекали левомицетин из мясных продуктов органов и тканей животных. Молоко <**>. 25 +/- 0 1 мл насыщают 10 г Na SO приливают 10 мл 2 4 этилацетата и 5 мл 1 н H SO интенсивно встряхивают 1 - 2 мин. Для 2 4 расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5 - 10 мин. при 4000 об./мин. Этилацетат декантируют а супернатант экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. -------------------------------- <**> Аналогично извлекали левомицетин из кефира ряженки йогуртов. Яйцо <***>. 10 +/- 0 1 г гомогената яйца перетирают с 5 г Na SO 2 4 приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н H SO перемешивают и центрифугируют 2 4 5 - 10 мин. при 4000 об./мин. Этилацетатный слой декантируют а водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные этилацетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 мл 2% раствора Na CO насыщенного NaCl и 10 мл насыщенного раствора NaCl. 2 3 ---------------------------- <***> Яичный порошок предварительно разводят водой до консистенции жидкой сметаны. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при температуре <= 50 °С до минимального объема отдувают азотом до исчезновения запаха этилацетата добавляют 3 мл смеси ацетонитрил - вода 1:4 и экстрагируют 3 x 5 мл петролейного эфира. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин этилацетатом 3 x 5 мл . Этилацетатный экстракт сушат над Na SO 1 г декантируют промывают 3 мл этилацетата 2 4 сульфат натрия объединяют его с экстрактом и упаривают на ротационном испарителе при температуре <= 50 °С досуха. Остаток растворяют в 200 мкл метанола. 3. Хроматографическое разделение идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте 3.1. Приготовление стандартных растворов Отвешивают 25 мг левомицетина помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют в метаноле концентрация левомицетина - 1 мг/мл. 0 25 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл. При анализе сметаны ее разбавляют в 2 5 - 5 раз в зависимости от жирности. Сыры и творог гомогенизируют с водой до получения гомогенной массы. 3.2. Хроматографическое разделение На пластинку для тонкослойной хроматографии наносят рис. а : в точки 1 3 и 5 соответственно 1 2 и 4 мкл раствора стандарта а в точки 2 и 4 соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта. Пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ - метанол 10:1. По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки ее вынимают сушат опрыскивают раствором SnCl в 2 HCl оставляют на 15 мин. и опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке по оттенку и R соответствующих пятнам стандарта f свидетельствует о возможном присутствии левомицетина в продукте. Сравнивая интенсивность окраски пятен стандартов и опытной пробы ориентировочно оценивают содержание левомицетина в экстракте. 4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе Аликвотную часть экстракта 50 - 100 мкл упаривают досуха добавляют 150 мкл 10% раствора HCl греют на масляной бане при температуре 98 °С в течение 30 мин. отдувают досуха азотом и приливают 200 мкл 2% метанольного раствора N CO . 2 3 На хроматографическую пластинку наносят 5 - 10 мкл полученной пробы и соответствующее количество стандарта левомицетина с учетом предварительной оценки содержания левомицетина в экстракте ; пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ - метанол - уксусная кислота - вода 12:5:4:2. По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки ее вынимают сушат опрыскивают раствором SnCl в HCl оставляют на 15 мин. Вновь 2 опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке по оттенку и R соответствующих пятнам f стандарта подтверждает наличие левомицетина в продукте. 5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте При необходимости точного количественного определения левомицетина в пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько точек близко расположенных друг к другу аликвотную часть экстракта и таким же образом раствор стандарта так чтобы количество левомицетина в нем было близко к установленному в пробе при ориентировочной визуальной оценке. Пластинку хроматографируют и опрыскивают как в п. 3.2. Вырезают зоны левомицетина в опытной пробе стандарте и соответствующую по R и площади f зону на пластинке служащую контролем рис. б . Зоны элюируют 3 x 1 мл метанола метанол упаривают досуха приливают 200 мкл 5% раствора SnCl в 2 5% HCl греют при температуре 98 °С в течение 1 часа; пробы охлаждают добавляют по 2 мл 1% раствора n-диметиламинобензальдегида в метаноле 1 мл метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы и стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в кюветах с l = 10 мм при лямбда = 430 нм. Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле: ОП x P x V -3 о C = 10 x k x ------------- мг/кг ОП x V x M ст 1 где: k - коэффициент учитывающий полноту извлечения левомицетина из пищевого продукта и равный 1 33 для мяса 1 13 - для молока и 1 25 - для яиц; ОП - оптическая плотность элюата опытной пробы относ. ед.; о ОП - оптическая плотность элюата стандарта относ. ед.; ст P - количество стандарта левомицетина нанесенного на пластинку мкг; V - объем анализируемой пробы мкл; V - объем аликвотной части экстракта взятой для количественного 1 определения мкл; M - масса образца пищевого продукта кг л . Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0 5 - 6 0 мкг. Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений расхождение между которыми не превышает 20%. Окончательный результат округляют до первого десятичного знака. Заключение В случае обнаружения остаточных количеств левомицетина и подтверждения правильности его идентификации в исследуемых пищевых продуктах вопрос с их реализацией решается согласно "Методическим указаниям по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства". Москва Минздрав СССР ГОЭУ. 1985 г. 34 с. <*> -------------------------------- <*> N 3049-84 от 29 июня 1984 г. РЕЦЕНЗИЯ НА МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Представленные рекомендации являются первой в СССР попыткой наладить систематический контроль за наличием и уровнями левомицетина в пищевых продуктах. До настоящего времени анализ левомицетина при необходимости выполняли микробиологически. Однако отсутствие чувствительных тест-культур не позволяет рассчитывать на обнаружение микрограммовых количеств этого антибиотика такими способами. В связи с этим особенно важно создание химического метода контроля остаточных количеств левомицетина позволяющего с небольшими затратами обнаружить идентифицировать и количественно определить его содержание. Левомицетин обладает определенной токсичностью и поэтому запрещен к использованию как у нас в стране так и за рубежом для лечения например лактирующих коров или кур-несушек. Анализ литературных данных позволяет сделать заключение что применение его для лечения сельскохозяйственных животных и птицы - достаточно частое явление оправданное дешевизной и эффективностью препарата. Интенсификация сельскохозяйственного производства может стать одной из причин снижения качества пищевых продуктов и в частности загрязнения их антибиотиками. Поэтому своевременный и надежный контроль за наличием левомицетина становится важным и актуальным. Все отмеченное позволяет рекомендовать утвердить разработанные методические рекомендации для внедрения в практику работы учреждений Госсаннадзора. Полученные этим методом материалы целесообразно обобщить для создания общей картины частоты и уровней загрязнения пищевых продуктов БССР левомицетином. Руководитель отдела гигиены питания Института питания АМН СССР профессор Г.И.БОНДАРЕВ