Инструкция по определению рибофлавина (витамина B2) в пищевых продуктах № 4398-87

Утверждаю Заместитель начальника Главного санитарно-эпидемиологического управления Минздрава СССР А.И.ЗАИЧЕНКО 10 июля 1987 г. N 4398-87 ИНСТРУКЦИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РИБОФЛАВИНА ВИТАМИНА B2 В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов. Для определения общего содержания рибофлавина в пищевых продуктах используют флюориметрический метод разработанный в двух вариантах прямой флюорометрии и люмифлавиновый прошедший широкую апробацию в лабораториях научно-исследовательских и практических учреждений при разработке справочных "Таблиц химического состава пищевых продуктов". Метод одобрен Минздравом СССР и рекомендован для практического использования Междуведомственной комиссией по составлению таблиц. Принцип метода Метод основан на свойстве свободного рибофлавина и продукта его фотолиза - люмифлавина - флюоресцировать при облучении их растворов светом с длиной волны 440 - 450 нм. В варианте прямой флюорометрии интенсивность флюоресценции измеряется до и после восстановления рибофлавина гидросернистокислым натрием. В люмифлавиновом варианте используется свойство рибофлавина при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин интенсивность флюоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом. Оборудование Флюориметр ЭФ-3М или ФМ-Ц-2; потенциометр; термостат водяной на 37 °С; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г поверочной ценой деления не более 0 5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г поверочной ценой деления не более 50 мг; водяная баня. Для люмифлавинового варианта дополнительно нужны две настольные лампы по 100 ватт желательно с отражателями направляющими свет на облучаемые колбы настольный вентилятор. Посуда Колбы мерные вместимостью 100 500 1000 куб. см; колбы конические вместимостью 250 куб. см; колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 куб. см; бюретка на 100 куб. см; цилиндры мерные вместимостью 25 куб. см; пипетки градуированные на 1 2 5 и 10 куб. см; воронки делительные вместимостью 250 куб. см воронки фильтровальные диаметром 3 5 см и 8 см. Реактивы 1. Калий марганцевокислый х.ч. 2. Натрий гидроокись х.ч. 3. Натрий гидросернистокислый техн. 4. Натрий уксуснокислый 3-водн. х.ч. 5. Натрия сульфат безводный х.ч. 6. Перекись водорода 30% х.ч. 7. Рибофлавин кристаллический Гос. фармакопея СССР X изд. ст. 585 . 8. Кислота соляная х.ч. 9. Кислота уксусная ледяная х.ч. 10. Хлороформ для наркоза. 11. Ферментные препараты амилоризин П10х и пектаваморин П10х. Приготовление реактивов 1. Стандартные растворы рибофлавина. Растворяют 0 0200 г рибофлавина предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой или пятиокисью фосфора в течение 10 дней в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см в 750 куб. см дистиллированной воды. Для лучшего растворения добавляют 1 куб. см ледяной уксусной кислоты и слегка подогревают. После полного растворения рибофлавина раствор охлаждают до комнатной температуры доводят объем водой до метки и тщательно перемешивают раствор с массовой концентрацией рибофлавина 0 020 г/куб. см . Переносят в склянку темного стекла с притертой пробкой добавляют 0 5 куб. см толуола и сохраняют в темноте и на холоде не более 2-х месяцев. В день проведения анализа 5 куб. см этого раствора нагретого в темноте до комнатной температуры помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем до метки водой перемешивают рабочий раствор с массовой концентрацией рибофлавина 1 мкг/куб. см . 2. Раствор соляной кислоты 0 1 н. 3. Насыщенный раствор натрия уксуснокислого. 4. Раствор калия марганцевокислого 3%. 5. Раствор перекиси водорода 3% готовят свежий еженедельно. 6. Раствор гидроокиси натрия 7 н. Ход определения Интервал определяемых концентраций рибофлавина составляет при прямой флюорометрии 0 5 - 2 мкг/куб. см; при использовании люмифлавинового варианта - 0 03 - 0 20 мкг/куб. см. Величину навески продукта и последующие разведения рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций. Навеску мелкоизмельченной средней пробы продукта помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см приливают около 150 куб. см 0 1 н раствора соляной кислоты и кипятят на водяной бане 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры доводят рН гидролизата до 4 5 потенциометрически с помощью насыщенного раствора уксуснокислого натрия добавляют 100 мг амилоризина 0 5 куб. см толуола и помещают в термостат на 14 - 16 часов при 37 °С. На следующий день гидролизат охлаждают доводят объем в мерном цилиндре до 250 куб. см дистиллированной водой и фильтруют. Если исследуемый объект содержит много жира то навеску перед гидролизом обрабатывают серным эфиром; возможно также обработать эфиром уже готовый гидролизат. При анализе объектов содержащих много пектиновых веществ яблоки крыжовник смородина тыква кабачки и продукты их переработки вместо амилоризина используют пектаваморин. При необходимости прервать анализ на 1 - 2 дня перед доведением объема до 250 куб. см гидролизат кипятят 5 минут охлаждают доводят объем до 250 куб. см и фильтруют. До проведения анализа фильтрат хранят в холодильнике в хорошо закрытой склянке. Одновременно аналогичным образом ставят контрольную пробу на содержание рибофлавина в ферментных препаратах используя те же количества ферментных препаратов и реактивов. При анализе многих видов продуктов стадия гидролиза совпадает с аналогичной стадией анализа на содержание тиамина что позволяет проводить определение рибофлавина и тиамина в одной навеске. Вариант прямой флюорометрии Метод прямой флюорометрии неприменим при анализе объектов с очень низким содержанием рибофлавина некоторые овощи плоды ягоды готовых блюд и кулинарных изделий а также при исследовании зерновых продуктов круп муки зерна хлеба и т.д. . В этих случаях предпочтительным является люмифлавиновый вариант. В 4 флюорометрические пробирки наливают по 10 куб. см фильтрата испытуемого образца. В 2 пробирки с фильтратом добавляют по 1 куб. см дистиллированной воды в 2 другие - по 1 куб. см очень точно! стандартного раствора содержащего 1 мкг рибофлавина в 1 куб. см. В 5-ю пробирку наливают 10 куб. см фильтрата контрольной пробы к 1 куб. см воды. Во все пробирки добавляют по 1 куб. см ледяной уксусной кислоты и перемешивают содержимое. Затем вносят по 0 5 куб. см 3% раствора KMnO ; 4 смешивают и оставляют на 2 мин. Добавляют в каждую пробирку по 0 5 куб. см энергично 3% раствора H O и встряхивают для удаления избытка кислорода. 2 2 Измеряют флюоресценцию всех растворов на флюориметре со светофильтрами имеющими максимум пропускания в области 350 - 480 нм В - первичный и 510 2 - 550 нм В - вторичный . После этого добавляют в каждую пробирку 2 небольшими порциями по 15 - 25 мг порошкообразный гидросернистокислый натрий перемешивают и в течение 5 - 10 сек. вновь измеряют флюоресценцию растворов. Повторяют эту операцию быстро еще раз не допуская помутнения растворов за счет выделения свободной серы. Для расчетов используют средние показания двух параллельных пробирок до и после добавления гидросернистокислого натрия. В последнем случае берут наименьшие значения флюоресценции полученные при повторном восстановлении рибофлавина гидросернистокислым натрием. Содержание рибофлавина в исследуемом образце в мг на 100 г Х вычисляют по следующей формуле: [ А - А - С - С ] х V х n 1 1 Х = ----------------------------------- [ В - В - А - А ] х V х а х 10 1 1 1 где: А - интенсивность флюоресценции исследуемого образца без добавления стандартного раствора рибофлавина; А - то же после восстановления рибофлавина гидросернистокислым 1 натрием; В - интенсивность флюоресценции исследуемого образца с добавлением стандартно раствора рибофлавина; В - то же после восстановления рибофлавина гидросернистокислым 1 натрием; С - интенсивность флюоресценции контрольного опыта; С - то же после добавления гидросернистокислого натрия; 1 V - объем гидролизата куб. см ; V - количество гидролизата взятое для окисления перманганатом калия 1 куб. см ; n - количество добавленного рибофлавина мкг ; а - навеска образца г ; 10 - коэффициент пересчета из мкг/г в мг/100 г продукта. Люмифлавиновый вариант К 100 мл фильтрата добавляют 2 куб. см 30% раствора серной кислоты из пипетки 3% раствора KMnO по каплям постоянно перемешивая до получения 4 малинового окрашивания. Через одну минуту избыток перманганата калия удаляют добавлением по каплям 3% раствора перекиси водорода. Количество куб. см израсходованных перманганата калия и перекиси водорода приплюсовывают к первоначально взятому на окисление объему фильтрата чтобы определить конечный объем раствора. Например: на окисление 100 куб. см фильтрата израсходовано 1 8 куб. см KMnO и 0 2 куб. см H O . Конечный объем будет 100 куб. см + 2 куб. см 30% 4 2 2 серной кислоты + 1 8 куб. см + 0 2 куб. см = 104 куб. см. Полученный раствор переносят в делительную воронку добавляют 30 - 50 куб. см хлороформа и встряхивают 1 мин. После разделения слоев хлороформный слой отбрасывают а водную фазу используют для дальнейшего определения. Одновременно аналогичным образом обрабатывают контрольную пробу содержащую те же количества ферментных препаратов и реактивов но без исследуемого образца. В 4 конические колбы с притертыми пробками наливают по 20 куб. см экстракта исследуемого образца. В 2 из них добавляют по 2 куб. см рабочего стандартного раствора рибофлавина с массовой концентрацией 1 мкг в 1 куб. см. В 5-ю коническую колбу наливают 20 куб. см контрольной пробы. Во все колбы добавляют по 4 куб. см 7 н раствора едкого натра закрывают пробками перемешивают и облучают их 40 мин. светом двух настольных ламп по 100 ватт с расстояния 30 см. Температура окружающего воздуха не должна превышать 25 °С для охлаждения используют настольный вентилятор. Немедленно после окончания облучения все растворы подкисляют 4 куб. см ледяной уксусной кислоты добавляют по 20 куб. см хлороформа закрывают притертыми пробками и встряхивают колбы в течение 2-х минут избегая образования эмульсии. Оставляют все колбы на 10 - 15 минут для расслоения водной и хлороформной фаз. С помощью пипетки с резиновой грушей или небольшой делительной воронки отбирают по 10 - 12 куб. см хлороформного раствора который фильтруют через бумажный фильтр с безводным сернокислым натрием в флюорометрические пробирки. Измеряют флюоресценцию полученных таким образом хлороформных растворов на флюориметре используя те же светофильтры которые указаны в варианте прямой флюорометрии. Содержание рибофлавина мг на 100 г продукта вычисляют по формуле: А - А х К х V х V 1 1 Х = --------------------------- А - А х а х V х V х 10 2 2 3 где: А - среднее из показаний флюориметра для испытуемого образца без добавления стандартного раствора рибофлавина; А - то же для контрольного опыта на реактивы; 1 А - среднее из показаний флюориметра для исследуемого образца с 2 добавлением стандартного раствора рибофлавина; К - количество добавленного рибофлавина мкг ; V - общий объем гидролизата куб. см ; V - объем гидролизата после окисления куб. см ; 1 V - объем гидролизата взятый на окисление куб. см ; 2 V - объем гидролизата взятый на облучение куб. см ; 3 а - навеска продукта г ; 10 - коэффициент пересчета из мкг/г в мг/100 г продукта. Вычисления проводят до второго знака после запятой. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 10% от среднего арифметического значения.