МУ 4072-86

МУ 4072-86 Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания мочевой кислоты в зерне и зернопродуктах

Утверждаю Главный государственный санитарный врач СССР П.Н.БУРГАСОВ 11 февраля 1986 г. N 4072-86 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ В ЗЕРНЕ И ЗЕРНОПРОДУКТАХ Методические указания разработаны в Институте питания АМН СССР. Предназначены для использования лабораториями санитарно-эпидемиологических станций и институтами при контроле за загрязнением зерна и зернопродуктов мочевой кислотой. Мочевая кислота - естественный продукт обмена нуклеиновых кислот у человека животных и насекомых. Наличие мочевой кислоты в зерне и зернопродуктах рассматривается как один из показателей их загрязненности продуктами жизнедеятельности насекомых. Мочевая кислота 2 6 7-тригидроксипурин C H O N молекулярная масса 5 4 3 4 168 12 представляет собой бесцветное кристаллическое вещество малорастворимое в воде 6 45 мг / 100 мл при 37 °C; 80 мг / 100 мл при 100 °C нерастворимое в спирте и эфире легко растворимое в щелочах. Максимум поглощения УФ-света при длине волны 282 нм. В основе предлагаемого метода анализа мочевой кислоты лежит прямое определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ . Предел обнаружения метода - 0 1 мг% относительное стандартное отклонение - 0 07 - 0 10. Степень извлечения добавленной к образцу мочевой кислоты - 90 - 93%. Продолжительность анализа - 45 мин. Метод включает следующие этапы: - экстракцию образца кипящей водой; - разделение идентификацию и определение содержания мочевой кислоты с помощью ВЭЖХ на силикагеле химически связанном с октадецилсиланом с УФ-детектором при длине волны 282 нм. Методические указания предназначены для лабораторий санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских институтов при контроле за загрязнением зерна и зернопродуктов мочевой кислотой. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ 1. Жидкостный хроматограф "Альтекс" модель 336 или другой хроматограф с аналогичными параметрами колонка и предколонка с силикагелем типа "Ультрасфера ОДС" с размером частиц 5 мкм длина колонки 25 см предколонки - 4 5 см внутренний диаметр - 0 46 см; ультрафиолетовый детектор "Кратос" модель SF-757 или другой детектор с аналогичными параметрами. 2. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл. 3. Колбы плоскодонные конические на 500 мл с НШ 29 тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-74. 4. Цилиндры мерные на 500 мл тип 2-100 по ГОСТ 1770-74. 5. Мочевая кислота. 6. Кислота уксусная "х.ч." по ГОСТ 61-75. 7. Натрий уксуснокислый натрия ацетат 3-водный "х.ч." по ГОСТ 199-78. 1. ЭКСТРАКЦИЯ При отборе пробы для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТа 12430-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе". Навеску отобранной пробы 10 г помещают в плоскодонную коническую колбу на 500 мл добавляют 300 мл дистиллированной воды и нагревают при кипении в течение 10 минут. После охлаждения до 25 °C экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр. 2. ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ 2.1. Приготовление стандартного раствора мочевой кислоты Стандартный раствор мочевой кислоты готовят следующим образом: навеску 2 мг кристаллической мочевой кислоты помещают в мерную колбу на 100 мл растворяют в воде и доводят водой до метки. Концентрация мочевой кислоты в полученном стандартном растворе 20 мкг/мл или 20 нг/мкл. Рабочий раствор мочевой кислоты для ВЭЖХ готовят следующим образом: 2 5 мл стандартного раствора мочевой кислоты с концентрацией 20 нг/мкл помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят водой до метки. Концентрация мочевой кислоты в полученном растворе 2 нг/мкл. Стандартные растворы хранят в холодильнике при температуре +5 - +10 °C. Срок годности стандартного раствора до 1 года. 2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ В мерную колбу на 500 мл добавляют 4 2 мл уксусной кислоты и 13 4 мг уксуснокислого натрия 3-водного объем доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. 34 6 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 500 мл и объем доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор подвижной фазы ацетатный буфер должен иметь pH 5 8. При необходимости pH раствора доводят до pH 5 8 добавлением 1 М раствора уксусной кислоты с использованием для контроля pH-метра. Подвижную фазу следует фильтровать через бумажный фильтр перед проведением ВЭЖХ. 2.3. Проведение ВЭЖХ Условия ВЭЖХ: колонка и предколонка "Ультрасфера ОДС" подвижная фаза 0 04 М водный раствор ацетатного буфера pH 5 8 скорость подвижной фазы 1 мл/мин. УФ-детектор длина волны 282 нм шкала чувствительности - 0 01 или 0 005 единиц оптической плотности. Для калибровки прибора в хроматограф вводят 1 3 6 мкл стандартного раствора что соответствует 2 6 12 нг мочевой кислоты. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных выше условиях ВЭЖХ время выхода пика мочевой кислоты составляет 9 - 10 минут. В инжектор хроматографа вводят 5 - 20 мкл экстракта. При наличии пика на хроматограмме анализируемого экстракта совпадающего по времени выхода со стандартом определят его высоту h . обр Расчет концентрации мочевой кислоты в образце проводят по формуле: V x m x h 1 обр C = -------------- мг% V x 100 x h 2 ст где: V - объем экстракта мл 300 мл ; 1 V - объем экстракта введенный в хроматограф мкл 5 - 20 мкл ; 2 m - масса стандарта мочевой кислоты введенной в хроматограф нг; h - высота пика соответствующая данной массе стандарта мм; ст h - высота пика мочевой кислоты из образца мм. обр Если пик мочевой кислоты в образце выходит за предел шкалы самописца анализ проводят повторно после разбавления раствора экстракта водой т.е. после увеличения объема V . 1