Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям

Утверждаю Начальник Главного управления карантинных инфекций МЗ СССР В.П.СЕРГИЕВ 19 февраля 1980 года МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ К КОНТРОЛЮ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ ВВЕДЕНИЕ Комплексная система стандартизации медицинских биологических препаратов в том числе и бактериологических питательных сред предусматривает применение унифицированных методов оценки качества готовых препаратов промышленного изготовления а также экспериментальных образцов на различных этапах их конструирования и испытания. В настоящих "Методических рекомендациях" на основе обобщения опыта по контролю питательных сред промышленного изготовления предлагаются: условная классификация бактериологических питательных сред; биологические показатели используемые для оценки сред; рекомендации для выбора той совокупности показателей которые необходимы для оценки конкретной питательной среды в соответствии с ее назначением; описание методик оценки по всем показателям и необходимой подготовительной работы с тест-штаммами. Изложенными рекомендациями необходимо руководствоваться на этапе конструирования бактериологических питательных сред при последующих их испытаниях авторских комиссионных а также при серийном промышленном выпуске препаратов с внесением унифицированных методов на соответствующих этапах в программы испытания и в техническую документацию. Данные рекомендации могут быть использованы и для оценки качества питательных сред лабораторного изготовления. КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД По своему целевому назначению питательные среды можно условно разделить на две основные группы: диагностические и производственные. I. Диагностические среды Эта группа сред в свою очередь включает следующие подгруппы: 1. Среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов жидкие плотные с целью одноразового посева или длительного культивирования. 2. Среды для выделения конкретного вида возбудителя плотные элективные селективные . 3. Среды дифференциальные позволяющие различать отдельные виды группы микроорганизмов плотные элективные содержащие индикаторы красители и т.д. . 4. Среды для идентификации позволяющие по отдельным признакам отношение к углеводам мочевине и др. проводить идентификацию микроорганизмов. 5. Среды накопительные - для обогащения конкретного вида микроорганизмов жидкие полужидкие элективные селективные . II. Производственные среды К данной группе могут быть отнесены питательные среды используемые в производственном процессе получения медицинских биологических препаратов бактерийных вакцин анатоксинов и др. и контроле их качества. Поскольку для получения производственных питательных сред более целесообразным является использование не готовых сухих сред а сухих компонентов коммерческого изготовления белковые основы стимуляторы роста и др. в данное руководство включена именно эта группа препаратов: 1. Белковые основы пептоны гидролизаты и т.п. стимуляторы роста дрожжевые и другие экстракты . 2. Среды для контроля качества препаратов стерильность . БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД Оценка питательных сред и их компонентов проводится с помощью совокупности показателей <*> из числа нижеперечисленных выбираемых для контроля среды в соответствии с ее назначением: 1. Чувствительность определяется по максимальному разведению культуры при котором на всех засеянных чашках пробирках обнаруживается рост. -1 -9 Результат указывается по соответствующему разведению 10 - 10 для всех групп питательных сред <*>. -------------------------------- <*> Для каждого показателя указаны N согласно N в разделе "Классификация" тех групп препаратов для оценки которых данный показатель является обязательным. 2. Эффективность - по выходу микробных тел с 1 мл питательной среды в млрд./мл - для группы I/5 и II/1. 3. Показатель стабильности основных свойств микроорганизма - по отношению числа атипичных по морфологии биохимическим серологическим фаголизабельным и др. свойствам колоний к общему числу колоний на чашках с испытуемой средой в % - для всех групп кроме II/2. 4. Дифференцирующие свойства - по выраженности отличительных признаков патогенных микробов от непатогенных видов и естественных ассоциантов по структурным особенностям колоний их окраске изменению цвета и др. признакам - для групп I/3 I/4. 5. Показатель ингибиции - по степени подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору. Выражается либо кратностью того минимального разведения при котором полностью отсутствует рост посторонней микрофлоры либо величиной отношения числа сформировавшихся клеток тест-штамма к расчетному количеству посеянных при соответствующем разведении клеток - для всех сред I группы кроме I/1 I/4. 6. Скорость роста - по минимальному времени инкубации после посева культур достаточному для их выявления выражается в часах - для всех групп питательных сред. ОЦЕНКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПО БИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ Тест-штаммы культур порядок хранения и подготовка для контроля Набор тест-штаммов для оценки соответствующей питательной среды авторы определяют в процессе экспериментальной работы и рекомендуют их для контроля после проведения этапа испытания образцов питательной среды. Рекомендуемые для контроля свежевыделенные штаммы с момента выделения и получения их в виде чистых культур не должны проходить более 3 - 5-ти последовательных пересевов на питательных средах с последующим обязательным лиофильным высушиванием в большом количестве ампул и представлением в ГИСК для хранения в качестве производственных штаммов. Используемые для контроля музейные тест-штаммы получают в лиофилизированном состоянии из ГИСК им. Тарасевича. Лиофилизированные музейные и свежевыделенные культуры хранят при Т 4 - 6 °C. Восстановление культур из лиофилизированного состояния проводится с использованием жидкой <*> и плотной питательных сред принятых для определенной группы микроорганизмов. -------------------------------- <*> В случае отсутствия первичного роста культуры на плотной среде необходимые исследования проводят с бульонными культурами. Рекомендуемые для контроля штаммы должны проверяться на отсутствие диссоциации по соответствующим тестам см. ниже . В случае необходимости проводят изучение культурально-морфологических и биохимических свойств. Тест-штаммы должны находиться в типичной для данного микроорганизма форме. В случае если обнаруживается более 25% полиморфных колоний культура не может быть использована для контроля питательных сред. Восстановленную культуру пересевают на соответствующую среду хранения после чего пробирки запаивают. Полученные таким образом исходные культуры тест-штаммов хранят при Т 4 - 6 °C и используют по мере необходимости. Для получения рабочей культуры исходную культуру тест-штамма из запаянной пробирки высевают на такое количество пробирок с соответствующей средой для последующего хранения которое позволит обеспечить необходимый контроль питательной среды. Рабочую культуру хранят при Т 4 - 6 °C не более 3 - 6 месяцев в условиях предохраняющих культуру от высыхания. Для посева на испытуемые среды используют культуры тест-штаммов прошедшие не более 2-х пассажей на питательных средах. Проверка тест-штаммов на диссоциацию а Визуальный просмотр колоний на чашках и в микроскопе в "косонаправленном" свете. б Проба кипячением 2-х млрд. взвеси микробных тел агаровой культуры в физиологическом растворе на водяной бане в течение 1 часа учет результатов и агглютиноскопа . Взвесь культуры должна быть гомогенной. в Эмульгирование агаровой культуры на стекле в 0 85% и в 4% растворах NaCl а также в растворе трипофлавина 1:1000 для культур не содержащих поверхностных К-антигенов . Культура не должна хлопковаться. г Специфическая реакция агглютинации на стекле с адсорбированными агглютинирующими специфическими сыворотками. Реакция агглютинации должна быть не менее чем на 3+. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СКОРОСТИ РОСТА Культуры тест-штаммов выращенные на скошенном агаре смывают физиологическим раствором NaCl и подводят под оптический стандарт ГИСК им. Тарасевича соответствующий 10 ед. мутности. В тех случаях когда не определен коэффициент пересчета микробных клеток в единицы мутности расчеты ведут от 10 ед. мутности по соответствующему разведению. Из исходной стандартной взвеси готовят 10-кратные разведения путем последовательного переноса не менее 0 5 мл культуры в 8 пробирок с 4 5 мл физиологического раствора тщательно перемешивая и меняя стерильную пипетку после каждого "шага". -5 -6 -7 -8 Из 4-х последних разведений 10 10 10 10 по 0 1 мл взвеси из каждого вносят в 3 хорошо подсушенные чашки пробирки с плотной средой или 3 пробирки с 10 мл жидкой полужидкой питательной средой <*>. -------------------------------- <*> При посеве в жидкие полужидкие питательные среды обогащения -4 -5 -6 -7 посевы производят из разведений 10 10 10 10 по 1 мл взвеси в каждую пробирку с 9 мл среды. При посевах на чашки и пробирки с плотной средой взвесь культуры распределяют по поверхности среды используя для каждой чашки новый шпатель а на пробирках со скошенным агаром взвесь культуры распределяют путем обкатывания. Метод обкатки можно использовать и для чашек. Посевы помещают в соответствующие условия выращивания. После инкубации производят учет результатов чувствительность среды определяют по наибольшему разведению обеспечивающему формирование колоний или визуально видимый рост на всех засеянных чашках пробирках с питательной средой <*>. -------------------------------- <*> При определении показателя чувствительности в жидких средах обогащения в случае отсутствия визуально обнаруживаемого роста после соответствующей инкубации посевов из каждой пробирки производят высев на чашки с питательным агаром разделенным на 4 - 8 секторов на каждый из которых засевают по одной петле культуры из каждой пробирки с жидкой средой. Учет результатов скорости роста культуры в каждом взятом в опыт разведении микробной взвеси производят для плотных сред через 12 - 24 - 48 часов инкубации для жидких обогащения - через 3 - 6 и далее часов. Показатель скорости роста определяют по минимальному времени инкубации посевов за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливый видимый невооруженным глазом рост культуры помутнение наличие пленки осадка роста по уклону и др. во всех засеянных пробирках с жидкими полужидкими питательными средами или формирование типичных легко дифференцируемых колоний на чашках пробирках с плотной средой. Определение стабильности биологических свойств культур Определение этого показателя проводят на чашках где выросло не менее 25 и не более 100 - 150 колоний. Изучают свойства культур выращенных на питательных средах по культурально-морфологическим биохимическим серологическим фаголизабельным и другим признакам. При этом оцениваются: а характер роста культур равномерное помутнение среды формирование пленки на поверхности среды придонно-пристеночный рост рост в виде осадка и др. в жидких средах. Равномерное зональное помутнение среды рост по уколу сталактитовый рост в виде елочки в др. - в полужидких средах; форма структура характер роста колоний диаметр измеряется с помощью микрометра или циркуля-измерителя средний диаметр вычисляется из 5-ти измерений на каждой чашке. Диаметр колоний в популяции не должен отличаться более чем в 2 раза - на плотных средах ; б морфология микробов - форма кокки палочки отсутствие полиморфизма в размерах окраске и др. : - расположение одиночное парное гроздевидное цепочки и др. ; - строение наличие капсулы жгутиков спор включений и др. ; - подвижность; в серологические признаки изучают в реакции агглютинации на стекле с видовыми рецепторными агглютинирующими сыворотками с антительными диагностикумами или с люминесцирующими сыворотками с антительными диагностикумами или с люминесцирующими адсорбированными сыворотками. Проверяют физико-химическое состояние клеток - стабильность взвеси микробов отсутствие спонтанной агглютинации в растворе трипофлавина в 0 85% и 4% растворах NaCl; г биохимические свойства ферментация углеводов образование H S и 2 индола и др. пигментообразование; д фаголизабельность; е биологические свойства гемолиз и др. . Названные свойства определяют по общепринятым методикам. По п. п. "в" "г" "д" изучают не менее чем 3 колонии с каждой чашки. Определение дифференцирующих свойств Дифференцирующие свойства среды определяют по следующим тестам: а выраженности дифференцирующего признака - структура колоний изменение цвета колоний или цвета среды под колониями ореол вокруг них диаметр последнего появление диффузного изменения цвета среды; б четкости дифференциации колоний группы патогенных микроорганизмов от микробов непатогенных видов входящих в тот же систематический таксон и от естественных ассоциантов при посеве смесей. Для оценки дифференцирующих свойств среды готовят смесь из штамма каждого возбудителя и одного из штаммов непатогенных микробов. Испытывают два варианта смесей патогенного и непатогенного микробов в отношении 1:1 и 1:10. Высев из каждой смеси производят по 0 1 мл на 3 чашки с опытной средой. Первая смесь необходима для учета четкости дифференциации вторая - для оценки возможности выделения единичных патогенных возбудителей из смеси с другими микроорганизмами. Дифференцирующие свойства сред используемых для идентификации чистых культур определяют качественно набором штаммов с положительными и отрицательными признаками по соответствующим тестам. Определение показателя ингибиции Ингибирующие свойства среды определяются как по отношению к патогенной флоре так и по отношению к микробам-ассоциантам. При определении показателя ингибиции в отношении микробов-ассоциантов посевная доза этих микробов должна превышать посевную дозу патогенной флоры в 10 раз для слабо элективных и в 100 раз и более для селективных сред. Смесь готовится путем соединения 1 мл взвеси содержащей в посевной дозе 100 микробных клеток возбудителя и 1 мл взвеси одного из микробов-ассоциантов содержащего 1000 и 10000 м.к. Из указанных смесей производят высев по 0 1 мл на 3 чашки каждый штамм смешивается с патогенным возбудителем отдельно . Ингибирующее действие жидких селективных элективных питательных сред обогащения определяют по отношению к патогенной и к соответствующей непатогенной микрофлоре с использованием монокультур и их смеси. С этой целью по 1 мл взвеси содержащей 10 100 и 1000 м.к. чистой культуры патогенного 1000 10000 м.к. и более чистой культуры непатогенного микробов вносят в три параллельные пробирки с 10 мл среды каждого разведения. Одновременно в 3 пробирки с 10 мл испытуемой среды вносят это же количество микробных клеток патогенного возбудителя в смеси с 1000 10000 и 100000 м.к. непатогенного микроба. Через 3 - 6 и более часов инкубации производят высев из каждой пробирки с посевами чистых культур и из смесей по 0 1 мл на чашки с соответствующей средой для последующей идентификации и через оптимальный срок инкубации учитывают результат аналогично тому как для плотных сред . Определение показателя эффективности а Оценку качества белковых основ по показателю эффективности на моделях жидкой питательной среды производят путем определения концентрации микробной взвеси в среде через соответствующий срок инкубации по изменению показателя оптической плотности на спектрофотометре или ФЭКе . б На модели плотной питательной среды эффективность определяют по следующей методике: 18 - 20-часовую культуру смывают с плотной среды физиологическим раствором хлористого натрия и взвесь доводят до 10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. Тарасевича. Полученную взвесь разводят физиологическим раствором в 2 раза что соответствует приблизительно 500 млн. микробных тел в 1 мл 5 ед. стандарта . 0 1 мл этого разведения засевают на 2 пробирки со скошенным испытуемым агаром скашивают таким образом чтобы в нижней части пробирки не было столбика . Через 20 часов роста при 37 °C культуры смывают с поверхности агара 2 5 мл физиологического раствора. Добавление физиологического раствора которое пошло на это разведение плюс 0 5 мл взвеси культуры в физиологическом растворе и составят выход микробных тел в млрд. с 1 мл среды. Пример: 2 5 мл физиологического раствора смывают культуры с 5 мл питательного агара. Следовательно на 1 мл питательного агара приходится 0 5 мл взвеси культуры. Для разведения 0 5 мл взвеси культуры до содержания 1 млрд. микробных тел 10 ед. стандарта пошло 3 2 мл физиологического раствора. Следовательно в пробирке будет содержаться 3 2 мл физиологического раствора плюс 0 5 взвеси культуры т.е. всего 3 7 мл. Выход микробных тел с 1 мл среды составит соответственно 3 7 млрд. м.к. в В жидких полужидких средах обогащения определение накопительного эффекта проводят по следующей методике: Разведение соответствующих тест-штаммов проводят по методике описанной -4 -5 -6 для определения чувствительности. Из разведений культур в 10 10 10 -7 10 до 1 мл взвеси из каждого вносят в 3 - 5 пробирок с 10 мл жидкой полужидкой испытуемой средой. Параллельно из каждого разведения производят высев по 0 1 мл взвеси культуры на 3 - 5 чашек с питательным агаром для определения числа жизнеспособных микробных клеток в посевной дозе необходимого для последующего вычисления прироста возбудителя в средах обогащения. После соответствующей инкубации посевов в среде обогащения 3 - 6 и более часов независимо от видимых ее изменений из каждой пробирки производят высев на чашки с питательным агаром по 0 1 мл на чашку . В случае обильного роста культуры в жидкой среде ее перед посевом на чашки необходимо развести. Степень разведения учитывают при обсчете результатов. Через 18 - 20 и более часов инкубации производят подсчет сформировавшихся колоний на чашках засеянных из исходных взвесей культур и из жидких сред обогащения. Прирост числа микроорганизмов при размножении в среде обогащения в процессе инкубации посевов в течение соответствующего времени t определяют по формуле в % : n - n t o J = ------- x 100 n t где: n - число колоний на чашках засеянных из жидких сред после инкубации; t n - число колоний при высевах исходных взвесей культур. o В процессе отработки методов контроля следует шире использовать методы статистической обработки данных при определении количественных величин для показателей определение средних величин средних квадратичных отклонений вычисление коэффициента вариации определение доверительных интервалов и статистической значимости разницы средних величин на контрольной и опытных средах .