Методичні рекомендації з методів досліджень біологічної дії природних лікувальних ресурсів та преформованих лікувальних засобів: мінеральні природні лікувально-столові та лікувальні води, напої на їхній основі; штучно-мінералізовані води; пелоїди, розсоли, глини, воски та препарати на їхній основі

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ НАКАЗ N 692 28.09.2009 м.Київ Про затвердження методичних рекомендацій з методів досліджень біологічної дії природних лікувальних ресурсів та преформованих лікувальних засобів З метою універсалізації проведення доклінічних досліджень лікувальних природних ресурсів удосконалення методів досліджень біологічної дії природних лікувальних ресурсів та преформованих лікувальних засобів НАКАЗУЮ: 1. Затвердити методичні рекомендації з методів досліджень біологічної дії природних лікувальних ресурсів та преформованих лікувальних засобів: мінеральні природні лікувально-столові та лікувальні води напої на їхній основі; штучно-мінералізовані води; пелоїди розсоли глини воски та препарати на їхній основі дані методичні рекомендації додаються . 2. Українському науково-дослідному інституту медичної реабілітації та курортології МОЗ України при проведенні експериментальних доклінічних та клінічних досліджень використовувати методичні рекомендацій з методів досліджень біологічної дії природних лікувальних ресурсів та преформованих лікувальних засобів: мінеральні природні лікувально-столові та лікувальні води напої на їхній основі; штучно-мінералізовані води; пелоїди розсоли глини воски та препарати на їхній основі затверджених цим наказом. 3. Контроль за виконанням цього наказу покласти на заступника Міністра Бідного В.Г. Міністр В.М.Князевич ЗАТВЕРДЖЕНО Наказом МОЗ України Від 28.09.2009№692 Методичні рекомендації з методів досліджень біологічної дії природних лікувальних ресурсів та преформованих лікувальних засобів: мінеральні природні лікувально-столові та лікувальні води напої на їхній основі; штучно-мінералізовані води; пелоїди розсоли глини воски та препарати на їхній основі ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ СИМВОЛІВ ОДИНИЦЬ ЗКОРОЧЕНЬ І ТЕРМІНІВ b-ОБДГ - ?-оксибутиратдегідрогеназа; F6ФДГ - глюкоза-6-фосфатдегідрогеназа; NO-синтаза - синтаза оксиду азоту; NАД - нікотінамідоденіндінуклеотид окислений ; NАДН - нікотінаміддінуклеотид відновлений ; АлТ - аланін амінотрансфераза; АПР - спонтанні "атипові" поведінкові реакції; АсТ - аспартат-амінотрансфераза; АТ -артеріальний тиск; ГАМК-трансаміназа - гамааміномасляноїкислоти-трансаміназа; ГДГ - глутаматдегідрогеназа; ДО - дослідницької та орієнтувальної поведінки щурів; ЗЗЗЗ чи TIBC - загальна залізозв'язуюча здатність; ЗІЗ - засоби індивідуального захисту; ЛДГ - лактатдегідрогеназа; ЛІІ - лейкоцитарний індекс інтоксикації; М - молярність розчину; НАД+ - нікотінамід-аденіндінуклеотид; НАДФ+ - нікотінамід-аденіндінуклеотид-фосфат; НАДФН-діафораза - нікотінамідаденіндінукліотідфосфат-діафораза; НЗЗЗ - ненасичена залізозв'язуюча здатність; НСТ - нітросиній тетразолій; НСТ-тест - нітросиній тетразолієвий тест; ПОЛ - перекисне окислення ліпідів; СДГ - сукцинатдегідрогеназа; ТБК - тіобарбітурова кислота; ТФР - теофілін-резистентні лімфоцити; ТФЧ - теофілін-чутливі лімфоцити; х.ч. - хімічно чистий; ЦІК - циркулюючі імунні комплекси; ЦНС - центрально-нервова система; ч.д.а. - чистий для аналізу; ШОЄ - швидкість осідання еритроцитів. ВСТУП Мінеральні води лікувальні грязі воски глини та інші засоби природного походження є одними з найважливіших факторів які застосовуються у лікувально-профілактичних цілях при багатьох захворюваннях. Немедикаментозні способи відновлювального лікування широко використовуються при захворюваннях опорно-рухового апарату шлунково-кишкового тракту периферичної нервової системи та ін. Україна надзвичайно багата природними лікувальними ресурсами. Поряд із уже діючими родовищами мінеральних вод і грязей щорічно відкриваються нові. Впровадженню цих родовищ у лікувальну практику відповідно до Закону України "Про курорти" повинне передувати попереднє дослідження щодо вивчення їхніх фізико-хімічних властивостей нешкідливості спрямованості та характеру біологічної активності тобто повноцінне доклінічне дослідження в експерименті. В Українському НДІ медичній реабілітації та курортології МОЗ України накопичено багаторічний досвід і розроблені методологічні підходи для оцінки загальної біологічної дії природних лікувальних факторів мінеральні води напої на їхній основі пелоїди воски глини та ін. в експерименті що і лягло в основу створення цього посібника. Особливістю пропонованого методологічного підходу є те що оцінка біологічного ефекту того чи іншого природного лікувального засобу не обмежується використанням загальноприйнятих методів оцінки нешкідливість та інші а й запропоновано апробований авторами комплекс показників що характеризують реакції на вплив з боку морфо-функціональних структур органів і тканин реакцію з боку імунної системи й окремих ланок метаболізму. Підхід який запропоновано дозволяє розширити діапазон одержаних характеристик біологічної дії нових джерел природних лікувальних засобів та дати наукове обґрунтування рекомендацій для їх подальшого випробування. Застосування уніфікованих адекватних методик у комплексному доклінічному дослідженні лікувальних засобів дозволить науково обґрунтувати та розробити диференційовані рекомендації для подальшого їх клінічного випробування з метою з'ясування їхньої ефективності та нешкідливості. Даний методичний посібник розраховано на працівників спеціалізованих закладів в яких можуть проводитись доклінічні випробування лікувальних засобів природного походження з метою встановлення або підтвердження їхньої ефективності та нешкідливості. Він дає можливість уніфікувати методичні підходи з метою отримання порівнюваних результатів досліджень проведених у різних науково-дослідних лабораторіях та медичних центрах. Усі наведені у посібнику методики затверджені Головним державним санітарним лікарем України О.О. Бобильовою у методичних вказівках "Методи дослідження природних та преформованих лікувальних засобів: мінеральні природні столові лікувально-столові лікувальні води та напої на їхній основі; штучно-мінералізовані води; пелоїди; розсоли та препарати на їхній основі" Міністерством охорони здоров'я та Державним фармакологічним центром у методичних рекомендаціях "Доклінічні дослідження специфічної активності та нешкідливості мінеральних вод" [1]. Глава 1 ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ЛІКУВАЛЬНИХ ЗАСОБІВ ПРИРОДНОГО ПОХОДЖЕННЯ Лікувальні засоби природного походження широко впроваджуються в амбулаторне санаторно-курортне та позакурортне лікування як найпопулярніша немедикаментозна терапія. Сюди відносяться мінеральні води та напої на їхній основі штучно-мінералізовані води пелоїди розсоли глини воски та препарати на їхній основі. Ці засоби перед усе об'єднує їх походження. Всі вони - мінеральні тобто народженні в надрах Землі. Мінеральними водами що застосовуються з лікувальною метою за визначенням В.В. Іванова та Г.О. Невраєва [2] називаються "природні води які містять у підвищених концентраціях ті або інші мінеральні рідше органічні компоненти та гази або яким притаманні будь-які фізичні властивості радіоактивність реакція середовища тощо і які справляють на організм людини лікувальну або профілактичну дію - на відміну від дії прісної води". Основним критерієм специфічної дії лікувальних мінеральних вод є загальна мінералізація - не менше 1 г/дм3 а менш мінералізовані мінеральні води використовуються в медичній практиці при наявності в них специфічних компонентів та сполук у концентраціях не нижчих за визначені величини. Крім того слід враховувати правильність вибору їх типу для кожного патологічного стану з урахуванням стадії захворювання і особливостей його перебігу. Це визначає необхідність докладного дослідження властивостей мінеральних вод. Дослідженнями провідних курортологів виявлені особливості впливу притаманні водам різного складу які містять іони магнію кальцію натрію калію сульфатів хлоридів гідрокарбонатів органічних сполук в тому числі органічного йоду як при їх одноразовому так і курсовому застосуванні. Води які містять гідрокарбонати мають високу буферну ємність і нейтралізуючий ефект; ті які містять хлориди - сприяють активізації шлункової секреції відновленню ендокринної регуляції діяльності шлунково-кишкового тракту ті які містять магній і сульфати - сприяють нормалізації рівня холестерину і холекінетичну дію; ті які містять цинк сприяють нормалізації вуглеводного обміну йодовані води поліпшують стан нейро- ендокринно-імунної регуляції. Особливе місце серед мінеральних лікувальних і лікувально-столових вод займають води з підвищеним вмістом органічних речовин. Основну масу їх складають гуміни бітуми нафтенові та жирні кислоти феноли. Механізм дії органічних речовин до кінця не вивчений. Існує ряд гіпотез про суть їх впливу на організм у складі мінеральних вод. Одна з них висунута вченими які вивчають бальнеологічну природу широко відомої слабомінералізованої води Трускавецького курорту - "Нафтуся". На даний час вона є найбільш яскравим представником цілого класу таких вод. Гіпотеза полягає у розгляді органічних речовин мінеральних вод як ксенобіотиков. Тільки з цієї позиції на думку авторів можна пояснити однакові в принципі показання для їх застосування. Ці води володіють здатністю вибірково впливати на біосинтез або активацію ферментів монооксигеназної системи що призводить до корекції процесів біотрансформації фізіологічно активних речовин в організмі в результаті суттєво підвищується інтенсивність секреції жовчі вмісту в ній жовчних кислот і холатів знижується холестерин підвищується індекс літогенності жовчі. Враховуючи що монооксигенази окрім печінки локалізуються також в нирках легенях кишечнику є підстава вважати що в результаті дії органічних речовин які містяться в мінеральній воді підвищується детоксикоційна здатність всього організму. Такі води мають діуретичний ефект викликають поліпшення при хронічних захворюваннях ситем сечовиділення травлення при цукровому діабеті подагрі ожиренні анемії. Мікроелементам які знаходяться у воді належить певна а іноді особливо при внутрішньому застосуванні води і провідна роль. Встановлена біологічна дія миш'яку заліза кобальту міді марганцю йоду брому кремнію у складі мінеральних вод. Оцінка лікувальних властивостей мінеральної води повинна проводитись на основі експериментально-клінічних досліджень. На доклінічному етапі досліджень використовують методики спрямовані на визначення функціонального стану органів-мішеней а саме печінки шлунку нирок крові тощо. Позитивні зміни показників що висвітлюють стан печінки та нирок під впливом навантажень тварин мінеральною водою свідчать про наявність у цій воді біологічної активності. В цьому випадку продовжують доклінічні випробування мінеральної води і приєднуються методики які демонструють нешкідливість прийому води. В подальших дослідженнях методики підібрані для встановлення механізму стимулюючої дії кожної конкретної води. Ці комплекси складаються з наведених методик відповідно до встановленого типу вод. Від нього залежить й моделювання патологічного процесу корекція якого прогнозується впливом мінеральної води яка досліджується. В цьому випадку розширюється набір біохімічних методик додаються морфологічні та імунологічні дослідження. Пелоїди відносяться до найбільш ефективних природних лікувальних факторів що мають значний протизапальний десенсибілізуючий анальгезуючий імуномодулюючий та ін. ефекти. Різноманітні види пелоїдотерапії аплікації електрогрязь екстракти отримані з грязей широко використовуються у лікуванні захворювань опорно-рухового апарату шлунково-кишкового тракту периферійної нервової системи гінекологічної патології тощо. Біологічну дію пелоїдів поділяють на місцеву та загальну. Місцева дія грязей - сукупність змін що спостерігаються у шкірі та слизових оболонках у місці їх зіткнення з пелоїдом. Багаточисельні роботи дослідників у минулому та у теперішній час показали що під впливом пелоїдів у шкірі виникає активація метаболічних процесів накопичення глюкозоаміноглюканів та глікогену; підвищується активність лужної фосфатази ти знижується активність гіалуронідази. Має місце накопичення фібробластів та підвищення їх колагенсинтезуючої функції. У епідермісі шкіри ти епітелії слизистих накопичуються рибонуклеопротеїди та підвищується вміст лімфоїдних елементів які емігрують з судинного русла а також підвищується їх функціональна активність. Вищеперелічені зміни сприяють зміцненню захисних механізмів шкіри та слизистих. У основі загальної лікувально-профілактичної дії пелоїдів лежить їх здатність стимулювати захисно-пристосувальні реакції адаптаційні процеси що сприяє формуванню стійкості організму до впливу несприятливих факторів ендо- та екзогенного походження [3]. Показано що під впливом пелоїдів відбувається активація функції коркового та мозкового шарів надниркових залоз стимуляція функції РЕС зменшення проникності судин та кліткових мембран активація окислювально-відновлювальних та біоенергетичних процесів що лежать в основі мобілізації компенсаторно-відновлювальних процесів та обумовлює лікувально-профілактичний ефект даного курортного фактору [4]. В основному відрізняють [5] три типи грязей - мулові сульфідні що утворюються на дні солоних водойм море лимани ; торфи що утворюються за рахунок гниття вищих рослин та вміщують велику кількість органічних сполук мають кислу рН; сапропелі які утворюються на дні прісних водойм за рахунок розкладання нижчих рослин мають нейтральну рН та не вміщують сірководню. Загальновизнано [6; 7] що основними діючими факторами лікувальних грязей є температурний механічний та їх хімічний склад. Не менш важливе місце посідає біологічна дія різноманітних хімічних компонентів пелоїдів. До них належать сірководень низькомолекулярні жирні кислоти феноли бітумні речовини воски аміак жири фосфоліпіди вуглеводи антибіотичні речовини. Особливе значення надається наявності гумінових кислот - високомолекулярних з'єднань які утворюються з продуктів розпаду різних рослинних організмів. Окремими авторами визнається присутність в пелоїдах естрогенів показником чого є поява тічки у статевонезрілих мишей після торфової ванни. У дії пелоїдоаплікації на організм виділяються дві фази: перша обумовлена температурою грязі та друга - визначається впливом хімічних факторів проникаючих через шкіру. При цьому інтенсивність проникнення хімічних компонентів у більшій мірі визначається температурою аплікації. Разом з тим температурний фактор що є одною з основних складових частин комплексної дії пелоїдопроцедури не можна вважати вирішальним у прояві лікувального ефекту пелоїдів. Не меншу важливість має дія хімічних компонентів лікувальних грязей [8]. Про важливу роль хімічного фактору в прояві терапевтичного ефекту пелоїдів свідчить наступне: 1 одержання лише тимчасового ефекту при використанні нагрітих до температури грязі глини подрібненого паперу грілки та ін.; 2 відсутність належного ефекту при накладенні грязьових аплікацій через целофан який перешкоджає проникненню біологічно активних речовин у організм експериментальних тварин; 3 досягнення значного терапевтичного ефекту при використанні різноманітних екстрактів отжимів розчину пелоїду фармакологічних препаратів грязі гумізоль гумінат натрію тощо ; 4 ефективність застосування холодної грязі наприклад у вигляді тампонів у гінекологічних хворих. Наявні ряд експериментальних досліджень у яких було показано що різниця у хімічному складі лікувальних грязей суттєво відбивається на прояві їх біологічної дії. Цей стан може бути проілюстровано такими прикладами. Установлено [9] що Сапожківський торф який відрізняється різко кислим рН 1 2-2 9 од. рН призводить до значного зниження рівня адреналіну та норадреналіну у надниркових залозах щурів тоді як використання Самбуканської мулової грязі рН 7 2-7 4 од.рН при однаковій температурі аплікацій супроводжується стимуляцією гормоноутоворюючої функції мозкового шару надниркових залоз. Виявлені розбіжності у проявах протизапального ефекту між пелоїдами з низьким вмістом сірководню та пелоїдами Куяльницького родовища. Протизапальна активність грязей Солоного лиману Дніпропетровська обл. де вміст сірководню був у 10 разів нижче ніжу грязях Куяльницького лиману була незначна. Таким чином приведені дані про важливу роль хімічного складу грязі у прояві різноманітних сторін їх дії визначає необхідність проведення оцінки біологічної активності кожного вперше відкритого родовища лікувальних грязей. Це у повній мірі відноситься і до джерел мінеральних вод восків глин та ін. природних лікувальних засобів. Методи дослідження лікувальних грязей для визначення біологічної активності і безпеки відбираються з огляду на вимоги пропоновані до первинного дослідження лікарських речовин: швидкість одержання результатів їхня вірогідність і мінімум матеріальних витрат. У якості піддослідних тварин відбираються для використання білі лабораторні щурі. При плануванні експериментів враховуються етичні норми роботи з тваринами. Насамперед це відноситься до добору методик що повинні дати швидкий достовірний результат не приносячи болючих відчуттів що можуть виникнути у тварин при різних експериментальних впливах. Методики математичні моделі і статистичний аналіз повинні бути спрямовані на скорочення числа використовуваних тварин особливо при проведенні "гострого досліду" що призводить до загибелі тварини. Виходячи з цих принципів нами пропонується наступний перелік методик які належить виконувати при досліджені дії природних лікувальних факторів. Функціональний стан центральної нервової системи оцінується за показниками зміни поведінкових реакцій в установці "відкрите поле". Крім того для визначення механізму ізучаємих впливів використовується метод комп'ютерної електрокортикографії [10]. Для оцінки функціонального стану печінки представляється доцільним вивчення проміжного обміну за активністю ферментів аланінамінотрансферази - АлТ та аспаргінамінотрансферази - АсТ переамінування - процесу який є центральною магістраллю білкового обміну та найважливішою ланкою інтеграції усіх видів метаболізму білкового вуглеводного ліпідного . Важливим є також визначення рівня загального білірубіну та його фракцій вільного та зв'язаного як показників акумуляції кон'югації та метаболізму білірубіну які віддзеркалюють жовчеутворюючу функцію печінки. Для оцінки секреторної функції підшлункової залози пропонується дослідження активності ферменту гліколізу - глікогену-альфа-амілази. Для дослідження впливу природних лікувальних факторів на функціональний стан нирок запропоновано крім вивчення кліренсу - креатиніну експрес-тестування визначення рівня сечовини у крові як одного з найбільш надійних критеріїв оцінки функціональних зрушень у канальцево-реабсорбційної системі нирок. У комплекс біохімічних досліджень по вивченню біологічної дії природних курортних засобів доцільне включення системи перекісного окислення ліпідів ПОЛ яке дозволяє виявити шкідливу дію досліджувальних факторів. З цією метою запропоновано визначення метаболітів перекисного окислення ліпідів малонового діальдегіду надлишкове накопичення яких призводить до порушення метаболізму та деструкції кліткових мембран. Оцінка біологічної дії різноманітних природних або преформованих чинників неможлива без встановлення структурно-функціональних змін які можуть відбуватися в органах-мішенях під впливом цих чинників. Здійснити таку оцінку перш за все можливо за допомогою вивчення гістологічних препаратів. Гістологічні методи забарвлення тканин дозволяють встановити стан паренхіми органів які вивчаються стан цитоплазми та ядра клітин характер та розподіл хроматину у ядрі наявність вакуолей та вкраплень цитоплазми а також зміни в сполучної тканині цих органів стан колагену та еластичної тканини; стан фіброцитів; стан специфічних волокон . Особливе значення під час встановлення впливу природних чинників має оцінка змін в судинному руслі це стосується як великих судин так і судин мікроциркуляторного русла. Це важливо бо стан цієї системи впливає на кровообіг в органах та тканинах та відповідно на постачання субстратів і на виведення токсичних метаболітів. Крім того оцінка структурно-функціональних змін у органах-мішенях потребує визначення вмісту біологічно-активних речовин та ксенобіотиків насамперед важких металів . Оцінювати стан метаболізму на клітинному рівні неможливо без визначення активності ферментів базових реакцій механізмів енергоутворення насамперед окислювально-відновних ферментів. В даному Посібнику наведено методи гістологічних гістохімічних та гістоензімологічних досліджень тканин з органів-мішеней які дозволяють встановити базові структурно-функціональні зрушення що відбуваються в цих органах під впливом досліджуваних факторів. Для оцінки впливу природних лікувальних факторів на імунну систему запропоновано ряд показників що характеризують реакцію з боку неспецифічних механізмів імунологічного захисту. Запропоновано визначення фагоцитарної активності нейтрофілів периферичної крові як за кількістю активних фагоцитів так і за їх метаболічною активністю що визначається в НСТ-тесті. Крім того доцільне визначення вмісту гетерофільних природних антитіл та активності комплементу-фактору крові який приймає участь у реалізації більшості імунологічних реакцій. Дослідження цих показників дозволяє в певному ступені оцінити вплив досліджуємих факторів на формування адаптаційно-пристосувальних реакцій. У комплекс імунологічних досліджень включені також тести що дозволяють визначити наявність шкідливої дії досліджуваних природних факторів на органи та тканини. З цією метою запропоновано визначення вмісту у сироватці крові антитіл до антигенів приготовлених з органів-мішеней експериментальних тварин нирки печінка та ін. та визначення вмісту у сироватці крові циркулюючих імунних комплексів ЦІК - показника як інтенсивності специфічної імунної відповіді так і ступеню їх елімінації з організму клітинами моноцитарно-макрофагової системи. Глава 2 МЕТОДИЧНІ ПІДХОДИ ДО ВИЗНАЧЕННЯ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ЗАСОБІВ ПРИРОДНОГО ПОХОДЖЕННЯ 2.1 МЕТОДИ ЗАСТОСУВАННЯ ДОСЛІДЖУВАНИХ ЗАСОБІВ В ЕКСПЕРИМЕНТІ Для виявлення біологічної активності засобів природного походження в експерименті використовуються білі щури лінійні і нелінійні з масою тіла 180-200 г незалежно від статі. Під час експерименту тварини мають знаходитись за умов віварію харчовий та питний режими підтримуються постійними на повсякденному рівні. 2.1.1. Введення мінеральних вод та напоїв на їхній основі в організм тварин методом зондування Досліджувану мінеральну воду чи напої на її основі вводять білим щурам у шлунок додатково до питного режиму водне навантаження за допомогою зонду діаметром 1 0-1 5 мм. Добова доза досліджуваної води обов'язково мусить становити 1 % від маси тіла тварини і розраховуватися індивідуально. Водне навантаження проводиться 1 раз на добу у вечірній час близько 17 годин з урахуванням біологічних ритмів тварин. Відбір біологічного матеріалу жовч кров здійснюється через 16-18 годин після навантаження сеча збирається за добу у спеціальних клітках. Для розробки медичних показань для клінічної апробації проводять курсове навантаження яке становить для цього виду експериментальних тварин 6 діб. 2.1.2 Дермальний шлях введення речовин що входять до складу засобів природного походження пелоїди розсоли глини та ін. В експериментальних дослідженнях щодо визначення біологічної активності та безпеки засобів природного походження полоїди розсоли глини та ін. які застосовуються зовнішньо досліджується дермальний шлях їх проникнення до організму. Для цього використовують метод занурення хвоста щура. У білих щурів хвіст є єдиною частиною тіла яка не вкрита смухом і в який знаходиться значний судинний пучок. Дослідження дермального шляху починають з розміщення щура в клітку-пенал який обмежує його рухомість. Через 10-15 хвилин після розміщення щура в клітки-пеналі коли він заспокоюється його хвіст на 2/3 довжини занурюється на 2 години у досліджувальну речовину. Температура речовини підтримується постійною і відповідає температурі тіла тварини 39-40 ?С . Після закінчення сеансу впливу хвіст ополіскують теплою водою і здійснюють візуальну оцінку його стану. 2.1.3 Метод аплікацій для введення в організм тварин засобів природного походження Пелоїди підігрівають на водяній бані до температури 40 ± 0 5 ?С. На спині тварини епілюють дільницю шкіри площею 4 0 х 4 0 см верхня межа цієї площини - нижня межа лопаток. На острижену зону накладають пелоїдний коржик масою 5 0 ± 0 5 г накривають його поліетиленовою плівкою. Щура замотують з головою в чисту м'яку бавовняну ганчірку імітуючи його перебування у норі. Термін аплікації 15-20 хвилин. По завершені сеансу аплікацій тварину звільнюють від коржику ополіскують ділянку теплою водою. У контрольній групі в аналогічних умовах накладається запарена манна крупа. Глава 3. ПЕРЕЛІК МЕТОДИК КОМПЛЕКСНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ БІОЛОГІЧНОЇ ДІЇ МІНЕРАЛЬНИХ ВОД 3.1 ФІЗІОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ 3.1.1 Оцінки функціонального стану органів та систем 3.1.1.1 Проведення поведінкових тестів Загальна дія на організм тварин досліджувальних засобів оцінюється за даними поведінкових реакцій щурів збудливість реактивність настороженість полохливість ; нервово-м'язової збудливості присутність тремору судом рефлексів положення порушення ходи тест Штрауба інтенсивність больової реакції положення тіла та кінцівок оцінка тонусу скелетних м'язів ; інтенсивності рефлексів роговидного слухового проходу ; вегетативних ефектів величина зіниць салівація тонус судин вуха частота дихання серцевих скорочень термометрія . Збудження білих щурів оцінювалось за загальним рівнем рухомої активності ступенем їхньої агресивності. Реактивність щурів обумовлена характером реакції тварин на зміну довкілля пересування на відкритому столі на майданчику з перетинкою та отворами у ній тощо . Переляканість щурів оцінюється при проведенні обережних стандартних маніпуляцій торкання корнцангом . Нервова м'язова збудливість оцінюється за відсутністю тремору судоми непорушені "рефлекси положення". Відсутність порушень ходи вказує на відсутність змін тонусу скелетних м'язів. "Тест Штрауба" характеризує ступень збудження спинальних мотонейронів відповідальних за регуляцію тонусу м'язів хвоста. Вегетативні ефекти оцінюються за частотою дихання та серцевих скорочень. 3.1.1.2 Метод тестування тварин у "відкритому полі" Для оцінки особливостей поведінки піддослідних тварин і їх реакцій на перебування в умовах хронічного емоційного стресу оцінювалися психофізіологічні параметри в тесті "відкрите поле" Walsh Cammins 1976 . Тест "відкрите поле" широко застосовується для дослідження особливостей поведінки руховій активності і емоційності у щурів. Тестування щурів в "відкритому полі". Експериментальна установка "відкрите поле" є квадратною камерою розміром 80х80 см стінками заввишки 40 см стінки непрозорі . Підлога розділена на 16 квадратів в кожному з яких є круглі крізні отвори - "норки". Відкрите поле під час експерименту рівномірно освітлює лампою потужністю 100 Вт розташованою по центру поля на висоті 70 см. Поведінку кожного щура тестують на протязі 5 хвилин. Поведінковими показниками є: - горизонтальна рухова активність кількість перетнутих квадратів . Згідно з літературними даними нормою є 32 1 ± 1 73 перетнутих квадратів за 3 хвилини; - виходи в центр; - вертикальні стійки норма 18 2 ± 1 1 за 3 хвилини; - "рефлекс нірки" норма 13 2 ± 1 0 за 3 хвилини; - дефекація та діурез; - тривалість грумінгу та завмирання виражене в секундах. Причому дефекація і перебігання розглядалися як величини пов'язані з проявом емоційності у гризунів. Особливості поведінки щурів в "відкритому полі" є прогностичним критерієм стану ЦНС. Переміщення тварини щура в нову обстановку веде до виникнення дослідницької поведінки яка супроводжується пасивно-оборонною поведінкою. Його характерним проявом вважається вегетативна реакція у вигляді дефекації та діурез а також зміна рівня руховій активності. Не дивлячись на зменшення страху активність тварини до кінця досвіду знижується. Кращим проявом зменшення страху у тварин є дослідження ними внутрішніх секторів яке поступово стає інтенсивнішим від досвіду до досвіду. Даний тест є достатнім для первинної оцінки дії природних ресурсів. Вихід в центр По методиці "відкрите поле" однієї з характеристик дослідницько-орієнтувальній поведінки щурів є вихід в центр його визначають по кількості перетнутих центральних секторів площі. Потрапивши в незнайому обстановку тварина відчуває страх: при цьому воно прагне знаходитися і пересуватися уздовж стінки або сидіти на периферії майданчика. Переконавшись у безпеці обстановки щур може вийти до центральних секторів. Вертикальні стійки Аналіз дослідницької та орієнтувальної поведінки щурів в тесті "відкрите поле" по показнику "вертикальні стійки" розкриває мотиваційну складову характеристики тварин. При цьому вони намагаються вийти в непрямий контакт з предметами розташованими на відстані: щури принюхуються до предметів розташованих за межами відкритого поля. Рефлекс нірки Різновидом дослідницької та орієнтувальної поведінки щурів ДО є показник норкового рефлексу щурів який свідчить про здатність тварини досліджувати відкрите поле зокрема заглядати в норки. Косметична поведінка щурів Грумінг косметична поведінка щурів є важливою характеристикою поведінки тварин в "відкритому полі". Більш того щури велику частину часу приділяють вичісуванню свого тіла в порівнянні з переміщенням. На думку фахівців які досліджували спектр поведінки щурів грумінг тісно пов'язаний з руховою активністю. Дефекація Рівень емоційного стану щурів оцінюється по кількості дефекації. АПР Спонтанні "атипові" поведінкові реакції АПР "атипій" представлені гетерогенною групою поведінкових патернів які рідко зазвичай < 5 % зустрічаються у всіх поведінкових моделях стресу їх контролюють різни медіаторні системи що призводить до труднощів їх коректного аналізу і інтерпретації. Проте у ряді випадків АПР можуть служити важливими маркерами стресу і свідчити про серйозні поведінкові і неврологічні порушення. Таким чином особливостями АПР є: 1 низька спонтанна частота; 2 некоректність тобто явна невідповідність поведінки до ситуації; 3 підвищення вірогідності АПР при стресі або при різних порушеннях ЦНС. Найчастіше до АПР що зустрічаються можна віднести: позіхання з підтяганням або без аномальний грумінг див. далі чесання поза аутогрумінгового контексту спонтанний вокаліз жування вібриссів маніпуляції з дефекаційними болюсами гру з хвостом tail rattling "гуркіт хвостом" що зазвичай є частиною антагоністичної поведінки "залякування". Іншим прикладом АПР є жування неїстівних предметів як зсунута реакція що активується при стресі. У поведінкових моделях спостерігається така форма АПР як гризіння або облизування обладнання - наприклад вертикальних поверхонь хрестоподібного лабіринту найчастіше ребер його стінок з центру лабіринту а також поїдання дефекаційних болюсов і лизання плям сечі щури миші . Такі поведінкові акти відрізняються крайньою нетривалістю 2-3 с . Схожу категорію АПР складають маніпуляції з болюсамі дефекації - зокрема перенесення зубами на відстань до 15 см у мишей лінії С57 а також обнюхування переміщення лапами і лизання болюсів щури миші . Аномальний грумінг є важливим чинником АПР і істотно відрізняється від звичайного грумінгу тим що виявляється в поведінкових моделях і ситуаціях коли грумінговая активність фізично утруднена через специфіку стресу вживаного в моделі тривожності або депресії. 3.1.1.3 Метод визначення артеріального тиску у щурів В хронічних дослідах артеріальний тиск реєструється у щурів методом плетизмографії хвоста. Засоби вимірювальної техніки пристрої. апарат Риварочі ртутний ; плетизмографічна манжетка; гумові повітряні капсули; клітка-пенал. Підготовка до вимірювання. Щури розташовуються в клітках-пеналах за 15-20 хвилин до вимірювання хвіст залишається зовні клітки. Коли тварина заспокоїться на основання хвосту накладають плетизмографічну капсулу і наповнюють капсули в неї повітрям до тих пір доки меніск ртутного стовбура не почне ритмічно коливатися. Плетизмографічний метод вимірювання. Хвіст з накладеною капсулою фіксують у руці. В манжетку нагнітають повітря доки меніск ртутного стовбура не перестане пульсувати. Після цього під контролем ока дуже повільно випускають повітря з манжетки. Значення висоти ртутного стовбура при цьому відповідає АТ у даного щура. Вимірювання здійснюють тричі. В нормі величина артеріального тиску складає 90-130 мм рт. ст. 3.1.1.4 Метод визначення частоти дихання та частоти серцевих скорочень у щурів Метод засновано на пальпаторному підрахунку коливань грудної клітини щурів та пульсації серця. Для здійснення вимірювань щура розміщують на поверхні столу та прикривають та фіксують правою долонею так щоб великий та вказівний пальці були розміщені вздовж грудної клітини. Декілька хвилин пальпаторно визначають наявність дихальних рухів грудної клітини. Коли ці рухи фіксуються досить чітко починають їх лічити на протязі 10 секунд. Час обліку фіксують секундоміром. Вимірювання здійснюють тричі. Потім середню трьох вимірювань збільшують у шість разів і таким чином визначають частоту дихання. В нормі частота дихання 110-115 за одну хвилину. При підрахунку частоти серцевих скорочень лічать не рухи грудної клітини а пульсацію серця. Частота серцевих скорочень у щурів складає залежно від віку от 320 до 500 ударів за хвилину. 3.1.1.5 Термометрія Вимірювання температури тіла у щура проводять за допомогою мініатюрного термометра який уводять у пряму кишку. Тварин при цьому фіксують у клітці-пеналі. Середня температура тіла здорових щурів 38 5-39 5 ?С. 3.1.2 Експрес-тестування функціонального стану печінки Визначення сумарних жовчних кислот та холатів Діапазони вимірювань сумарної концентрації жовчних кислот та холатів представлені у таблиці. № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сумарна концентрація жовчних кислот та холатів у жовчі Від 100 0 до 200 0 мг/100 мл Від 200 0 до 300 0 мг/100 мл Від 300 0 до 400 0 мг/100 мл Від 400 0 до 500 0 мг/100 мл Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань сумарної концентрації жовчних кислот та холатів у жовчі які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Жовч білих щурів Від 100 0 до до 200 0 мг/100мл 0 35 Сумарна Від 200 0 до до 300 0 мг/100мл 0 32 концентрація Від 300 0 до до 400 0 мг/100мл 0 30 жовчних кислот та Від 400 0 до до 500 0 мг/100мл 0 25 холатів у жовчі Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви. розчини й матеріали Фотоколориметр або спектрофотометр; термостат; центрифуга лабораторна; ареометр загального призначення 1 84 г/см3; центрифужні пробірки 10 0 см3; хімічні пробірки 20 см3; мірні колби ємністю 100; 1000 см3; циліндри ємністю 10; 100; 500; 1000 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1 0; 5 0 см3 за ГОСТ 20292; дозатори піпеткові 0 1; 0 5 см3. Реактиви та матеріали для проведення досліджень: Спирт етиловий 96°; Фурфурол концентрований ч.; Кислота сірчана концентрована густиною 1 84 г/см3 х.ч.; Вода дистильована. Метод вимірювань Метод основується на визначенні сумарної кількості жовчних кислот та холатів шляхом осадження білка у пробі з послідуючим інкубуванням зразку суміші фурфуролу та сірчаної кислоти. В результаті реакції отримуємо забарвлений комплекс інтенсивність забарвлення якого визначається фотометруванням. Підготовка до виконання вимірювань Приготування 1 % розчину фурфуролу: відмірюють 1 см3 концентрованого фурфуролу переносять у мірну колбу на 100 см3 та дистильованою водою доводять до мітки. Приготування 80 % розчину сірчаної кислоти: у термостійкій колбі до 480 см3 дистильованої води обережно додають 520 см3 концентрованої сірчаної кислоти густиною 1 84 г/см3 Виконання вимірювань У центрифужну пробірку наливають 4 5 см3 96° спирту та додають 0 5 см3 жовчі змішують та центрифугують при 2000 об/хв 5 хв. У хімічну пробірку наливають 0 1 см3 центрифугату додають 0 5 см3 1 % розчину фурфуролу та 3 0 см3 80 % сірчаної кислоти. Суміш інкубують у термостаті при 60 ± 1 °С 20 хв охолоджують та фотометрирують при довжині хвилі 490 нм у кюветі з товщиною шару 5 мм як контроль використовують дистильовану воду. Обробка результатів Формула розрахунку концентрації жовчних кислот Сжк Сжк = 125 о Едосл о Р де 125 - постійна величина; Едосл - екстинція дослідної проби; Р - розведення жовчі 10 разів . Визначення холестерину жовчі Діапазони вимірювань Діапазони вимірювань холестерину жовчі або крові наведені у таблиці № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1. 2. 3. Жовч Кров Концентрація холестерину Від 5 0 до 10 0 мг/100 мл Від 10 0 до 15 0 мг/100 мл Від 15 0 до 20 0 мг/100 мл Від 20 0 до 30 0 мг/100 мл Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань концентрації холестерину в жовчі та крові які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Жовч Від 5 0 до 10 0 мг/ 100 мл 0 50 кров білих щурів Від 10 0 до 15 0 мг/ 100 мл 0 45 Концентрація Від 15 0 до 20 0 мг/ 100 мл 0 42 холестерину Від 20 0 до 30 0 мг/ 100 мл 0 30 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотоколориметр або спектрофотометр; Ваги лабораторні 2 кл ГОСТ 24104; Баня водяна; Ареометр загального призначення 1 84 г/см3; Посуд мірний лабораторний скляний: хімічні пробірки ємністю 20 см3 50 см3 мірні циліндри ємністю 25 см3; колби ємністю 100 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1 0; 2 0; 5 0 см3 за ГОСТ 20292. Реактиви та матеріали для проведення досліджень: Зневоднений хлороформ ч; Ефір для наркозу зневоднений Р97/147/27; Ангідрид оцтовий ч.д.а.; Калію гідроксид ч.д.а.; Кислота сірчана концентрована густиною 1 84 г/см3 х.ч.; Стандартний розчин холестерину у хлороформі; Спирт етиловий ректифікований; Вода дистильована. Метод вимірювань Принцип методу основується на здатності холестерину давати з оцтовим ангідридом в присутності концентрованої сірчаної кислоти зелене забарвлення. Підготовка до виконання вимірювань Приготування 10 % розчину калію гідроксид нестійкий зважують на вагах 2 0 г калію гідроксиду переносять у мірний циліндр додають 96 ? етиловий спирт розчиняють доводять піпеткою до мітки 20 см3. Підготування стандартних розчинів холестерину Зважують 100 мг холестерину переносять у мірну колбу на 100 см3 додають трохи хлороформу розчиняють та доводять хлороформом до мітки. Отримують вихідний стандартний розчин. Перед дослідом готують робочий стандартний розчин холестерину. Приготування робочого стандартного розчину холестерину Піпеткою набирають 1 см3 вихідного стандарту холестерину з відомим холестерину та переносять його в пробірку додають 9 0 см3 хлороформу та отримують робочий розчин стандарту. Відпирають піпеткою 3 0 см3 робочого стандартного розчину холестерину вносять в пробірку додають 2 см3 хлороформу 2 см3 оцтового ангідриду 10-12 крапель концентрованої сірчаної кислоти струшують. Залишають в темному місці на 25 хв та колориметрують як і дослідну суміш. Виконання вимірювань У хімічну пробірку наливають 1 0 см3 жовчі крові додають по 1 0 см3 дистильованої води та 10 % розчину гідроксиду калію переносять у киплячу водяну баню та витримують при кипінні 1 годину. Охолоджують. Після охолодження в пробірку додають тричі по 3 см3 зневодненого ефіру кожний раз енергійно перемішують екстрагують 2-3 хв. Ефірні екстракти зливають в хімічні пробірки об'ємом 50 см3 випарюють на бані до отримання сухого залишку. В охолоджені пробірки додають 5 см3 для крові 10 см3 зневодненою хлороформу. При визначенні в крові розчин фільтрують. Потім додають 2 см3 оцтового ангідриду та 10-12 крапель концентрованої сірчаної кислоти ретельно перемішують та витримують 25 хв при кімнатній температурі у темному місці потім фотометрирують при довжині хвилі 670 ± 10 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм як контроль використовують дистильовану воду. Обробка результатів вимірювань Вміст холестерину мг/100 мл розраховують за формулою Х= 0 3 х Едос х 100 де Ест 0 3 - концентрація холестерину в стандартному розчині мг; Едос - екстинція дослідної проби; Ест - екстинція стандартної проби. Розрахунок літогенного індексу жовчі Для розрахунку індексу літогенності жовчі обчислюємо вміст М у жовчі сумарної кількості жовчних кислот та холатів СЖКХ а також вміст холестерину хол . Для цього помножують концентрації С цих показників на об'єм виведеної за дослід жовчі у мл/100 г маси тварини V за формулою С х V = М Співвідношення Мсжкх/Мхол є індексом літогенності жовчі підвищення його вважається позитивним ефектом який запобігає утворенню конкрементів у жовчі. Оцінюючи функціональний стан печінки слід насамперед звернути увагу на наявність жовчогінного ефекту після введення мінеральної води. Для уніфікації цього показника є обов'язковим визначення відношення кількості виділеної жовчі до маси тіла тварини мл/100 г маси а також обов'язкове дотримання відрізку часу не менше ніж 18-20 годин після водного навантаження у який тварини мають бути без їжі і води. Окрім жовчогінного ефекту навіть без його наявності мінеральні води стимулюють жовчоутворення. Потрібно враховувати співвідношення сумарних жовчних кислот та холатів до холестерину жовчі. Це співвідношення характеризує літогенність жовчі і ступінь насичення її холестерином. Підвищення рівня білірубіну та холестерину у жовчі і крові свідчить про функціональні порушення печінки. 3.1.3 Експрес-тестування функціонального стану нирок Механізм сечоутворення щодо парцеальних функцій нефрону Метод основується на порівнянні вмісту креатиніну у сечі та крові а тому був названий геморенальною пробою. Якщо відома концентрація у плазмі крові креатиніну який виділяється нирками то знаючи скільки його знаходиться у сечі можна судити про "продуктивність" нирок тобто про їхню здатність витягувати означену речовину. Чим більша різниця між концентрацією креатиніну у сечі та плазмі за інших рівних умов тим активніше очищується кров від цієї речовини. Для характеристики очищувальної здатності нирок користуються умовним показником який має назву "коефіцієнт очищення кліренс ". Припустимо концентрація креатиніну у сечі дорівнює "U" а в плазмі - "Р". Нехай діурез за 1 хв дорівнює "V". Тоді за 1 хв з сечею виділяється UV креатиніну. Якщо цю величину розділити на концентрацію речовини у плазмі отримуємо об'єм плазми С який містить UV креатиніну С = UV / Р де "C" і є коефіцієнт очищення кліренс що вказує який об'єм плазми цілком очищується від означеної речовини за 1 хв. Кількісні показники функціонування нирок які виражені коефіцієнтами очищення залежать від ваги тварини. Оскільки експеримент проводиться нерідко на тваринах різної ваги то для отримання порівнювальних даних отримані величини слід віднести до одиниці поверхні тіла що є більш точним ніж відношення до одиниці ваги. Для щурів може бути використана формула V = 0 09 х3vр2 де V - поверхня тіла м2; р - вага тіла г. Фільтрація первинної сечі в клубочках нефрону розраховується за формулою F = U / R x V За різницею між об'ємами профільтрованої за 1 хв рідини та виведеної сечі легко обчислити об'єм реабсорбованої води виразити його у відсотках до фільтрації R % R% = F-V / F x 100 Враховуючи що F = КV де К - концентраційний індекс означеної речовини R% = КV-V / КV х 100 = V К-1 / КV х 100 = К-1 / К х 100 Таким чином для обчислювання реабсорбції досить знати концентраційний індекс. Речовиною для визначення кліренсу був обраний ендогенний креатинін. В основі методу визначення креатиніну лежить реакція Яффе - утворення оранжево-червоного забарвлення в лужному середовищі з пікриновою кислотою за рахунок часткового відновлювання її в пікринову кислоту. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації креатиніну. Діапазони вимірювань концентрації креатиніну у сироватці крові сечі . № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Кров Від 1000 до 5000 мг/ 100 мл 2 Сеча Від 5000 до 10000 мг/ 100 мл 3 Концентрація Від 10000 до 15000 мг/ 100 мл креатиніну Від 15000 до 20000 мг/ 100 мл Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів пара пальних вимірювань концентрації креатиніну у крові та сечі які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Сеча Від 1000 до 5000 мг/ 100 мл 0 20 Кров білих щурів Від 5000 до 10000 мг/ 100 мл 0 19 Концентрація Від 10000 до 15000 мг/ 100 мл 0 17 креатиніну Від 15000 до 20000 мг/ 100 мл 0 17 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотоколориметр або спектрофотометр; Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104; Ваги лабораторні 4 кл. точності за ГОСТ 24104; Центрифуга лабораторна медична ОПН-8; Баня водяна; Посуд мірний лабораторний скляний: колби ємністю 100 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 2 0; 5 0; 10 0 см3 за ГОСТ 20292; Реактиви та матеріали для проведення досліджень; Кислота пікринова ч; Натрію гідроксид ч.д.а; Креатинін х.ч; Кислота соляна 0 1 М розчин фіксанал; Вода дистильована. Підготовка до виконання вимірювань Приготування насиченого розчину пікринової кислоти: 2 г пікринової кислоти розчиняють у 100 см3 гарячої 70 °С дистильованої води суміш нагрівають на водяній бані . Розчин залишають протягом доби при кімнатній температурі після чого фільтрують. 0 1 М розчин соляної кислоти Розчин готують з фіксаналу. Вміст ампули переносять до колби ємністю 1000 см3 і об'єм розчину доводять дистильованою водою до мітки. Приготування 10 % розчину натрію гідроксиду до 10 г нагрію гідроксиду додають 90 см3 дистильованої води. Приготування основного стандартного розчину креатиніну 8 80 ммоль/дм3 100 мг креатиніну розчиняють у 100 см3 0 1 М розчину соляної кислоти. Зберігають у холодильнику в посуді з притертою пробкою. Для визначення креатиніну у сироватці крові робочий стандартний розчин отримують розведенням основного розчину дистильованою водою в 100 разів 0 088 ммоль/дмЗ . 1 см3 розчину креатиніну містить 0 01 мг креатиніну. Цей розчин не стійкий. Визначення концентрації креатиніну в сечі та крові за методом Поппера Визначення концентрації креатиніну у сироватці крові 2 0 смЗ сироватки змішують у пробірці з 6 0 см3 прозорого насиченого розчину пікринової кислоти. За 5 хв пробірку занурюють на 15-20 с в киплячу водяну баню. Потім вміст пробірки центрифугують при 2000 об/хв або фільтрують . До 4 0 см3 центрифугату додають 0 2 см3 10 %-го розчину NaОН та ретельно перемішують За 10 хв проби колориметрують при довжині хвилі 530 ± 10 нм на зеленому світлофільтрі у кюветі з шириною шару 20 мм результати колориметрування порівнюють з холостою пробою. Інтенсивність забарвлення не змінюється протягом години. Приготування контрольних проб До 3 0 см3 насиченого розчину пікринової кислоти додають 0 2 смЗ 10%-го розчину NaОН та доводять об'єм дистильованою водою до 10 см3. Хід визначення креатиніну у сечі У мірній колбі або циліндрі 100 см3 змішують 0 5 см3 сечі із добової кількості з 3 см3 розчину пікринової кислоти. Суміш ретельно струшують та додають 0 2 см3 10 %-го розчину NaОН. Витримують при кімнатній температурі 10 хв доводять об'єм дистильованою водою до 100 см3 екстинцію вимірюють у кюветі з товщиною шару 10 мм при довжині хвилі 530 ± 10 нм; 550 ± 10 нм результати порівнюють з даними контрольних проб. Приготування контрольних проб До 3 0 см3 насиченого розчину пікринової кислоти додають 0 2 см3 10 %-го розчину NaОН та доводять об'єм дистильованою водою до 100 см3. Для отримання стандартної проби до 0 5 см3 основного 8 80 ммоль/дм3 стандартного розчину який містить 0 5 см3 креатиніну приливають 3 0 см3 розчину пікринової кислоти та 0 2 см3 розчину NaОН. Потім проби оброблюють як і дослідні. Стандартна проба оброблюється так само як і дослідна з тією різницею що замість сироватки беруть 2 0 см3 робочого стандартного розчину. Обробка результатів вимірювань Концентрацію креатиніну розраховують за формулою: X ммоль/дм3 = Едосл / Ест х 0 088 ммоль/дм3 X мкмоль/дм3= Едосл / Ест х 88 мкмоль/дм3 де X - вміст креатиніну в сироватці крові; Едосл - екстинція дослідних проб; Ест - екстинція стандартних проб за винятком значень оптичної густини контрольних проб ; 0 088 ммоль/дм3 88 мкмоль/дм3 - концентрація креатиніну у стандартній пробі. Розраховують концентрацію та добову екскрецію креатиніну за відповідними формулами 1 2 : X ммоль/дм3 = Едосл / Ест х 8 80 ммоль/дм3 де 1 X - вміст креатиніну у сечі; Едосл - екстинція дослідних проб; Ест - екстинція стандартних проб за винятком значень оптичної густини контрольних проб ; 3 80 ммоль/дм3 - концентрація основного стандартного розчину креатиніну X мкмоль/дм3 = Едосл / Ест х 8 80 х 1000 Цю формулу 1 використовують при підрахуванні кліренсу креатиніну X = Сст х Едосл х D / Ест х а де 2 X - вміст креатиніну у добовій сечі мг; Сст - вміст креатиніну у стандартній пробі 0 5 мг ; Едосл - екстинція дослідної проби; Ест - екстинція стандартної проби; D - добова кількість сечі см3; а - кількість сечі взятої для аналізу 0 5 см3 . Після внесення у формулу значень Сст - 0 5 мг та а - 0 5 см3 одержуємо X = 0 5 х Едосл х D / Ест х 0 5 = Едосл / Ест х D Для визначення добової екскреції креатиніну в грамах користуються формулою: Хг/доб = Едосл х О / Ест х 1000 де 1000 - коефіцієнт перерахунку мг в грамах. Оскільки 1 г креатиніну молекулярна маса 113 містить 8 8 моль 1 ммоль = 113 мг його то для розрахунку екскреції креатиніну в ммолях за добу формулу перетворюють таким чином Хммоль/доб = Едосл х О х 8 8 / Ест х 1000 Визначення хлоридів в сечі засобом Мора Діапазони вимірювань хлоридів в сечі № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сеча Від 50 0 до 150 0 ммоль/дм3 Від 150 0 до 350 0 ммоль/дм3 Від 350 0 до 550 0 ммоль/дм3 Від 550 0 до 750 0 ммоль/дм3 Від 750 0 до 950 0 ммоль/дм3 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань концентрації хлоридів в сечі які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Сеча Від 50 0 до 150 0 ммоль/дм3 3 60 Від 150 0 до 350 0 ммоль/дм3 3 53 Від 350 0 до 550 0 ммоль/дм3 3 52 Від 550 0 до 750 0 ммоль/дм3 3 48 Від 750 0 до 950 0 ммоль/дм3 3 45 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104; Ваги лабораторні 4 кл. точності за ГОСТ 24104; Посуд мірний лабораторний скляний: колби ємністю 100; 1000 см3 за ГОСТ 1770; колби конічні ємністю 100 см3 за ГОСТ 25336; піпетки ємністю 1 0; 10 см3мікробюретки за ГОСТ 20292; Крапельниця. Реактиви та матеріали для проведення досліджень Срібло азотнокисле х.ч.; Калій хромовокислий ч.д.а.; Вода дистильована. Метод вимірювань хлоридів в сечі Метод основується на осадженні хлору титрованим розчином срібла азотнокислого у присутності індикатору хромовокислого калію К2СгО4 який вступає у реакцію із сріблом після осадження усього хлору що є у сечі та утворює із сріблом осад цеглино-червоного кольору. 1 NаСІ + АgNO3 > АgСl + NaNО3 v білий сироподібний осад хлористого срібла 2 2Аg NO3 + К2СгО4 = Аg2СгO4+ 2КNО3 v цеглино-червоний осад хромовокислого срібла Кількість азотнокислого срібла що пішла при титруванні на утворення осаду хлористого срібла еквівалентна кількості хлоридів. Підготовка до виконання вимірювань Приготування 0 1 М розчину срібла азотнокислого: 16 987 г срібла азотнокислого переносять у мірну колбу ємністю 1000 см3 розчиняють та доливають дистильованою водою до мітки. Приготування 5 % розчину хромовокислого калію: 5 0 г хромовокислого калію переносять у мірну колбу ємністю 100 см3 розчиняють та доливають дистильованою водою до мітки. Виконання вимірювань В конічну колбу відмірюють 1 смЗ сечі приливають 5 см3 води та 3 каплі 5 % розчину хромовокислого калію К2СгО4 як індикатор та титрують 0 1 М розчином азотнокислого срібла. Випадає білий сироподібний осад хлористого срібла. Продовжують титрувати розчином азотнокислого срібла до зміни кольору осаду з білого на цеглино-червоний. Обробка результатів вимірювань Для розрахунку вмісту хлоридів у сечі результат титрування азотнокислим сріблом помножують на 3 55 кількість мг хлоридів яке відповідає 1 см3 0 1 М розчину срібла азотнокислого та на добову кількість сечі. Визначення сечовини в сечі уреазним засобом з реактивом Неслера № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сеча Від 200 0 до 300 0 ммоль/дм3 Від 300 0 до 400 0 ммоль/дм3 Від 400 0 до 500 0 ммоль/дм3 Від 50 0 до 600 0 ммоль/дм3 Від 600 0 до 700 0 ммоль/дм3 Від 700 0 до 800 0 ммоль/дм3 Діапазони вимірювань сечовини Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань концентрації сечовини у сечі які наведені у таблиці р ? 0 05 . Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104; Ваги лабораторні 4 кл. точності за ГОСТ 24104; Фотоколориметр або спектрофотометр; Термостат; Центрифуга; Ступка порцелянова; Колби ємністю 100 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1; 2; 5; 10 см3 за ГОСТ 20292; дозатори піпеткові 0 1; 0 2; 0 5 см3; Посуд лабораторний порцеляновий: ступка порцелянова за ГОСТ 9147 Е. Реактиви та матеріали для проведення досліджень: Препарат уреази; Цинк сірчанокислий ч.д.а.; Натрію гідроксид ч.д.а.; Сегнетова сіль ч.д.а.; Реактив Несслера; Стандартний розчин сечовини; Борошно соєве насіння гарбуза; Вода дистильована; Фільтри паперові. Метод вимірювань Метод основується на розкладі сечовини крові або сечі ферментом уреазою з подальшим вимірюванням кількості аміаку що утворюється колориметричним методом з використанням реактиву Несслера . Підготовка до виконання вимірювань сечовини у сечі Приготування препарату уреази: очищують 3-4 шт. насіння гарбуза розтирають у ступці спочатку з 1 0 см3 дистильованої води а потім додають ще 9 0 см3. Отриману емульсію фільтрують. Приготування розчину кристалічного сульфату цинку - 7 5 г/ 100 см3: 7 5 г сульфату цинку переносять у мірну колбу на 100 см3 розчиняють у невеликій кількості дистильованої води та доводять до мітки дистильованою водою. Приготування розчину натрію гідроксиду: 1 5 г натрію гідроксиду переносять у мірну колбу на 100 см3 розчиняють у невеликій кількості дистильованої води та доводять до мітки дистильованою водою. Приготування розчину сегнетової солі: 0 2 г сегнетової солі переносять у мірну колбу на 100 см3 розчиняють у дистильованій воді та доводять до мітки дистильованою водою. Приготування стандартного розчину сечовини: 30 мг сечовини переносять у мірну колбу на 100 см3 розчиняють у невеликій кількості дистильованої води та доводять до мітки. Виконання вимірювань В дві пробірки - дослідну та стандартну - вносять по 1 5 см3 дистильованої води. Потім в дослідну додають 0 1 см3 крові або сечі а в стандартну - 0 1 см3 стандартного розчину сечовини після чого в кожну з пробірок приливають по 0 5 см3 препарату уреази або всипають по 10-12 мг соєвої муки. Вміст пробірок перемішують щільно закривають корковими пробками витримують 20 хв у водяній бані або термостаті при 37 ± 1 °С охолоджують та додають в кожну пробірку по 0 2 см3 розчину цинку сірчанокислого та по 0 2 см3 розчину натрію гідроксиду. Після ретельного перемішування центрифугують з кожної проби відбирають по 1 25 см3 центрифугату який переносять у дві інші чисті пробірки приливають по 2 25 см3 розчину сегнетової солі та по 0 5 см3 реактиву Несслера. Вміст пробірок перемішують та колориметрують при довжині хвилі 440 нм в кюветі з товщиною шару 5 мм як контроль використовують дистильовану воду. Обробна результатів вимірювань Вміст сечовини ммоль/дм3 розраховують за формулою: С = Едосл / Ест х 5 ммоль/дмЗ х 100 де Едосл - екстинція дослідної проби; Ест - екстинція стандартної проби; 5 ммоль/дм3 - вміст сечовини в стандарті; 100 - розведення сечі. Функціональний стан нирок оцінюється передусім за рівнем добового діурезу після навантаження тварин мінеральною водою. Для з'ясування спроможності нирок розвивати діурез безпосередньо після введення води вивчається динаміка "водного" діурезу 1 5-2 год . На визначеність "водного" діурезу впливає метод введення води що вивчається. В цьому випадку дуже важливе вміле і безболісне зондування тобто експериментатор повинен мати навички. Для підтвердження діуретичної дії вод на етапі доклінічних досліджень слід проводити додаткове водне навантаження 1 % від маси тіла тварини . Мінеральна вода вводиться зондом у шлунок тварини. Безпосередньо після водного навантаження тварин розміщують у обмінних клітках які призначені для збору сечі і втримують протягом 24 годин. Отримані величини повинні бути віднесені до одиниці поверхні тіла. Істотним моментом в оцінці впливу мінеральної води на сечовиділення є з'ясування питання за рахунок якої функції нефрону відбувається приріст обсягу виділеної сечі - збільшення швидкості фільтрації первинної сечі у ниркових клубочках чи зменшення відсотку води що реабсорбується у ниркових канальцях що визначається за креатиніновим кліренсом. Визначення кількості сечовини та хлоридів дасть можливість оцінити очищувальну функцію нирок і безпечність застосування мінеральної води. Визначення вмісту електролітів в біологічних рідинах Діапазони вимірювання концентрації іонів K+ Na+ Ca++ H+ Cl- в цільній крові сироватці плазмі сечі та діалізатах № Об'єкти дослідження Канали вимірювання концентрації Діапазон вимірювання 1 Біологічні рідини цільна кров сироватка плазма сеча K Na Ca pH Cl 0 20 - 40 0 ммоль/л 20 0 - 200 0 ммоль/л 0 10 - 6 00 ммоль/л 6 000 - 8 000 од. 20 0 - 200 0 ммоль/л Показники точності вимірювання Об'єкти дослідження Канали вимірювання концентрації Межа допустимої абсолютної похибки Біологічні рідини цільна кров сироватка плазма сеча K Na Ca pH Cl ± 0 3 ммоль/л ± 4 ммоль/л ± 0 1 ммоль/л ± 0 03 од. ± 4 ммоль/л Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Аналізатор концентрації калію та натрію у крові сироватці та плазмі АЭК-01 "Квер"; Калібратор 1 K Na Ca pH Cl РМ.Э00.0034; Калібратор 2 K Na Ca pH Cl РМ.Э00.0013; Розчин сольового містка РМ.Э00.0033; Кондиціонер РМ.Э0К.0001; Очищувальний розчин РМ.ЭГК.0002; Чашка Петрі; Центрифуга лабораторна; Посуд лабораторний скляний: піпетки пробірки за ГОСТ 20292; Дозатори піпеткові П-1 0 1; 0 05 см3. Метод вимірювання Принцип роботи аналізатору основується на калібруванні за двома "точками". В якості таких "точок" виступають два розчини Калібратор 1 та Калібратор 2 в яких раніше надані значення концентрації іонів K+ Na+ Ca++ H+ та Cl-. Підготовка та виконання вимірювань Цільну кров необхідно набрати до шприца обробленого гепарином мікросемплеру чи капіляру та аналізувати так швидко наскільки це можливо. Зразки плазми отримують негайним центрифугуванням гепаринізованої цільної крові та послідуючим відокремленням плазми від еритроцитів в закриту пробірку. Аналізувати зразок плазми потрібно максимально швидко. Зразки сироватки отримують при розміщенні крові в не оброблені антикоагулянтом пробірки. До центрифугування зразки необхідно витримати відстоювати 30 хвилин до формування згустку. Після центрифугування необхідно відібрати сироватку до пробірки що закривається. Прилад вимірює концентрацію електролітів K Na та Cl у пробах розведеної сечі. Проба готується шляхом розведення сечі Калібратором 1 у співвідношенні 1: 9 тобто до 1 частини сечі необхідно додати 9 частин Калібратора 1. Вимірювання проводять згідно інструкції до прибору. В режимі "Проба" обираємо тип проби що аналізується. Протягом певного часу після закачування рідини не більш 30 секунд відбувається встановлення різниці потенціалів між вимірювальними електродами та електродами порівняння. Концентрації елементів висвічуються на табло у ммоль/л. 3.2 БІОХІМІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ 3.2.1 Визначення активності аспартат-амінотрансферази АСТ у сироватці крові методом Райтмана-Френкеля набір реактивів Філісіт-діагностика Визначення активності трансаміназ аланінамінотрансферази - АЛТ та аспартатамінотрансферази - АСТ - ферментів які каталізують процеси переамінування що є центральною магістраллю білкового обміну та найважливішою ланкою інтеграції усіх видів метаболізму білкового вуглеводного ліпідного у клітинах печінки. Діапазони вимірювань Діапазони вимірювань активності аспартатамінотрансферази у сироватці крові наведено у таблиці. № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сироватка крові Від 2 0 до 5 0 мкмоль/см3 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань активності аспартатамінотрансферази у сироватці крові які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Активність аспартатамінотрансферази у сироватці крові Від 2 0 до 5 0 мкмоль/см 1 62 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотоколориметр або спектрофотометр; Іономір або рН-метр; Мірні колби ємністю 500; 1000 см3; пробірки ємністю 10 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1 0; 5 0 см3 за ГОСТ 20292. Реактиви та матеріали для проведення досліджень Склад набору: 1. Субстратно-буферний розчин 50 см3; Фосфатний буфер 0 1 моль/дмЗ; L-аспарагинова кислота 0 1 моль/дм3; 2-оксоглутарова кислота 2 ммоль/дм3 2. Розчин 2 4-динітрофенілгідразина 50 см3; 1 ммоль/дм3 в соляній кислоті 1 моль/дм3 3. Градуювальний розчин 5 см3 Натрій піровинограднокислий 2 ммоль/дм3 220 мкг/см3 що відповідає 176 мкг/см3 піровиноградної кислоти 4. Натрію гідроксид 0 4 М 8 г 5. Вода дистильована Метод вимірювань Принцип методу засновано на реакції амінування 2-оксоглутарової кислоти L-аспарагиновою кислотою що відбувається під дією аспартатамінотрансферази. Утворюються L-глутаминова і щавелевооцтова кислоти остання декарбоксілірується з утворенням піровиноградної кислоти. Визначення засноване на вимірі оптичної щільності 2 4-нітрофенілгидразонов 2-оксоглутарової і піровиноградної кислот у лужному середовищі. Підготовка до виконання вимірювань Вміст флакона з гідроксидом натрію кількісно переносять у мірну колбу ємністю 500 см3 доводять розчин до мітки дистильованою водою. Стандартний розчин готовий до роботи після скресання ампули припускається його збереження при кімнатній температурі протягом 12 годин. Субстратно-буферний реактив готовий до роботи після скресання флакона протягом 2 тижнів. Розчин 2. 4- динітрофенілгідразина готовий до роботи. Розчин стійкий. Виконання вимірювань Побудова градуювального графіку Макроаналіз Мікроаналіз Відміряти у кювету Дослідна проба Холоста проба Дослідна проба Холоста проба Субстратно-буферний реактив 0 4 см3 0 4 см3 0 1 см3 0 1 см3 інкубують 3 хв при 37±1 °С Р-н 2 4-динітрофенілгідразина - 0 4 см3 - 0 1 см3 Сироватка крові 0 08 см3 0 08 см3 0 02 см3 0 02 см3 інкубують 60 хв при 37±1 °С Р-н 2 4-динітрофенілгідразина 0 4 см3 - 0 1 см3 - витримують 20 хв при кімнатній температурі Р-н гідроксиду натрію 0 4 М 4 см3 4 см3 1 см3 1 см3 Витримують 10 хв при кімнатній температурі вимірюють оптичну щільність дослідної проби проти холостої індивідуальної для кожної сироватки при довжині хвилі 530 нм з товщиною шару 10 мм. Розрахунок активності ферменту в сироватці крові роблять за градуювальним графіком. Час інкубації - 60 хв. 3.2.2 Вимірювання білірубіну у сироватці крові за діазореакцією в присутності акселератору за допомогою набору реактивів що випускаються фірмою "Лахема" Діапазони вимірювань № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сумарна концентрація білірубіну в сироватці крові Від 4 0 до 6 0 мкмоль/дм3 Від 6 0 до 8 0 мкмоль/дм3 Від 8 0 до 10 0 мкмоль/дм3 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань сумарної концентрації білірубіну в сироватці крові які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Сумарна концентрація білірубіну в сироватці крові Від 4 0 до 6 0 мкмоль/дм3 Від 6 0 до 8 0 мкмоль/дм3 Від 8 0 до 10 0 мкмоль/дм3 2 26 2 21 2 18 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотоколориметр що забезпечує вимір оптичної щільності при довжині хвилі 580-620 нм загальний білірубін і при довжині хвилі 510-550 нм прямий білірубін Колби мірні ємністю 100 см3; пробірки ємністю 10 см3 за ГОСТ 1770; піпетки мірні ємністю 0 05 см3; 0 10 см3; 0 20 см3; 1 0 см3; 5см3 за ГОСТ 20292 Реактиви та матеріали для проведення досліджень Набір "Лахема" Білірубін: Сульфанілова кислота 60 см3 - реактив 1 розчин 30 ммоль/дм3 у розчині хлористоводневої кислоти 150 ммоль/дм3 Буферний розчин 120 см3 - реактив 2 Натрій-калій виннокислий 0 93 моль/дм3 у розчині натрію гідрооксиду 1 9/дм3 Акселератор 120 см3 - реактив 3 Кофеїн ф.с. 0 26 моль/дм3 натрій бензойнокислий х. ч. 0 52 моль/дм3 Натрій азотистокислий розчин 0 025 моль/дм3 10 см3 - реактив 4 Натрію хлорид ч.д.а. Натрію гідроксид ч.д.а. Білірубін - еталон ліофілізований "Лахема" стандартний розчин який містить "а" мкмоль/дм3 концентрація білірубіну "а" вказана на етикетці флакону . Альбумін - розчин 20 г/дм3. Вода дистильована Метод вимірювань Принцип методу засновується на визначенні білірубіну у вигляді комплексної азосполуки із діазотованою сульфаніловою кислотою. Визначення загального білірубіну проводять у розчині акселератора. Визначення прямого білірубіну - без акселератора. Підготовка до виконання вимірювань Приготування фізіологічного розчину Фізіологічний розчин не входить до набору . Готується розчиненням 0 9 г хлориду натрію у 100 см3дистильованої води. Приготування реакційної суміші Склад реакційної суміші 1. Сульфанілова кислота 2 50 ммоль/дм3 2. Хлористоводнева кислота 12 50 ммоль/дм3 3. Натрій бензойнокислий 0 22 моль/дм3 4. Натрій-калій виннокислий 0 39 моль/дм3 5. Кофеїн 0 11 моль/дм3 6. Натрію гідрооксид 0 16 моль/дм3 Співвідношення сироватка / реакційна суміш - 1/12 Приготування робочих розчинів Розчин білірубіну: вміст флакону з реагентом 1 розчинити в 4 см3 дистильованої води. Розчин містить "а" мкмоль білірубіну. Стабільний 3 дні при температурі 5 °С у темноті. Розчин альбуміну: Вміст флакону з реагентом 2 розчинити в 8 см3 дистильованої води. Розчин містить альбуміну 20 г/дм3. Стабільний на протязі тижня при температурі 5 °С. Побудова градуювального графіку Графік будується за допомогою готового набору реактивів. Для побудови градуювального графіку готують стандартні розчини відповідно таблиці. Стандартні розчинення Розчин № Розчин білірубіну см3 Розчин альбуміну см3 Концентрація білірубіну в пробі мкмоль/дм3 1 0 10 1 90 0 050.а 2 0 25 1 75 0 125.а 3 0 50 1 50 0 250.а 4 0 75 1 25 0 375.а 5 1 00 1 00 0 500.а "а" - це концентрація білірубіну що вказана на флаконі із стандартним розчином білірубіну. Розведені стандартні розчини використовують для побудови градуювального графіку. Хід побудови градуювального графіку Відміряти см3 Загальний білірубін Прямий білірубін контр. р-н еталон контр. р-н еталон Реактив 1 0 20 0 20 0 20 0 20 Реактив 4 0 05 0 05 0 05 0 05 Реактив 3 1 00 1 00 1 00 1 00 Стандартний розчин - 0 20 - 0 20 Р-н альбуміну 0 20 - 0 20 - Перемішують протягом 10-30 хв та додають Реактив 2 1 00 1 00 1 00 1 00 Перемішують і на протязі 60 хв вимірюють оптичну щільність еталона проти розчину порівняння при довжині хвилі 580-620 нм з товщиною кювети 10 мм Будують градуювальні графіки як залежність оптичної щільності від вмісту білірубіну в стандартних розчинах в мкмоль/дм3. Виконання вимірювань Визначення загального білірубіну Довжина хвилі 580-620 нм товщина шару кювети 10 мм. Відміряти см3 Контр. р-н 1 Контр. р-н 2 Проба Реактив 1 0 20 0 20 0 20 Реактив 4 0 05 - 0 05 Реактив 3 1 00 1 00 1 00 Фізіологічний розчин 0 20 0 20 - Сироватка крові - 0 20 0 20 Перемішують протягом 10-15 хв та додають Реактив 2 1 00 1 00 1 00 Перемішують і точно через 5 хв вимірюють оптичну щільність проби А1 і контрольного розчину 1 Визначення прямого білірубіну Довжина хвилі 510-550 нм товщина шару кювети 10 мм. Відміряти см3 Контр. р-н 1 Контр. р-н 2 Проба Реактив 1 0 20 0 20 0 20 Реактив 4 0 05 - 0 05 Реактив 3 1 00 1 00 1 00 Фізіологічний розчин 1 20 1 05 1 00 Сироватка крові - 0 20 0 20 Перемішують і точно через 5 хв вимірюють оптичну щільність проби А1 і контрольного розчину 2 А2 проти контрольного розчину 1 Обробка результатів вимірювань Вміст загального і прямого білірубіну в пробі підраховують за відповідними градуювальними графіками. Для розрахунку беруть різницю оптичної щільності проби та контрольного розчину А1-А2 . 3.2.3 Визначення білірубіну у сироватці крові за діазореакцією в присутності акселератору метод Йендрашека Клеггорна і Грофа Діапазони вимірювань Діапазони вимірювань представлені у таблиці № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сумарна концентрація білірубіну в сироватці крові Від 4 0 до 6 0 мкмоль/дм3 Від 6 0 до 8 0 мкмоль/дм3 Від 8 0 до 10 0 мкмоль/дм3 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань сумарної концентрації білірубіну в сироватці крові які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Сумарна концентрація білірубіну в сироватці крові Від 4 0 до 6 0 мкмоль/дм3 Від 6 0 до 8 0 мкмоль/дм3 Від 8 0 до 10 0 мкмоль/дм3 2 26 2 21 2 18 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Спектрофотометр що забезпечує вимір оптичної щільності при довжині хвилі 500-560 нм загальний білірубін і при довжині хвилі 510-550 нм прямий білірубін . Ваги лабораторні 200 г 2 кл ГОСТ 24104 Ареометр загального призначення 1 84 г/см3 Мірні колби ємністю 100 см3; пробірки ємністю 10 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1 0 см3; 0 20 см3; 0 10 см3; 0 05 см3 5 см3 за ГОСТ 20292. Реактиви та матеріали для проведення досліджень Кофеїн ч Натрій бензойнокислий ч. Натрій оцтовокислий о.ч. Вода дистильована Натрій хлористий х.ч. Кислота сульфанілова ч.д.а. Кислота соляна концентрована чда густиною 1 19 г/см3 Натрій азотистокислий ч.д.а. Білірубін кристалічний ф.с. Натрій вуглекислий безводний ч. Кислота оцтова льодяна густиною 1 0492 г/см3 х.ч. Метод вимірювань Принцип методу засновується на взаємодії сульфанілової кислоти з азотистокислим натрієм. Утворюється діазофенілсульфонова кислота що дає зі зв'язаним прямим білірубіном сироватки крові рожево-фіолетове забарвлення. За інтенсивністю забарвлення визначається концентрація білірубіну що дає пряму реакцію. При додаванні до сироватки крові кофеїнового реактиву незв'язаний непрямий білірубін переходить у розчинний діссоційований стан і із сумішшю діазореактивів дає рожево-фіолетове забарвлення. По інтенсивності забарвлення визначають концентрацію загального білірубіну. По різниці між загальним і зв'язаним білірубіном визначають концентрацію незв'язаного білірубіну. Підготовка до виконання вимірювань Приготування кофеїнового реактиву 5 г чистого кофеїну 7 5 г бензойнокислого натрію 12 5 г оцтовокислого натрію розчиняють у 90 см3 дистильованої води нагрівають до 50-60 °С добре перемішують. Після охолодження доводять дистильованою водою до 100 см3. Термін зберігання - 2 тижні. Приготування 0 9 % розчину натрію хлористого До 0 9 г натрію хлористого додають 99 1 см3 дистильованої води Приготування діазосуміші: а Діазореактив 1 5 г сульфанілової кислоти розчиняють при нагріванні в 300-400 см3 дистильованої води додають 15 см3 концентрованої соляної кислоти густиною 1 19 г/см3. Тільки після повного розчинення сульфанілової кислоти й охолодження розчину доливають дистильованою водою до 1 дм3. Реактив стійкий зберігається в посуді з темного скла. б Діазореактив II. 0 5 % розчин натрію азотистокислого До 0 5 г натрію азотистокислого додають 99 5 см3 дистильованої води. Реактив зберігається в посуді з темного скла 2-3 тижні. Перша ознака його непридатності - жовтуватий відтінок. Перед роботою змішують 10 см3 діазореактиву І і 0 3 см3 діазореактиву II. Приготування 0 1 М розчину натрію вуглекислого 10 6 г натрію вуглекислого розчиняють в невеликому об'ємі дистильованої води переносять в мірну колбу ємністю 1000 см3 та додають до мітки дистильованою водою. Приготування стандартних розчинів білірубіну Основний стандартний розчин білірубіну. Для побудови градуювального графіку використовують лише той білірубін 1 мг якого при розчиненні в 100 см3 хлороформу для наркозу при 25 °С дає на спектрофотометрі абсорбцію від 1 01 до 1 07 при довжині хвилі 453 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм. У колбі ємністю 50 см3 розчиняють 40 мг білірубіну у 30-35 см3 0 1 М розчину натрію вуглекислого. Добре перемішують не допускаючи утворення бульбашок. Доводять до 50 см3 0 1 М розчином N2СО3 і декілька разів перемішують. Отриманий розчин 80 мг/100 см3 стійкий протягом 10 хвилин від початку приготування. Робочий розчин білірубіну. До 7 см3 свіжої негемолізованої сироватки додають 1 0 см3 розчину білірубіну 80 мг/100 см3 який щойно приготували і 0 05 см3 4 М розчину оцтової кислоти. Добре перемішують. Робочий розчин стійкий у холодильнику не більше 1 доби. Приготування 4 М розчину оцтової кислоти 25 см3 оцтової кислоти льодяної переносять в мірну колбу ємністю 100 см3 та додають до мітки дистильованою водою. Побудова градуювального графіку Метод Шелонг і Венде 1960 із використанням стабілізуючої властивості білку сироватки крові. Для побудови градуювального графіку готують ряд розведень із різним вмістом білірубіну. № пробірок Робочий розчин білірубіну см3 0 9 % розчин NaCl см3 Кількість білірубіну в пробі мг Концентрація білірубіну у сироватці крові мг/100 см3 мкмоль/дм3 1 0 05 0 45 0 005 1 17 2 0 10 0 40 0 010 2 34 3 0 15 0 35 0 015 3 51 4 0 20 0 30 0 020 4 68 5 0 25 0 25 0 025 5 85 До отриманих розведень додають по 1 75 см3 кофеїнового реактиву і по 0 25 см3 діазосуміші. Виміри проводять за тих же умов що і досліджувані проби через 20 хвилин. З дослідженої рідини готують розведення аналогічні стандартним як зазначено в таблиці 2 і далі обробляють їх так само як стандартні проби. У 3 пробірки для загального білірубіну прямого і для контролю вводять реактиви відповідно до таблиці. Інгредієнти см3 Проба см3 Холоста проба Загальний білірубін Прямий білірубін Сироватка 0 50 0 50 0 50 Кофеїновий реактив 1 75 - 1 75 9 % хлористий натрій - 1 75 0 25 Діазосуміш 0 25 0 25 - Для визначення прямого білірубіну колориметрування варто проводити через 5-10 хв. після додавання діазосуміші тому що при тривалому стоянні в реакцію вступає непрямий білірубін. Для визначення загального білірубіну пробу для розвитку забарвлення залишають на 20 хвилин після чого колориметрують. Вимірюють оптичну щільність при довжині хвилі 500-560 нм зелений світофільтр у кюветі з товщиною 5 мм використовуючи як розчин порівняння дистильовану воду. З показників отриманих при колориметруванні загального і прямого білірубіну віднімають показник холостої проби. Обробка результатів вимірювань Вміст білірубіну прямого та загального розраховують за градуювальним графіком. Рівень непрямого білірубіну розраховують як різницю між загальним вмістом білірубіну та вмістом прямого білірубіну. 3.2.4 ВИЗНАЧЕННЯ ПРОДУКТІВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ Визначення малонового діальдегіду за допомогою тіобарбітурової кислоти у біологічному матеріалі. Діапазони вимірювань малонового діальдегіду № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Малоновий діальдегід Від 4 0 до 7 0 нмоль/см3 Від 7 0 до 10 0 нмоль/см3 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань сумарної концентрації малонового діальдегіду які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Малоновий діальдегід Від 4 0 до 7 0 нмоль/см3 Від 7 0 до 10 0 нмоль/см3 0 96 0 81 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Спектрофотометр що забезпечує вимір оптичної щільності при довжині хвилі 532 нм Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл. точності за ГОСТ 24104 Іономір або рН-метр Центрифуга РС-6 Ареометр ЗП 1 19 Ваги лабораторні аналітичні за ГОСТ 24104 Баня водяна Холодильник "Дніпр-2" Мірні колби ємністю 500; 1000 см3; пробірки ємністю 10 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1 0; 5 0 см3 за ГОСТ 20292. Реактиви та матеріали для проведення досліджень 0 025 М Трис-НСІ буфер р 7 4 що містить 0 175 М хлориду калію Кислота трихлороцтова ч.д.а. Кислота 2-тіобарбітурова ТБК ч.д.а. Кислота соляна концентрована густиною 1 19 г/см3 ч.д.а. Вода дистильована Метод вимірювань Принцип методу засновано на тому що при високій температурі в кислому середовищі малоновий діальдегід реагує з 2-тіобарбитуровою кислотою створюючи пофарбований триметиновий комплекс із максимумом поглинання при 532 нм. Молярний коефіцієнт екстинкції цього комплексу - ? = 1 56-105см-1-М-1. Підготовка до виконання вимірювань Приготування 0 025 М Трис-НСІ буферу 7 2 ± 0 2 од. рН що містить 0 175 М хлориду калію 3 3 г Трис-НСІ та 9 8 г розчиняють у 1 дм3 дистильованої води та додають концентровану НСІ до 7 2 ± 0 2 од. рН. Приготування 17% розчину трихлороцтової кислоти 17 г трихлороцтової кислоти переносять у мірну колбу на 1000 см3 доводять розчин до мітки дистильованою водою. Приготування 0 8 % розчину тіобарбітурової кислоти ТБК 0 8 г 2-тіобарбітурової кислоти переносять у мірну колбу на 100 см3 доводять розчин до мітки дистильованою водою. Приготування тканинного гомогенату Наважку тканини 1 г дрібнять переносять у ручний гомогенізатор додають 10 см3 буферу Трис і гомогенізують до однорідної маси. Виконання вимірювань Приготовлений тканинний гомогенат у буферному розчині 7 2 ± 0 2 од. рН по 2 5 см3 переносять у центрифужні пробірки й осаджують білок додаванням 1 см3 17% розчину трихлороцтової кислоти. Осадок що утвориться відділяють центрифугуванням протягом 10 хв при 4000 об/хв і відбирають надосадову рідину по 2 см3 переносять у пробірки додають по 1 см3 0 8 % водяного розчину ТБК і поміщають проби на 10 хв у киплячу водяну баню. Як контроль використовують проби що переносять замість надосадової рідини буферний розчин 7 2 ± 0 2 од. рН. Після розвитку рожевого забарвлення проби охолоджують до кімнатної температури і вимірюють оптичну щільність при 532 нм на спектрофотометрі при товщині шару кювети 10 мм проти контрольної проби. Обробка результатів вимірювань Кількість малонового діальдегіду розраховують згідно з формулою: А нмоль/см3 = Е х 106 де 1 56 х 105 х n Е - оптична щільність дослідної проби; 106 - коефіцієнт перерахунку нмоль ; 1 56 х 105 - коефіцієнт молярної екстинкції; n - об'єм проби см3 . Визначення активності ?-амілази у біологічних рідинах по набору реактивів що випускаються фірмою "Лахема". Діапазони вимірювань концентрації ?-амілази № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Біологічні рідини Від 15 0 до 25 0 г/год.дм3 Від 25 0 до 35 0 г/год.дм3 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань сумарної концентрації ?-амілази у біологічних рідинах які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Біологічні рідини Від 15 0 до 25 0 г/год.дм3 Від 25 0 до 35 0 г/год.дм3 0 71 0 63 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви. розчини й матеріали Фотоколориметр або спектрофотометр що забезпечує вимір оптичної щільності при довжині хвилі 590-690 нм Іономір або рН-метр Термостат Магнітна мішалка Мірні колби ємністю 50 см3; 100 см3; пробірки ємністю 10 см3 за ГОСТ 1770; мірні піпетки ємністю 0 1; 1 0; 5 0 см3 за ГОСТ 20292. Реактиви та матеріали для проведення досліджень Буфер 6 см3 : фосфатний буфер 0 67 моль/дм3; хлорид натрію 0 1 моль/дм3 Субстрат 5 флаконів 1 флакон містить: 0 4 г кольоровий крохмальний субстрат 0 2 г мікроцелюлоза Осаджуючий розчин 2 x 55 см3 : магній сірчанокислий 1 85 моль/дм3 кислота сульфосаліцилова 2 ммоль/дм3 хелатон 3-1 3 ммоль/дм3 - реактив 3 Натрій хлорид х.ч. Вода дистильована Склад інкубаційної суміші Фосфатний буфер рН 7 0 ± 0 2 од. рН - 61 ммоль/дм3 Крохмальний субстрат - 36 г/дм3 Співвідношення сироватка/інкубаційна суміш - 1/11 Метод вимірювань Принцип методу засновується на тому що ?-амілаза ?-1 4-глюкан-гидролаза К. Ф. 5.1.1. каталізує гідроліз нерозчинного кольорового крохмального субстрату з утворенням синього розчинного у воді барвника пропорційно каталітичної концентрації ферменту. Підготовка до виконання вимірювань Приготування розчину 1 В мірну колбу ємністю 50 см3 вносять 5 0 см3 реактиву 1 та розводять дистильованою водою до мітки. Термін зберігання: 1 тиждень при 5 ± 3 °С. Приготування розчину 2 В склянку ємністю 50 см3 вносять 10 см3 розчину 1 і при постійному перемішуванні на електромагнітній мішалці повільно додають вміст однієї пробірки з реактивом 2 після чого перемішують ще 15 хв. Термін зберігання 1 тиждень при 5 ± 3 °С. Приготування фізіологічного розчину Фізіологічний розчин готується розчиненням 0 9 г хлориду натрію у 100 см3 дистильованої води. Виконання вимірювань Обробка результатів вимірювань Відміряти см3 Сироватка Проба Контрольний розчин Розчин 2 1 00 1 00 Підігрівають 5 хв при 37 ± 1 ?С Сироватка 0 10 - Дистильована вода - 0 10 Інкубують точно 15 хв при 37 ± 1 ?С Реактив 3 2 00 2 00 Перемішують і через 15 хв центрифугують 5 хв при 3000 об/хв або профільтровують. Вимірюють оптичну щільність прозорої надосадової рідини проби проти контрольного розчину А при довжині хвилі 590 нм товщиною шару кювети спектрофотометра або фотометра 10 мм. Каталітичну концентрацію ?-амілази знаходять за наведеною градуювальною таблицею враховуючи отриману оптичну щільність А активність ферменту мккат/дм3 оптична щільність активність ферменту мккат/дм3 Оптична щільність 1 2 3 4 0 6 0 042 6 3 0 381 1 0 0 068 7 1 0 426 1 3 0 087 8 0 0 476 1 7 0 112 9 0 0 532 2 0 0 130 10 0 0 587 2 3 0 148 11 0 0 642 2 7 0 172 12 5 0 724 1 2 3 4 3 0 0 190 14 0 0 805 3 3 0 208 16 0 0 912 3 7 0 231 18 0 1 019 4 0 0 249 20 0 1 125 4 3 0 266 22 0 1 230 4 7 0 289 25.0 1 386 5 0 0 307 28 0 1 542 5 6 0 341 32 0 1 747 Примітка Посуд для визначення каталітичної концентрації ?-амілази не повинен містити детергенти. Реактив 1 може містити нерозчинені кристали які перед вживанням варто розчинити нагріванням реактиву до 40 ± 1 °С. Визначення активності ?-амілази у біологічних рідинах амілокластйчним методом з стійким крохмальним субстратом метод Каравея . Діапазони вимірювань ?-амілази № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Біологічні рідини Від 15 0 до 25 0 г/год.дм3 Від 25 0 до 35 0 г/год.дм3 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань сумарної концентрації ?-амілази у біологічних рідинах які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Біологічні рідини Від 15 0 до 25 0 г/год.дм3 Від 25 0 до 35 0 г/год.дм3 0 71 0 63 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотоколориметр або спектрофотометр Іономір або рН-метр Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні аналітичні за ГОСТ 24104 Баня водяна Термостат Мірні колби ємністю 500; 1000 см3; пробірки ємністю 10 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 0 02; 1 0 см3 за ГОСТ 20292 Реактиви та матеріали для проведення досліджень Натрій фосфорнокислий двозаміщений ч.д.а. Кислота бензойна ч. Крохмаль водорозчинний Йод кристалічний або фіксанал 0 5 М Калій йодистий о.ч. Калій йодноватокислий ч.д.а. Калій фтористий ч.д.а. Кислота соляна концентрована густиною 1 19 г/см3 ч.д.а. Розчин йоду фіксанал 0 1 М Вода дистильована Метод вимірювань Принцип методу засновується на тому що ?-амілаза гідролізує крохмал з утворенням кінцевих продуктів які не дають кольорову реакцію з йодом. Про активність ?-амілази судять по зменшенню концентрації крохмалю. Підготовка до виконання вимірювань Приготування субстратно-буферного розчину рН = 7 0 ± 0 2 од. рН 13 3 г безводного двохзаміщеного фосфорнокислого натрію і 4 3 г бензойної кислоти розчиняють у 250 см3 дистильованої води і доводять до кипіння. Суспендують 0 2 г розчинного крохмалю в невеличкій кількості холодної води і вводять у киплячий розчин. Кип'ятять 1 хв. охолоджують і доводять дистильованою водою до 500 см3. Розчин стабільний при зберіганні при кімнатній температурі повинен бути прозорим. Приготування 0 05 М основного розчину йоду Він може бути отриманий: а із кристалічного йоду і йодистого калію: 30 г KJ розчиняють у 250 см3 дистильованої води туди ж вносять 12 7 г йоду й доливають дистильованою водою до 1000 см3. Отриманий розчин зберігають у темноті він стійкий; б із йодату калію і йодистого калію: 3 567 г йодноватокислого калію KJОЗ і 45 г KJ розчиняють у 800 см3 води і повільно при помішуванні додають 9 см3 концентрованої соляної кислоти а потім доливають водою до об'єму 1000 см3. Приготування робочого 0 005 М розчину йоду стійкого 25 г фтористого калію розчиняють у 350 см3 води додають 50 см3 основного розчину йоду і доливають водою до об'єму 500 см3. Зберігається в посуді з темного скла в холодильнику протягом 2 міс. Без фтористого калію розчин слід готувати щодня. Виконання вимірювань Дослідну і холосту пробу готують у двох пробірках 10 см3. Інгредієнти Дослідна проба см3 Холоста проба см3 Субстратно-буферний розчин 1 00 1 00 Підігрівають протягом 5 хв при 37 ± 1 ?С Сироватка крові 0 02 - Перемішують. Інкубують при 37 ± 1 °С протягом 7 5 хв Робочий розчин йоду 1 00 1 00 Сироватка крові - 0 02 Доводять об'єм реакційної суміші дистильованою водою до 10 см3. Відразу ж колориметрують при довжині хвилі 590-690 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм проти дистильованої води. Обробка результатів вимірювань Розрахунок: Активність ?-амілази виражають у грамах крохмалю гідролізованого 1 дм3 біологічної рідини за 1 год інкубації при 37 ± 1 °С. Розрахунок роблять за формулою Активність ?-амілази г/год.дм3 = Ехол - Еon · 160 · К де Ехол Ехол - оптична щільність холостої проби; Еоп - оптична щільність дослідної проби; 160 - коефіцієнт перерахунку на кількість крохмалю введеного в пробу і гідролізованого в пробі біологічною рідиною в об'ємі 1 дм3 за 1 год. інкубації; К - коефіцієнт розведення біологічної рідини. Оцінка функції підшлункової залози проводилась по активності ферменту альфа-амілази який приймає участь у гідролізі глікогену та відбиває секреторну функцію залозистої тканини підшлункової залози. 3.3.4 Визначення сечовини у біологічних рідинах за допомогою набора "Біотест-Лахема" Діапазони вимірювань сечовини № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сироватка крові Від 2 0 до 40 0 ммоль/дм3 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань сумарної концентрації сечовини у сироватці крові які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Сироватка крові Від 2 0 до 40 0 ммоль/дм3 1 43 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Спектрофотометр або фотометр довжина хвилі 490-540 нм Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Ареометр ЗП 1 01-1 14 Баня водяна Фольга алюмінієва Колби ємністю 50; 100; 500 см3; пробірки 10 0 см3 за ГОСТ 1770; мікропіпетки ємністю 0 01 см3; піпетки ємністю 1 0; 2 0 см3 за ГОСТ 20292 Реактиви та матеріали для проведення досліджень Стандартний розчин сечовини 16 16 ммоль/дм3 - реактив 1 Діацетилмонооксин - реактив 2 - кожна таблетка містить діацетилмонооксим 0 5 ммоль тіосемикарбазид 0 08 ммоль сіль тривалентного заліза 2 5 ммоль. Кислота сірчана концентрована густиною 1 14 г/см3 ч.д.а. Кислота трихлороцтова ч. Вода дистильована. Метод вимірювань Принцип методу засновується на взаємодії сечовини з діацетилмонооксином у сильно кислому середовищі у присутності тіосемикарбазиду та іонів тривалентного заліза з утворенням забарвлених речовин. Підготовка до виконання вимірювань Приготування розчину сірчаної кислоти з концентрацією 1 8моль/дм3. У мірну колбу ємністю 500 см3 вносять близько 300 см3 дистильованої води та обережно додають 50 см3 концентрованої сірчаної кислоти. Після охолодження вміст розчину доводять до мітки дистильованою водою. Розчин придатний необмежений час. Приготування 5 % розчину трихлороцтової кислоти Наважку 5 г трихлороцтової кислоти розчиняють у 100 см3 дистильованої води. Приготування робочих розчинів Розчин 1. У мірній колбі ємністю 50 см3 у 30 см3 дистильованої води при температурі 80 ± 1 °С на водній бані розчиняють одну таблетку реактиву 2. Після охолодження додають дистильованої води до мітки. Наявність невеликої кількості нерозчиненого осаду не заважає визначенню. Реактив придатний декілька місяців при температурі від +15 до +25 °С. Розчин 2. Готують змішуванням розчину 1 з розчином сірчаної кислоти 1:1. Придатний: 1 день при 20 ± 5 °С. Виконання вимірювань У трьох тонкостінних пробірках змішують розчин 2 у відношенні 200:1 із сироваткою реактивом 1 стандартний розчин сечовини або дистильованою водою та перемішують. Відміряти см3 Проба Стандарт Контрольний розчин Сироватка 0 01 - - Реактив 1 - 0 01 - Дистильована вода - - 0 01 Розчин 2 2 00 2 00 2 00 Пробірки закривають алюмінієвою фольгою і переносять точно на 10 хв у кип'ячу водяну баню. Потім пробірки швидко охолоджують проточною водою та вимірюють оптичну щільність проби А1 та стандарту А2 проти контрольного розчину при довжині хвилі 490-540 нм з товщиною шару кювети 10 мм. Виміри слід проводити до 15 хв після охолодження. Обробка результатів вимірювань Вміст сечовини розраховують за формулою: Сечовина ммоль/дм3 = 16 65 х А1 де А2 А1 - оптична щільність проби; А2 - оптична щільність стандартного розчину; 16 65 ммоль/дм3 - стандартний розгин сечовини. Визначення загального білку у сироватці крові біуретовим методом набір реактивів "Філісіт - діагностика" Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Сумарна концентрація загального білку в сироватці крові Від 5 до 100 г/л Не більше 5 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 540-560 нм в діапазоні 0-1 0 од. опт. щільності та довжині оптичного шляху 5 або 10 мм. Колба мірна ємністю 500 мл пробірки ємністю 10 мл ГОСТ 1770-74 ; піпетки місткістю 0 1; 1 0 та 5 0 мл ГОСТ 29227-91 Реактиви та матеріали для проведення досліджень склад набору: - ліофілізований альбумін для приготування 5 мл калібрувального розчину 100 ± 5 г/л або 5мл готового розчину альбуміну Біуретовий реагент концентрований розчин - сульфат міді 15 0 ± 0 75 г/л - гідроокис натрію 40 0 ± 2 25 г/л - калію натрію тартрат 45 0 ± 2 25 г/л - йодид калію 25 0 ± 1 25 г/л - вода дистильована Метод вимірювань Принцип методу засновується на реагуванні білків з сірчанокислою міддю в лужному середовищі з утворенням сполук фіолетового забарвлення біуретова реакція . Підготовка до виконання вимірювань Вміст флакону з концентрованим розчином біуретового реактиву перенести у мірну колбу місткістю 500 мл та довести до мітки дистильованою водою. Розчин стабільний. У флакон який містить 0 5 г ліофілізованого альбуміну обережно витягти пробку додати 4 5 мл фізіологічного розчину. Потім легкими обертальними діями рук перемішати його вміст до повного розчинення. Зберігати при температурі від +2 до +4 °С. Побудова калібрувального графіку Графік будується за допомогою набору реактивів. Для побудови калібрувального графіку з калібрувального розчину білка готують ряд розведень відповідно таблиці Калібрувальні крапки Калібрувальні розчини білка мл 0 9 розчин хлористого натрію мл Концентрації білка г % г/л 1 0 4 0 6 4 40 2 0 6 0 4 6 60 3 0 8 0 2 8 80 4 1 0 - 10 100 Отримані розчини обробляють як зазначено в таблиці для калібрувальних розчинів. За отриманими даними будують калібрувальний графік. Виконання вимірювань Аналіз проводиться згідно зі схемою що наведена в таблиці Відміряти у пробірку мл Калібрувальна чи дослідна проба Холоста проба Калібрувальний чи дослідний розчин 0 04 - Фізіологічний розчин - 0 04 Біуретовий реактив 2 0 2 0 Змішати витримати 30 хв при кімнатній температурі від +18 до +25 °С . Виміряти оптичну щільність калібрувальної або дослідної проби проти холостої. Розрахунок концентрації загального білку проводять за калібрувальним графіком. Визначення глюкози у сироватці крові ферментативним методом набір реактивів фірми "Лахема" Чехія Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Сумарна концентрація глюкози в сироватці крові Не більше 5 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 480-540 нм та довжині оптичного шляху 10 мм. Пробірки ємкістю 10 мл ГОСТ 1770-74 ; піпетки місткістю 0 2; 2 0; 10 мл ГОСТ 29227-91 Реактиви та матеріали для проведення досліджень склад набору: 1. Ферменти пероксидаза 4 17 мкат ; глюкозооксидаза 50 0 мкат ; 4-аминоантипирин. 2. Буфер-хромоген фосфатний буфер 0 14 моль/л; 3-метилфенол 0 010 моль. 3. Еталон глюкози 10ммоль/л Метод вимірювань Принцип методу засновується на окисленні глюкози киснем повітря за каталітичної дії ферменту глюкозооксидази з утворенням перекису водню та глюконату. Перекис водню що виник визначають за реакцією окислювального азосполучення з заміщеним фенолом та 4-аміноантипирином що каталізується ферментом пероксидазою. Підготовка до виконання вимірювань Вміст флакону з реактивом 1 розчиняють в 6 мл дистильованої води додають до флакону з реактивом 2 та перемішують. Зберігати місяць при +8°С . Еталонний розчин глюкози придатний до використання 1 місяць при температурі від +2 до +8 °С за умови відсутності забруднення. Виконання вимірювань Аналіз проводиться згідно зі схемою що наведена в таблиці У трьох пробірках змішують у співвідношенні 100:1 або 150:1 глюкозний реактив з сироваткою чи плазмою проба еталонний розчин глюкози еталон та дистильованою водою бланк . Інкубують 30 хв від +15 до +25 °С чи при 15 хв при 37 °С. Інкубаційну суміш захищають від дії прямого світла. Не пізніше 40 хв після закінчення інкубації вимірюють оптичну щільність проби А1 та еталону А2 проти контрольного розчину. Розрахунок результатів Глюкоза ммоль/л = а ·А1 де А2 а - концентрація глюкози в еталонному розчині глюкози ммоль/л. Визначення співвідношення білкових фракцій сироватки крові турбодіметричним методом набір реактивів "Філісіт-діагностика" . Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Сумарна концентрація білкових фракцій сироватки крові Не більше 10 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 640 620-700 нм та довжині оптичного шляху 10 мм. Пробірки ємністю 20 мл ГОСТ 1770-74 піпетки місткістю 1 0; 5 0; 10 0 мл ГОСТ 29227-91 Реактиви та матеріали для проведення досліджень склад набору: 1. Основний фосфатний буфер "О" - 3 347 М 2. Фосфатний буфер № 1 - 3 084 М 3. Фосфатний буфер № 2 - 2 496 М 4. Фосфатний буфер № 3 - 2 359 М 5. Фосфатний буфер № 4 - 1 959 М 6. Фосфатний буфер № 5 - 1 622 М. Метод вимірювань Принцип методу засновується на тому що фосфатні розчини визначеної концентрації осаджують різні білкові фракції сироватки крові з утворенням дуже дрібної суспензії. За ступенем каламутності розчинів роблять висновок про співвідношення білків у дослідному матеріалі. Підготовка до виконання вимірювань Усі реактиви придатні до використання. Виконання вимірювань У штатив приміщують 7 пробірок ємністю 10 мл позначених цифрами "0" "1" "2" "3" "4" "5" "6"; "0" пробірку відмірюють 10 мл дистильованої води а в пробірки "5" "4" "3" "2" "1" - по 5 мл відповідних фосфатних буферів № 5 - № 1 . У "6" - у пробірку вносять 0 5 мл сироватки 0 75 мл дистильованої води 3 75 мл розчину основного фосфатного буферу "О". Вміст пробірки змішують 5-6-кратним перевертанням її уникаючи утворення при цьому бульбашок повітря. Потім у "1" "2" "3" "4" і "5"-ю пробірки переносять по 0 54 мл отриманої суміші а в "0" пробірку додають 1 мл її. Вміст кожної пробірки обережно перемішують і через 15 хв заміряють оптичну щільність Е - 5; 4; 3; 2 і 1 розчинів проти розчину з нульової пробірки. Примітка - перед фотометрируванням вміст пробірок необхідно ще раз ретельно перемішати проти розчину з нульової пробірки. Розрахунок результатів 1. Обчислюють показник оптичної щільності Е альбумінів. Для цього з показника Е "1-ї" проби віднімають показник Е "2-ї" проби. 2. Обчислюють показник оптичної щільності Е ?1-глобулінів. Для цього з показника Е "2-ї" проби віднімають показник Е "3-ї" проби. 3. Обчислюють показник оптичної щільності Е ?2-глобулінів. Для цього з показника Е "3-ї" проби віднімають показник Е "4-ї" проби. 4. Обчислюють показник оптичної щільності Е ?-глобулінів. Для цього з показника Е "4-ї" проби віднімають показник Е "5-ї" проби. 5. Показник Е "5-ї" проби є показником Е ?-глобулінів. 6. Обчислюють співвідношення кожної фракції у відносних або в абсолютних відсотках. Визначення гістаміну за флюоресценцією продуктів що утворюються при реакції з ортофталевим альдегідом. Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Сумарна концентрація гістаміну Не більше 5 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 460 нм та довжині оптичного шляху 10 мм. Пробірки ємністю 15-30 мл ГОСТ 1770-74 піпетки ємністю 1 0; 5 0; 10 0 мл ГОСТ 29227-91 колба мірна ємністю 200 мл ГОСТ 1770-74 центрифуга для пробірок від 2000 до 5000 об/хв. Реактиви та матеріали для проведення досліджень склад набору: 1. Водний розчин оксалату натрію 1 34 г/100 мл 2. Хлорна кислота конц 57 г/100 мл 3. н-Бутанол х.ч. 4. Хлороформ х.ч. 5. Бутанол-хлороформна суміш 6. Метиловий спирт 7. Водний розчин NaOH 5 н 8. NaCl кристалічний 9. Водний розчин NaOH насичений NaCl 0 1 н 10. Розчин NaOH 1 н 11. Розчин соляної кислоти 0 1 н 12. Водний розчин о-фосфорної кислоти 1 4 моль/л 13. О-фталевий альдегід 14. Стандартний розчин гістаміну 15. Дистильована вода перегнана тричі Метод вимірювань Гістамін екстрагують з крові хлорною кислотою очищують від домішок шляхом екстракції сумішшю бутанолу та хлороформу переводять у водну фазу в якій здійснюють реакцію конденсації з о-фтальальдегідним реактивом. Конденсат стабілізують фосфорною кислотою та флюорометрирують. Підготовка до виконання вимірювань Виконання вимірювань В пробірки місткістю 15-30 мл додають по 4 мл оксалатної крові та 4 мл 1 н розчину хлорної кислоти. Зачинені пробірки енергійно перемішують протягом 3 хв після чого проби центрифугують 5 хв при 4000 об/хв. 4 мл над осадової рідини переносять у такі ж пробірки що містять по 0 5 мл 5 н розчину NaOH 1 5 NaCl та по 10 мл суміші бутанол-хлороформу. Вміст пробірок ретельно перемішують 3 хв та центрифугують при 4000 об/хв. 5 хв. Нижню водну фаза відбирають та зливають. Потім в пробірки додають по 5 мл 0 1 н розчину NaOH з NaCl для видалення гістідіну. Закрити пробірки енергійно перемішують протягом 3 хв. Проби центрифугують 5 хв при 4000 об/хв. Після розділення фаз верхній органічний шар переносять в інші пробірки до яких додають по 5 мл 0 1 н розчину HCl. Закрити пробірки енергійно перемішують протягом 3 хв. Проби центрифугують 5 хв при 4000 об/хв. Верхній водний шар переливають в чисті пробірки до яких додають по 0 5 мл 1 н NaOH та по 0 12 мл розчину о-фталевого альдегіду. Через 4 хв додають 0 2 мл Н3РО4. Проби флюорометрирують утворений конденсат збуджують довжиною хвилі 365 нм а вимірюють його при 460 нм. Розрахунок результатів Вміст гістаміну в мкг/мл крові = Ф0·С де Фс·4 Ф0 -- різниця у показниках дослідної та контрольної проби; Фс - різниця у показниках стандартної та контрольної проби; С - вміст гістаміну мкг в 4 мл стандартного розчину; 4 - коефіцієнт перерахунку на вміст гістаміну в 1 мл крові. Визначення сечової кислоти у сироватці крові з фосфорнофольфрамовим реактивом набір реактивів фірми "Філісіт-діагностика" Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Сумарна концентрація сечової кислоти в сироватці крові 80-1200 Не більше 10 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 650 620-700 нм та довжині оптичного шляху 10 мм. Пробірки ємністю 10 мл ГОСТ 1770-74 піпетки ємністю 1 0; 5 0; 10 0 мл ГОСТ 29227-91 колба мірна місткістю 200 мл ГОСТ 1770-74 центрифуга для пробірок від 2000 до 5000 об/хв. Реактиви та матеріали для проведення досліджень склад набору: 1. Фосфорно-вольфрамовий реактив: Na2WO4 - 0 12 ± 0 01 моль/л; H3PO4 - 0 47 ± 0 05 моль/л; Li2SO4 - 0 29 ± 0 02 моль/л. 2. Сірчана кислота - 0 35 ± 0 02 моль/л 3. Вольфрамат натрію - 0 30 ± 0 01 моль/л 4. Калібрувальний розчин сечової кислоти - 300 ± 3 мкмоль/л 5. Карбонат натрію. Метод вимірювань Принцип методу засновується на відновленні сечовою кислотою в лужному середовищі фосфорно-вольфрамового реактиву в барвник синього кольору. Інтенсивність забарвлення реакційного розчину пропорційно концентрації сечової кислоти в дослідній пробі. Підготовка до виконання вимірювань Реактиви 1-4 придатні до використання. Для приготування розчину карбонату натрію вміст флакону з карбонатом переносять до мірною колби на 200 мл додають 130-150 мл дистильованої води перемішують до повного розчинення осаду доводять об'єм до мітки дистильованою водою. Розчин стійкий впродовж гарантійного терміну використання при температурі від 0 до + 20 °С. Виконання вимірювань Аналіз проводиться згідно зі схемою що наведена в таблиці. Відміряти мл Дослідна проба Калібрувальна проба Холоста проба Дистильована вода 4 0 4 0 4 5 Сироватка 0 5 - - Калібрувальний розчин сечової кислоти - 0 5 - Кислота сірчана 0 25 0 25 0 25 Вольфрамат натрію 0 25 0 25 0 25 Перемішати витримати 10 ± 1 хв при кімнатній температурі від + 20 до + 25 °С центрифугувати 10 ± 1 хв 2000-5000 об/хв відібрати необхідну кількість центрифугату. Центрифугат 2 0 2 0 2 0 Розчин карбонату натрію 1 0 1 0 1 0 Фосфорно вольфрамовий реактив 0 6 0 6 0 6 Перемішати витримати 30 ± 2 хв при кімнатній температурі від + 20 до + 25 °С виміряти оптичну щільність дослідної Епроби та калібрувальної проби Екалібр проти холостої. Забарвлення не змінюється впродовж 30 хв. Розрахунок результатів С мкмоль/л = 300·Епроби Екалібр Визначення активності супероксиддисмутази СОД еритроцитів тканинного гомогенату Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Супероксиддисмутаза еритроцитів тканинний гомогенат Не більше 11 2 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 540 нм та довжині оптичного шляху 10 мм. Пробірки ємністю 10 мл ГОСТ 1770-74 піпетки ємністю 1 0; 2 0; 0 05; 0 1 мл ГОСТ 29227-91 Реактиви та матеріали для проведення досліджень 1. 0 15 М фосфатний буфер рН 7 8 2. ТРИС-ЕДТА-буфер рН 8 0 3. Етиловий спирт 4. Хлороформ 5. Нітросиній тетразолій 6. Феназин мета сульфат. Метод вимірювань Принцип методу засновується на відновлені нітросинього тетразолію супероксидними радикалами що утворюються при реакції між феназинметасульфатом та відновленою формою никотинамідаденін дінуклеотиду NАДН .Утворення нитрофармазану продукту відновлення нитросинього тетразолію блокується наявністю у пробі СОД. На підставі кількості нитроформазану можна судити про активність СОД. Підготовка до виконання вимірювань Інкубаційна суміш: 37 мг ЕДТА-Na2 330 мг нітросинього тетразолію 55 мг феназинметасульфата змішують з 300 мл фосфатного буферу залишають на 12 годин потім фільтрують. Розчин NАДН. 152 мг NАДН розчиняють у 100 мл ТРИС-ЕДТА- буферу рН 8 0. Виконання вимірювань До 1 мл гемолізату для усунення дії гемоглобіну додають 0 5 мл етилового спирту 0 25 мл хлороформу та 300 мг КН2РО4. Перемішують та центрифугують 30 хв при 5000 об/хв. До контрольної та дослідної проби додають по 1 5 мл інкубаційної суміші 0 05 мл розчину NАДН та 0 1 мл супернатанту чи 0 1 мл гомогенату див. метод вимірювань малонового діальдегіду в дослідну пробу а в контрольну пробу - 0 1 мл дистильованої води. Колориметрирують контрольну та дослідну пробу проти води. Розрахунок результатів СОД % = Ек-Е0 · 100 де Ек Ек та Е0 - екстинції відповідно контрольної та дослідної проби. Визначення кетонових тіл у крові методом Натальсона. Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Кетонові тіла Не більше 10 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 530-540 нм та довжині оптичного шляху 10-мм. Пробірки ємністю 10 мл ГОСТ 1770-74 піпетки ємністю 1 0; 2 0 мл ГОСТ 29227-91 чашка Конвея. Реактиви та матеріали для проведення досліджень 1. Гідросульфіт натрію 2 % розчин; 2. Сірчана кислота 10 % розчин; 3. Їдкий натр 40 % розчин; 4. Розчин саліцилового альдегіду; 5. Стандартний розчин ацетону 0 86 ммоль/л; 6. Фтористий натрій. Метод вимірювань Принцип методу засновується на тому що ацетон заміщується в крові на сірчану кислоту. Ацетооцтова кислота перетворюється в ацетон при інкубуванні при 60°С у кислому середовищі. ?-оксимасляну кислоту окислюють в ацетон. Таким чином сумарна кількість кетонових тіл зводиться до визначення ацетону. У лужному середовищі ацетон утворює з саліциловим альдегідом сполуку забарвлену в червоний колір. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації ацетону. Підготовка до виконання вимірювань Розчин саліцилового альдегіду: 20 мл саліцилового альдегіду змішують з 80 мл етилового спирту. Виконання вимірювань До внутрішньої ємності чашки Конвою додають 2 мл 2 % розчину NaHSO3. До зовнішньої ємності - 1 мл крові та додають невелику кількість фториду натрію для попередження згортання крові та 0 5 мл 10 % розчину сірчаної кислоти. Чашку щільно закривають кришкою та перемішують. Чашку поміщують в термостат на 1 годину при 60 °С. З внутрішньої ємності 1 5 мл до пробірки додають 1 5 мл 40 % розчину NaOH та 0 3 мл розчину саліцилового альдегіду в етиловому спирті перемішують та залишають на 20 хв у термостаті при 50 °С. Після цього пробірку ще на 30 хв залишають при кімнатній температурі. Розрахунок результатів Концентрацію ацетону розраховують за формулою: Са= Еоп · 0 86 ммоль/л Ест Визначення заліза за кольоровою реакцією зі спиртовим розчином батофенантроліну. Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Залізо Не більше 5 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі 540 нм та довжині оптичного шляху 10 мм. Пробірки ємністю 10 мл ГОСТ 1770-74 пробірки з притертими пробками піпетки ємністю 1 0; 0 1; 0 2 мл ГОСТ 29227-91 . Реактиви та матеріали для проведення досліджень 1. Кислота тіогліколева; 2. Кислота трихлороцтова 40 % розчин; 3. Натрію ацетат насичений розчин; 4. Бетафенантролін; 5. НСl 1 н розчин; 6. Калібрувальний розчин заліза. Метод вимірювань Принцип методу засновується на тому що сироваткове залізо відновлюють до 2 валентного стану тіогліколевою кислотою білки осаджують трихлороцтовою кислотою. У фільтраті проводять кольорову реакцію з бетафенантроліном який з двовалентнім залізом у кислому середовищі утворює комплексну сполуку з інтенсивністю забарвлення що пропорційно концентрації заліза. Підготовка до виконання вимірювань Приготування бетафенантроліна: 40 мг розчинити в 100 мл етанолу. Калібрувальний розчин заліза: 100 мг м'якої залізної проволоки розчиняють у 4 мл концентрованої HCl та доводять до 1 л дистильованою водою отримуємо розчин що містить 100 мкг/мл. З нього розведенням у 60 разів отримують розчин що містить 30 мкмоль/л. Виконання вимірювань Інгредієнти Дослідна проба мл Калібрувальна проба мл Холоста проба мл Дистильована вода - - 0 7 Сироватка 0 7 - - Калібрувальний розчин - 0 7 - Тіогліколева кислота 0 1 0 1 0 1 1 н HCl 0 35 0 35 0 35 Перемішати ТХО 0 2 0 2 0 2 Перемішують скляною паличкою центрифугують 10 хв при 2500 об/хв. Наступний етап дослідження проводять у пробірках з притертими пробками Центрифугат 0 7 0 7 0 7 Розчин амонію ацетата 0 6 0 6 0 6 Розчин бетафенантроліна 0 7 0 7 0 7 Перемішують. Забарвлення розвивається за 20-30 с. Колориметрують проти холостої проби Розрахунок результатів Сз= Еоп · 30 мкмоль/л Ест Визначення залізозв'язуючої здатності сироватки крові. Діапазони вимірювань Об'єкти досліджень Діапазон концентрацій що визначаються Коефіцієнт варіації визначення CV % Залізозв'язуюча здатність сироватки крові Не більше 5 % Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання яке здатне вимірювати оптичну щільність розчинів при довжині хвилі нм та довжині оптичного шляху 10 мм. Пробірки ємністю 10 мл ГОСТ 1770-74 піпетки ємністю 1 0; 2 0; 5 0 мл ГОСТ 29227-91 . Реактиви та матеріали для проведення досліджень 1. Залізо хлорне; 2. Карбонат магнію порошок ; 3. Реактиви необхідні для визначення сироваткового заліза; Метод вимірювань Досліджувану сироватку витримують з розчином 3-х валентного заліза при цьому весь трансферин насичується. Надлишок солей заліза видаляють абсорбцією на карбонаті магнію та визначають вміст заліза в надосадовій рідині. Підготовка до виконання вимірювань Приготування розчину хлорного заліза: 2 42 г FeCl3·6H 2O розчиняють у 100 мл 0 005 н НСl. Виконання вимірювань До 2 мл досліджуваної сироватки додають 4 мл розчину хлорного заліза та перемішують. Через 5 хв додають порошок магнію карбонату в об'ємі 0 5 мл перемішати 10-15 хв та центрифугують. В надосадовій рідині визначають залізо. Отриманий результат помножити на 3 розведення сироватки . Визначення показників обміну заліза Визначення загальної залізозв'язуючої здатності сироватки крові ЗЗЗЗ набір реактивів Філісіт-Діагностика Діапазони вимірювань ЗЗЗЗ № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сироватка гепаринізована плазма крові Від 4 0 до 200 0 мкмоль/л Показники точності вимірювань Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Коефіцієнт варіації визначення Сироватка гепаринізована плазма крові Від 4 0 до 200 0 мкмоль/л ? 5% Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Фотометричне обладнання що забезпечує вимір оптичної щільності розчинів при довжині хвилі від 530 до 590 нм максимум поглинання при 562 нм у діапазоні від 0 до 1 0 од. Кювета з довжиною оптичного шляху 10 або 5 мм. Пробірки місткістю 10 мл ГОСТ 1770-74 . Піпетки місткістю 1 0; 0 1 та 5 0 мл ГОСТ 29227-91 . Центрифуга для пробірок швидкість від 2000 до 5000 об/хв. . Склад набору реактивів: Буферний розчин - 1 флакон 100 ± 4 мл; Колірореагент феррозин 20 ± 2 г/л - 1 пробірка 2 ± 0 1 мл; Калібрувальний розчин заліза 20±0 5 ммоль/л або 112 ± 3 мкг % - 1 флакон 8 ± 0 5 мл; Насичуючий розчин заліза 90 ± 10 ммоль/л - 1 флакон 50 ± 2 мл; Сорбент лужний карбонат магнію - 1 флакон 10 ± 1 г; Деіонізована вода - 1 флакон 8 ± 0 5 мл. Склад реакційного розчину в пробі: Феррозин > 1 10 ммоль/л; тіосечовина - 11 90 ммоль/л; гуанідину гідрохлорид - 3 75 моль/л; гідроксил аміну гідрохлорид > 60 ммоль/л; гліцин HCl - 0 2 моль/л. Метод вимірювання Принцип методу: трансферин в непатологічних сироватках зв'язує іони заліза до 1/3 свого об'єму. Для насичення трансферину сироватку обробляють надлишковою кількістю іонів Fe+3. Від не зв'язаних іонів заліза розчин звільняють за допомогою карбонату магнію. Визначаючи концентрацію заліза в насиченій сироватці знаходять її загальну залізозв'язуючу здатність ЗЗЗЗ чи TIBC . Різниця між ЗЗЗЗ та залізом в сироватці крові - це ненасичена залізозв'язуюча здатність НЗЗЗ сироватки UIBC . ЗЗЗЗ чи TIBC = концентрація заліза у сироватці + НЗЗЗ чи UIBC . Підготовка та виконання вимірювань Розчини готові та придатні до використання після відкупорювання флаконів на протязі місяця при зберігання від +2 до +8 ?С. Проведення аналізу - згідно зі схемою наведеною у таблицях Таблиця 1 Відміряти у пробірку мл Напівмікроаналіз Макроаналіз Насичуючий розчин заліза Сироватка плазма 1 0 0 5 2 0 1 0 Перемішують вміст пробірок та витримують їх 5-6 хв. при кімнатній температурі від плюс 20 до плюс 25 ?С . Сорбент 0 1-0 2 г близько 0 5 мл 0 2-0 4 г близько 1 0 мл На шпателі або скальпелі внести у пробірку сорбент в приблизній кількості згідно з таблицею. Тримають 5-10 хв. при кімнатній температурі від плюс 20 до плюс 25 ?С збовтуючи кожні 2-3 хв. Центрифугують 9-10 хв. 2000-5000 об/хв. та проводять визначення концентрації заліза у супернатанті. Визначення проводять згідно з таблицями 1 та 2 з супернатантом замість сироватки. Таблиця 2 Відміряє мий об'єм мл Дослідна проба Калібрувальна проба Холоста проба Мікро аналіз Напівмікро аналіз Макро аналіз Мікро аналіз Напівмікро аналіз Макро аналіз Мікро аналіз Напівмікро аналіз Макро аналіз Буферний розчин Сироватка плазма Калібр. розчин Деіонізована вода 1 0 0 2 - - 2 0 0 5 - - 4 0 1 0 - - 1 0 - 0 2 - 2 0 - 0 5 - 4 0 - 1 0 - 1 0 - - 0 2 2 0 - - 0 5 4 0 - - 1 0 Вимір. опт. щільності Едосл Екал - Витримують 5-10 хв. при кімнатній температурі виміряють оптичну щільність дослідної Едосл і калібрувальної Екал проб проти холостої. Колірореагент 0 02 0 04 0 08 0 02 0 04 0 08 0 02 0 04 0 08 Вимір. опт. щільності Едосл' Екал' - Перемішують витримують 15-20 хв. виміряють оптичну щільність дослідної Едосл' та калібрувальної Екал' проб проти холостої з колірореагентом. Обробка результатів вимірювань Концентрацію заліза в супернатанті ммоль/л чи мкг % розраховують за формулою. А знайдену за формулою концентрацію заліза в супернатанті необхідно помножити на коефіцієнт розведення - 3. Отриманий результат означає ЗЗЗЗ TIBC . ЗЗЗЗ= Скалібратора · Едосл' - Едосл · 3 де / Екал' - Екал Скалібратора - концентрація заліза в калібрувальному розчині 20 мкмоль/л чи 112 мкг% ; Едосл; Едосл; Екал; Екал - оптичні щільності розчинів од. опт. щільності; 3 - коефіцієнт розведення. Для розрахунку ненасиченої залізозв'язуючої здатності сироватки НЗЗЗ чи UIBC із знайденого значення ЗЗЗЗ вилучають концентрацію заліза в сироватці чи плазі крові. НЗЗЗ = ЗЗЗЗ - Залізо у сироватці % Насичення трансферину = Залізо у сироватці ? 100 / ЗЗЗЗ Визначення молекул середньої маси спектрофотометричним методом. Діапазони вимірювань молекул середньої маси № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сироватка крові при ? = 254 нм СМ до 0 246 у.од. при ? = 280 нм СМ до 0 296 у.од. Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань СМ у сироватці крові які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Сироватка крові при ? = 254 нм СМ до 0 246 у.од. при ? = 280 нм СМ до 0 296 у.од. 1 2 1 4 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Спектрофотометр або фотометр довжина хвилі 230-350 нм Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Колби ємністю 50; 100; 500 см3; пробірки 10 0 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1 0; 2 0 см3 за ГОСТ 20292 Реактиви та матеріали для проведення досліджень Трихлороцтова кислота ТХО 15% Метод вимірювань Спектрофотометрично вимірюють рівень середніх молекул СМ вимірюючи екстинкцію сироватки крові після осадження великомолекулярних білків та ліпідів ТХО. Вимірюють дві фракції СМ: фракція яка містить ароматичні амінокислоти ? = 280 нм та яка не містить ароматичних амінокислот ? = 254 нм Підготовка та виконання вимірювань До 1 мл свіжої сироватки додають 0 5 мл розчину ТХО перемішують скляною паличкою центрифугують при 3000 об/хв. на протязі 30 хв. До 0 5 мл центрифугата додають 4 5 мл дистильованої води перемішують вимірюють оптичну щільність на спектрофотометрі при ? = 254 нм чи при ? = 254 нм в кюветі з довжиною робочого слою 10 мм проти холостої проби 0 25 мл розчину ТХУ + 4 75 мл Н2О . Обробка результатів вимірювань Рівень СМ визначають в умовних одиницях у.од. котрі кількісно відповідають показникам екстинкції. Визначення в тканинах активності загальної АТФази Mg-АТФази і Na K-АТФази Діапазони вимірювань АТФаз № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Гомогенат органів 8 0 - 16 5 мг Р/г тканини Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань АТФаз які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Сироватка крові 8 0 -16 5 мг Р/г тканини 0 50 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Спектрофотометр або фотометр довжина хвилі 420-500 нм Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Баня водяна Колби ємністю 50; 100; 500 см3; пробірки 10 0 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1 0; 2 0;5 0; 10 0 см3 за ГОСТ 20292 Реактиви та матеріали для проведення досліджень Молібдат амонію аміак концентрований Ванадат амонію концентрована HNO3 ч.д.а. ТХО Трис-HCl-буфер концентрована HCl Метод вимірювань В основу методу покладена реакція неорганічного фосфату що утворюється при інкубації АТФази гомогенатів тканин у АТФ-вміщуючому середовищі з молібдованадатним реактивом що призводить до утворення фосфомолібдованадатного комплексу жовтого кольору який колориметрують при синьому світофільтрі. Підготовка до виконання вимірювань Реактив І. До 10 г молібдата амонію доливали 1 мл концентрованого розчину NH3 і доводять загальний обсяг до 100 мл дистилятом. Реактив ІІ. У 40 мл гарячої води розчиняють 0 235 г ванадату амонію охолоджують. Додають суміш що містить 1 4 мл H2O і 0 616 мл концентрованої HNO3. Доводять загальний обсяг до 100 мл дистилятом. Реактив ІІІ. 70 мл водяного розчину містить 30 мл ТХО 20 мл дистильованої води і 10 мл реактивів І ІІ. Інкубаційна суміш pH 7 4 . Готують Трис-HCl-буфер pH 7 4 додавши до 441 мг Трис 0 24 мл концентрованої HCl і 75 мл дистильованої води. Далі суміш готують за схемою : На 100 мл готовим: Трис-HCl-буфер рН 7 4 додаємо к 441мг Трис 0 24 мл концентрированої HCl та 75 мл дистильованої воды. Раствор стійкий. 1. На 100 мл воды - MgCl2·6 H2O 3г; 2. На 100 мл - NaCl 10г; 3. На 100 мл - KCl 2 7г; 4. Na2ATP 1% в ампулах; 5. Строфантин в ампулах 0 44%. Виконання вимірювань Трис-HCI-буфер мл MgCl2·6 H2O мл NaCl мл KCl мл Na2ATP мл H2O мл Строфантин мл Гомогенат мл Mg2+-АТФаза 0 1 0 1 - - 0 2 0 8 0 3 0 3 Загальна АТФаза 0 1 0 1 0 1 0 5 0 2 0 5 - 0 3 Концентрація реактивів у пробі 2 1 мМ 2 мМ 100 мМ 10 мМ 2 мМ 1. Визначення загальної активності Mg2+ Na+/K+-АТФаз. До 0 3 мл гомогенату органів швидко доливають 1 мл інкубаційного середовища після чого інкубують 15 хв при 37°С. Потім швидко додають 3 мл реактиву III та 2 мл дистильованої води і центрифугують 5 хв при 3000 об/хв. Надосадова рідина використовується для визначення оптичної щільності при ?= 490 нм. 2. Визначення активності Mg2+Атфази.До 0 3 мл гомогенату органів швидко доливають 1 мл 0 2 мл уабаїну стофантин К інкубаційного середовища 1 мл після чого інкубують 15 хв при 37°С. Потім додають 3 мл реактиву III та 1 8 мл дистильованої води і центрифугують 5 хв при 3000 об/хв. Надосадова рідина використовується для визначення оптичної щільності при ?= 490 нм. 3. Визначення активності Na+/K+-АТФази обчислюється по активності загальної та Mg2+ -АТФази. Розрахунок активності мг Р/г тканин проводять за формулами: Загальна АТФаза: Мг Р/г тканини А = С1 · V3 · V2 / V1 · 1000 Mg2+ -АТФаза: Мг Р/г тканини А1 = С2 · V3 · V2 / V1 · 1000 Na+/K+-АТФаза: А2 = А - А1 А - активність АТФази С1 - концентрація фосфату яка знайдена в пробі для загальної АТФази С2 - концентрація фосфату яка знайдена в пробі для Mg2+ -АТФази V3 - кількість розчину в кюветі V2 - загальний об'єм гомогенату V1 - об'єм гомогенату в пробі 1000 - коефіцієнт перерахунку. Значення показників спектрофотометру визначали за градуювального графіку отриманого для шляхом визначення стандартних розчинів K2HPO4. Побудова градуювального графіку. До отриманих розведень які містять від 0 06 до 50 мг K2HPO4 додавали 3 мл реактиву III для контролю брали дистильовану воду. Розчин використовують для визначення оптичної щільності ?= 490 нм. Визначення масової концентрації вітаміну Е в сироватці крові. Діапазони вимірювань вітаміну Е № Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання 1 Сироватка крові 0 20-0 50 мг/100 Показники точності вимірювань Методика забезпечує розбіжність результатів паралельних вимірювань вітаміну Е у сироватці крові які наведені у таблиці р ? 0 05 . Об'єкти дослідження Діапазон вимірювання Розбіжність не більше d відн. % Сироватка крові 0 20-0 50 мг/100 0 05 Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Флюорат довжина хвилі 320 нм Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Холодильник Колби ємністю 50; 100; 500 см3; пробірки 10 0 см3 за ГОСТ 1770; мікропіпетки ємністю 0 01 см3; піпетки ємністю 1 0; 2 0 см3 за ГОСТ 20292 Реактиви та матеріали для проведення досліджень Дистильована вода Гексан Етиловий спирт Стандартний розчин ?-токоферолацетату Метод вимірювань Метод заснований на визначенні флуоресценції ?-токоферолу в гексановому екстракті сироватки яка була попередньо оброблена водою та етанолом. Виконання вимірювань У 2 центрифужні пробірки додають 1 мл дистильованої води та 1 мл етанолу. Потім в одну з них додають 1 мл дист. води контроль в іншу 1 мл сироватки крові. Пробірки струшують. Після цього додають 5 мл гексану та струшують 1 хв. Потім проби центрифугують 1500 об/хв 10 хв. Отриманий гексановий шар вимірюють на апараті флюорат. Обробка результатів вимірювань Масову концентрацію вітаміну Е Х мкг/см3 у сироватці обчислюють за формулою: Вітамін Е = Соп·Vе·Q де Vc Соп - концентрація вітаміну Е в екстракті; Vе - об'єм екстракту; Vc - об'єм сироватки крові; Q - коефіцієнт розбавлення екстракту. Q = Vк де Vразб Vк - об'єм розбавленого екстракту; Vк - об'єм екстракту взятого для розбавлення. 3.3 ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ. ІМУНОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ Оцінка реакції периферичної крові Визначення швидкості осіданню еритроцитів ШОЄ Метод дозволяє візуально визначити швидкість осідання еритроцитів. Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали: Апарат Панченкова штатив та капіляри Пробірки центрифужні ємністю 10 0 см3 за ГОСТ 1770-74 Натрію цитрат ч.д.а. Метод визначення Принцип методу полягає у здатності розподілу суміші крові з цитратом натрію при стоянні на два прошарки нижній - еритроцити верхній - плазма . При цьому ШОЕ тобто розмір стовпчику плазми буває різним в залежності від фізико-хімічних властивостей крові. Підготовка до визначення Приготування 5 % розчину цитрату натрію С6Н5О7Na3 • 5Н2О 5 г цитрату натрію розчиняють у 100 см3 дистильованої води Проведення визначення Перед використанням хімічно-чистий капіляр промивають цитратом натрію заповнюють до позначки 0 75 та переносять в пробірку. Набирають повний капіляр крові до позначки 0 та переносять у пробірку з цитратом. При цьому отримують співвідношення крові та цитрату 4/1. Вміст пробірки добирають до позначки 0 суміш крові з цитратом . За допомогою пальцю закривають верхній кінець капіляру обережно щоб кров з капіляру не вилилася вставляють капіляр у штатив обов'язково вертикально спираючи нижній його кінець на гумову підкладку та притискаючи верхній кінець підкладкою або корком. За годину відмічають ШОЕ за висотою відстояного шару плазми в сантиметрах. Дослідження формових елементів крові морфологічним методом з диференційованим підрахуванням лейкоцитарної формули. Метод дозволяє диференціювати різні форми лейкоцитів. Мікроскопія фіксованих та забарвлених мазків крові з диференціюванням різних форм лейкоцитів. Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви Мікроскоп Біолам Ломо Лічильник для підрахування формових елементів крові Предметне скло Шліховане скло Суміш Нікіфорова Етиловий спирт Ефір діетиловий Еозин метиленовий за Май-Грюнвальдом розчин Азур-еозин за Романовським розчин Олія імерсійна Метод визначення Принцип методу полягає в мікроскопії фіксованих та забарвлених мазків крові з диференціюванням різних форм лейкоцитів. Підготовка до визначення Суміш Нікіфорова готується шляхом з'єднання рівних об'ємів 1:1 етанолу та ефіру. Розчин Романовського-Гімза розчиняють у воді одна крапля фарби у 1 см3 дистильованої води Проведення визначення На предметне скло попередньо знежирене сумішшю Нікіфорова та витерте насухо наносять мазок крові. Мазки підсушують на повітрі та маркують. Мазок повинен бути рівномірно тонким та закінчуватися "віничком". Висушені на повітрі мазки розташовують в контейнері який опускають у кювету з фіксатором на 10 хв. Фіксація проводиться розчином еозинметиленового синього за Майя-Грюнвальдом. Далі скельця виймають промивають в проточній воді та переносять у кювету з робочим розчином фарби Романовського-Гімза на чітко визначений час підібраний для кожної партії барвника. Після цього виймають контейнер зі скельцями з кювети з барвником промивають водопровідною водою та підсушують на повітрі. Для мікроскопії використовують імерсійний об'єктив 90х . Краплю імерсійної олії наносять на край мазку крові. Об'єктив занурюють у краплю олії. Підбирають за допомогою мікрогвинта відповідну фокусну відстань таку що дозволила б чітко розглядати клітини. Обробка результатів Починають диференціювати лейкоцити відмічають клітини за допомогою 11-клавішного лічильника; необхідно підрахувати не менш як 100 лейкоцитів. Підрахування лейкоцитів проводять виконуючи таке правило: відступивши 2-3 поля зору від краю мазка 3-5 полів зору впродовж краю мазка; 3-5 полів зору під прямим кутом в напрямку до середини мазка знову 3-5 полів зору паралельно краю; далі - під прямим кутом до краю і т.д. Порахувавши близько половини клітин з одного боку мазка змінюють положення скла і другу половину клітин рахують на протилежному боці. Результат виражають у відсотках. При водних навантаженнях у тварин важлива стабільність показників кількості еритроцитів гемоглобіну і кольорового показника що свідчить про безпеку дії досліджуваної води на організм. Коливання складу заліза у сироватці мають значення при моделюванні залізодефіцитних анемій та корекції її внутрішнім прийомом залізистих мінеральних вод. Метод визначення кількості Т- та В-лімфоцитів методом розеткоутворювання . Метод дозволяє візуально за допомогою світлового мікроскопу визначити кількість Т- та В-лімфоцитів периферійної крові. Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви. Ваги лабораторні 4-го класу точності ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 2-го класу точності ГОСТ 24104 Мікроскоп Лічильник лабораторний Годинник лабораторний Термостат Центрифуга лабораторна Холодильник Камера Горяєва Еозин метиленовий за Май-Грюнвальдом Натрію хлорид ч.д.а. Вода дистильована Олія імерсійна Еритроцити барану Еритроцити миші Теофілін Середовище 199 Посуд мірний скляний: мірні центрифужні пробірки пастерівські піпетки піпетки на 1 0 см3; 0 1 см3 10 см3 за ГОСТ 20292 Предметне скло Штатив для пробірок Метод визначення Принцип методу полягає у здатності Т- В-лімфоцитів та їх популяцій утворювати розетки з гетерогенними еритроцитами. Підготовка до визначення Приготування фізіологічного розчину 8 5 г хлориду натрію розчиняють у невеликому об'ємі дистильованої води переносять в колбу ємністю 1000 см3 та доводять до мітки дистильованою водою. Приготування 0 5 % зависі еритроцитів баранів До 0 05 см3 еритроцитів барану додають 9 55 см3 фізіологічного розчину Приготування 0 5 % зависі еритроцитів миші До 0 05 см3 еритроцитів миші додають 9 55 см3 фізіологічного розчину Приготування робочого розчину еуфіліну До 1 0 см3 2 4 % розчину еуфіліну додають 9 0 см3 фізіологічного розчину Приготування розчину фікол-уротраст 9 г фіколу розчиняють у 100 см3 киплячої дистильованої води. До розчину фіколу додають 40 см3 76 % верографіну або тріомбрасту. Після охолодження за допомогою ареометра доводять дистильованою водою до отримання суміші з питною вагою до 1 077. зберігають у щільно закритому посуді у холодильнику Приготування фіксатора До 85 см3 фосфатного буфера рН - 7 2 додають 12 см3 40 % формаліну та 3 см3 25 % глутарового альдегіду Проведення визначення Виділення лімфоцитів: 2 см3 гепаринизованої крові розводять 1:2 середовищем 199 обережно нашаровують пастерівською піпеткою на суміш фіколу-тріомбрасту з питомою вагою 1 077 по 2 см3 на кожну пробірку. Центрифугують при 1000 об/хв протягом 30 хв. Збирають кільця лімфоцитів в одну пробірку додають 8 см3 середовища 199 та центрифугують 10 хв при 1000 об/хв 3 рази . До осаду додають 1 см3 середовища 199 ресуспензують підраховують кількість у 4 великих квадратах камери Горєва та доводять до 2х106/мл . Мазки підсушують на повітрі при кімнатній температурі та заливають барвником-фіксатором Май-Грюнвальда. Фарбу зливають мазки промивають водою та підсушують. Слідуючи етапи визначення різних субпопуляций Т- та В-лімфоцитів наведені у таблиці: Т-лімфоцити Т-активні лімфоцити Теофілін-резистентні лімфоцити ТФР Контроль В-лімфоцити До 0 1 см3 зависі лімфоцитів додають 0 1 см3 0 5 % розчин еритроцитів барану До 0 1 см3 зависі лімфоцитів додають 0 1 см3 0 5 % розчин еритроцитів барану До 0 1 см3 зависі лімфоцитів додають 0 1 см3 0 1 % розчин еуфіліну До 0 1 см3 зависі лімфоцитів додають 0 1 см3 середовища 199 До 0 1 см3 зависі лімфоцитів додають 0 1 см3 0 5 % розчин еритроцитів миші Інкубують 5 хв при 37 ?С Центрифугують 5 хв при 1500 об/хв Інкубують 30 хв при 37? С Інкубують 5 хв при 37 ?С Центрифугують 5 хв при 1500 об/хв Додають 0 02 см3 фіксатору Додають 0 1 см3 0 5 % розчин еритроцитів барану Додають 0 1 см3 0 5 % розчин еритроцитів барану Центрифугують 5 хв при 1500 об/хв. Зупиняють реакцію протягом 60 хв при 37 ?С Інкубують 10 хв при кімнатній температурі Інкубують 5 хв при 37 ?С Зупиняють реакцію протягом 60 хв при 37 ?С Додають 0 02 см3 фіксатору Додають 7см3 дистильованої води Центрифугують 5 хв при 1500 об/хв Додають 0 02 см3 фіксатору Інкубують 10 хв при кімнатній температурі Центрифугують 5 хв при 1500 об/хв Додають 0 02 см3 фіксатору Додають 0 02 см3 фіксатору Інкубують 10 хв при кімнатній температурі Додають 7 см3 дистильованої води Осад ресуспензують та роблять мазок Інкубують 10 хв при кімнатній температурі Додають 7 см3 дистильованої води Центрифугують 5 хв при 1500 об/хв Додають 7 см3 дистильованої води Додають 7 см3 дистильованої води Центрифугують 5 хв при 1500 об/хв. Осад ресуспензують та роблять мазок Центрифугують 5 хв при 1500 об/хв Осад ресуспензують та роблять мазок Осад ресуспензують та роблять мазок Осад ресуспензують та роблять мазок Обробка результатів Облік проводять під імерсіонною системою мікроскопу при ОБх7 ОКх90. У кожному мазку нараховують не менше 100 лімфоцитів одночасно помічаючи відсоток лімфоцитів які утворюють розетки лімфоцити які приєднали до себе три або більш еритроцитів . Для визначення Теофілінчутливих ТФЧ лімфоцитів від контролю віднімають кількість ТФР. Визначають відношення ТФР/ТФЧ. Для визначення абсолютної кількості лімфоцитів г/л Т-лімфоцити Т-активні лімфоцити ТФР В-лімфоцити - відсоток лімфоцитів клітини субпопуляції помножають на кількість лейкоцитів 109 г/л та ділять на 100. Метод визначення лейкоцитів периферійної крові Метод дозволяє візуально за допомогою світлового мікроскопу та камери Горяєва визначити кількість лейкоцитів периферійної крові. Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви: Мікроскоп Камера Горєва Капіляр на 0 02 см3 Пробірки центрифужні ємністю 10 0 см3 за ГОСТ 1771-74 піпетки на 1 0 см3 за ГОСТ 20292 Оцтова кислота Метиленова синька Метод визначення Принцип методу полягає у обліку лейкоцитів в 1 мкл крові при постійному її розчині та об'ємі облікової камери. Підготовка до визначення Приготування 3 % розчину оцтової кислоти. До 97 см3 дистильованої води додають 3 см3 концентрованої оцтової кислоти. Проведення визначення У пробірку з 0 4 см3 3 % розчину оцтової кислоти додають 0 02 см3 капілярної крові. Добре перемішують. Шліфоване покривне скло притирають до камери Горяєва і залишають на 1 хвилину. Облік проводять за допомогою світлового мікроскопу ОКх10; ОБх8 підраховуючи у 100 великих квадратах. Обробка результатів Результати обліку у великих квадратах сумують та визначають кількість лейкоцитів у 1 мкл крові по формулі: Х = а · 4000 · 20 де 1600 Х - кількість лейкоцитів у 1 мкл; а - кількість лейкоцитів перелічених у 100 великих квадратах; 1600 - кількість малих квадратів; 20 - розведення крові; 4000 - приводить результат до об'єму 1 мкл крові який сходить з об'єму малого квадрату 1/4000мкл . На практиці кількість лейкоцитів які підраховані у 1600 малих квадратах помножають на 50 а для переводу в одиниці СІ г в 1 л отриману цифру треба помножить ще на 106. Метод визначення еритроцитів периферійної крові Метод дозволяє візуально за допомогою світлового мікроскопу та камери Горяєва визначити кількість еритроцитів в периферійної крові. Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви: Мікроскоп Камера Горєва Капіляр на 0 02 см3 Пробірки центрифужні ємністю 10 0 см3 за ГОСТ 1771-74 піпетки на 1 0 см3 за ГОСТ 20292 Фізіологічний розчин Метод визначення Принцип методу полягає у обліку еритроцитів в 1 мкл крові при постійному її розчині та об'ємі облікової камери. Підготовка до визначення Приготування фізіологічного розчину 8 5 г хлориду натрію розчиняють у невеликому об'ємі дистильованої води переносять в колбу ємністю 1000 см3 та доводять до мітки дистильованою водою. Проведення визначення У пробірку з 4 см3 фізіологічного розчина додають 0 02 см3 капілярної крові. Добре перемішують. Шліфоване покривне скло притирають до камери Горяєва і залишають на 1 хвилину. Облік проводять за допомогою світлового мікроскопу ОКх10; ОБх8 підраховуючи у 5 великих квадратах розкреслених на 16 малих розташованих по діагоналі. Обробка результатів Кількість еритроцитів у 1 мкл крові визначають по формулі: Х = а · 4000 · 20 де 80 Х - кількість еритроцитів у 1 мкл; а - кількість лейкоцитів перелічених у 80 малих квадратах; 80 - кількість малих квадратів у яких проводили рахунок 5х16=80 ; 200 - розведення крові; 4000 - приводить результат до об'єму 1 мкл крові який сходить з об'єму малого квадрату 1/4000мкл . На практиці кількість еритроцитів які підраховані у 80 малих квадратах помножають на 10000 а для переводу в одиниці СІ Г в 1 л отриману цифру треба помножить ще на 106. Визначення концентрації гемоглобіну гемоглобінцианідним методом. Метод дозволяє за допомогою набору реактивів та фотоелектрокалориметра визначити концентрацію гемоглобіну у крові. Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви: Фотоелектроколориметр Капіляр на 0 02 см3 Пробірки центрифужні ємністю 10 0 см3 за ГОСТ 1771-74 Піпетки на 10 0 см3 за ГОСТ 20292 Трансформуючий розчин Стандартний розчин гемоглобінцианіду Метод визначення Принцип методу полягає у тому що під впливом залізосинеродістого калію гемоглобін окислюється у метгемоглобін гемоглобін який в свою чергу відтворює з ацетонциангидритом забарвлений продукт - гемоглобінцианід HbiCN яскравість забарвлення якого пропорційна вмісту гемоглобіну. Підготовка до визначення Приготування трансформуючого розчину 0 5 см3 ацетонцеангідрину 200 см3 залізосиньородистого калію K3[Fe CN 6] 1см3 бікорбанату натрію NaHCO3 дистильованої води до 1 дм3. Реактив зберігають у темному посуді при кімнатної температурі. Хід визначення До 5 см3 трансформуючого розчину додають 0 2 см3 крові. Розчинення крові при цьому здійснюється 251 раз. Вміст пробірки перемішують та залишають на 10 хв при кімнатній температурі а потім проводять вимірювання на фотоколориметрі при довжині хвилі 500-560 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм відносно "холостої" проби трансформуючого розчину. Стандартний розчин вимірюють при тих же умовах. Построєння калібрувального графіку. З стандартного розчину гемоглобінцианіду готують розведення. Пробірки Стандартний розчин мл Трансформуючий розчин мл Концентрація гемоглобіну г % 1 - 6 "холоста" 2 2 4 5 3 4 2 10 4 6 - 15 Приготовлені розведення колориметрують відносно "холостої" проби. Обробка результатів Концентрацію гемоглобіну визначають по калібрувальному графіку або по формулі: Hb г/л = Едос · С · К · 0 01 де Ест Едос - екстинкція дослідної проби; Ест - екстинкція стандартного розчину; С - концентрація геміглобінцианіду у стандартному розчині мг %; К - коефіцієнт розведення крові; 0 01 - коефіцієнт перерахування мг % в г/л. Метод визначення кількості СД3+ СД4+ СД8+ СД16+ СД20+ лімфоцитів методом імунофлюорисценції Метод дозволяє візуально за допомогою набору моноклональних антитіл та люмінесцентного мікроскопу визначити кількість СД3+ СД4+ СД8+ СД16+ СД20+ лімфоцитів. Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви: Ваги лабораторні 2-го класу точності ГОСТ 24104 Мікроскоп флюорисцентний Мікроскоп світловий Лічильник лабораторний Годинник лабораторний Термостат Центрифуга лабораторна Холодильник Камера Горяєва Натрію хлорид ч.д.а. Вода дистильована Олія імерсійна люмінесцентна Парафін Набор моноклональних та поліклональних антитіл для визначення диференцийовочних антигенів лейкоцитів людини методом імунофлюорисценції моноклональні антитіла до визначення кількості СД3+ СД4+ СД8+ СД16+ СД20+ лімфоцитів; ФІТЦ-коньюгат Розчин полі-L-лізіну МВ 40000 Дозатор піпетковий на 0 02 см3 Дозатор піпетковий на 0 05 см3 Посуд мірний скляний: мірні центрифужні пробірки на 10 см3 пастерівські піпетки піпетки на 1 0 см3; 0 1 см3 10 см3 за ГОСТ 20292 Предметне скло Штатив для пробірок Метод визначення Принцип методу полягає у здатності моноклональних антитіл зв'язуватися з маркерами клітинної мембрани і за допомогою люмінесцентного мікроскопу підраховувати імунофлюорисцентно забарвлені клітини. Підготовка до визначення Приготування фізіологічного розчину 8 5 г хлориду натрію розчиняють у невеликому об'ємі дистильованої води переносять в колбу ємністю 1000 см3 та доводять до мітки дистильованою водою. Приготування розчину фікол-уротраст 9 г фіколу розчиняють у 100 см3 киплячої дистильованої води. До розчину фіколу додають 40 см3 76 % верографіну або тріомбрасту. Після охолодження за допомогою ареометра доводять дистильованою водою до отримання суміші з питною вагою до 1 077. Зберігають у щільно закритому посуді у холодильнику Приготування моноклональних антитіл та ФІТЦ До робочого розчину моноклональних антитіл та ФІТЦ-коньюгату додають по 1 1 см3 дистильованої води. Через 10 хвилин розчин перемішати піпетуванням. Проведення визначення Виділення лімфоцитів: 2 см3 гепаринизованої крові розводять 1:2 середовищем 199 обережно нашаровують пастерівською піпеткою на суміш фіколу-тріомбрасту з питомою вагою 1 077 по 2 см3 на кожну пробірку. Центрифугують при 1000 об/хв протягом 30 хв. Збирають кільця лімфоцитів в одну пробірку додають 8 см3 фізіологічного розчину та центрифугують 10 хв при 1000 об/хв 3 рази . До осаду додають 1 см3 фізіологічного розчину ресуспензують підраховують кількість у 4 великих квадратах камери Горєва та доводять до 2х106/мл. Далі реакцію проводимо на предметному склі. Для цього в полозки з Парафіном розміром з предметне скло за допомогою пробійника роблять 6 отворів розміром 5 мм. Полозку з отворами розміщують на скло та ледь підогрівають для присипання Парафіну. У кожну лунку додають 0 05 см3 розчину полі-L-лізіну та інкубують протягом 30 хв в термостаті при температурі 37 ?С. Розчин полі-L-лізіну за допомогою піпетки убирають а скло підсушують на повітрі. В отвори додають по 0 05 см3 клітинної суспензії та інкубують протягом 30 хв в вологій камері в термостаті при температурі 37 ?С. Для осідання та присипання клітин к склу. Потім скло промивають у фізіологічному розчині та в лунки додають по 0 02 см3 робочого розчину відповідних моноклональних антитіл інкубують протягом 30 хв при кімнатній температурі в вологій камері. По закінченню інкубації скло два рази промивають фізіологічним розчином та в лунки додають по 0 02 см3 робочого розчину ФІТЦ-коньюгату інкубують протягом 30 хв в вологій камері при температурі 2-8 ?С. По закінченню інкубації скло 4 рази промивають фізіологічним розчином. Обробка результатів Результати реакції слід проводити не пізніше 24 годин після її виконання. Зберігати препарати від дії прямого інтенсивного світла. Мікроскопію проводити у затемненому приміщенні за допомогою люмінесцентного мікроскопу при ОБ х 90 та ОК х 7-10 та набору фільтрів для праці з ФІТЦ. Додатковим результатом вважають клітини які світяться по периферії. У кожному мазку нараховують не менш 100 клітин одночасно при люмінесценції помічають відсоток клітин які світяться. Визначення лейкоцитарного індексу інтоксикації ЛІІ Метод дозволяє за допомогою математичної формули визначити ЛІІ. ЛІІ визначається на підставі результатів загальних аналізів крові. Підрахунок здійснюється з використанням загальної кількості лейкоцитів крові та кількості нейтрофілів у %. Засоби вимірювальної техніки Калькулятор Проведення визначення Лейкоцитарний індекс інтоксикації розраховують за допомогою формули Кальф-Каліфа С.Ф. Фоміча в модифікації А.Л. Костюченко и співавт. 2000 ЛІІ= 0 1·L 109/л ·нейтрофіли % де 100 - нейтрофіли % ЛІІ - лейкоцитарний індекс інтоксикації; L - абсолютна кількість лейкоцитів. Метод визначення кількості імуноглобулінів класів G А М у сироватці крові Метод дозволяє визначити кількість Ig G А М за допомогою набору моноспецифічних сироваток шляхом радіальної імунодифузії у гелі. Засоби вимірювальної техніки допоміжні пристрої реактиви: Ваги торсіонні Штамп для отворів Електрична плітка Фізіологічний розчин Агар Чашки Петрі Посуд мірний скляний: мірні центрифужні пробірки на 10 см3 піпетки на 0 1 см3 10 см3 за ГОСТ 20292 Штатив для пробірок Лінійка Метод визначення Принцип методу полягає у тому що антиген внесений у лунки агарового гелю маючого антитіла до цього антигену дифундує крізь гель та взаємодіючи з антитілами утворює кільце преципітації. При одно- та дводобової інкубації утворюється лінійна залежність між логарифмом концентрації та діаметром кільця в визначеним діапазоні концентрацій. Підготовка до визначення Приготування фізіологічного розчину 8 5 г хлориду натрію розчиняють у невеликому об'ємі дистильованої води переносять в колбу ємністю 1000 см3 та доводять до мітки дистильованою водою. Приготування 3 % розчину агару До 0 9 г агару додають 30 см3 фізіологічного розчину. Колбу з розчином агару доводять до кипіння на водяній бані до повного розчину агару. Приготування робочих розчинів моноспецифічних сироваток В кожну ампулу з моноспецифічною сироваткою додають по 1 см3 дистильованої води. А потім розчиняють фізіологічним розчином до концентрації у 2 рази вище титру який є на ампулі в об'ємі 4 см3. Проведення визначення У пробірку до 4 см3 3 % розчином агару температурою 56 ?С додають 4 см3 розчиненої моноспецифічної сироватки у робочої дозі. Перемішують та заливають у чашки Петрі. Обережно чашки ставлять на рівну поверхню та у агар ставлять штампи. Після того як агар застане штампи виймають. В лунки за допомогою мікрошприца вносять контрольну сироватку цільну та в розведеннях 1:2 1:4 1:8 для будування графіку та дослідні сироватки. В лунки в чашці з моноспецифічною сироваткою проти Ig G та Ig А вносять по 0 002 см3 а в чашку з сироваткою проти Ig М по 0 003 см3. Чашки розташовують у вологу камеру при 20-22 ?С на 24 години для Ig G та Ig А і на 48 годин для Ig М. Проведення визначення Концентрацію імуноглобулінів у дослідних зразках визначають за допомогою калібрувальної кривої яка збудована по діаметру кілець преципітації контрольної сироватки. Для цього на полулогарифмічному папері по осі абсцис відкладаємо діаметри кілець а по осі ординат - відому концентрацію імуноглобуліну у мг/мл. Таким чином будують графіки для кожного імуноглобуліну G А М . Кут калібрувального графіку потрібен бути 40-50 ?С. 3.4 МОРФОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ 3.4.1 Гістологічні методики Забарвлення гематоксилін-еозином Метод визначення Метод основується на вибірковому забарвленні ядерних та цитоплазматичних структур. З ядерних барвників основних найчастіше застосовуються барвники виготовлені з гематоксиліну. Чинником який фарбує є не сам гематоксилін а продукт його окислення - гематеїн. Цитоплазматичним барвником з кислотними властивостями є еозин який використовують у вигляді 0 25-0 5 % спиртового або водного розчину. Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви розчини й матеріали Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Мікротоми - санний або ротаційний. Мікроскоп бінокулярний Центрифужні пробірки ємністю 10 0 см3; стакани ємністю 50 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 5 0; 10 0; 1 0 см3 за ГОСТ 20292; дозатори піпеточні ємністю 0 5 см3; Скло годинникове d 20 0 мм Чашки Петрі Лабораторні склянки ємністю 250 0; 500 0 см3; Предметне та покривне скло Реактиви та матеріали для проведення досліджень Гематоксилін Еозин ч.д.а. Спирт етиловий Ксилол о.с.ч. Гліцерин ч. Кислота оцтова концентрована густиною 1 049 г/см3 х.ч. Галуни алюмо-калієві ч.д.а. Фільтри паперові Вода дистильована Целоїдин бальзам канадський кедровий полівінілпіралідон. Підготовка до виконання Виготовлення кислого гематоксиліну Ерліха У широкогорлу склянку 500 см3 наливають: 10 % спиртовий розчин гематоксиліну на 96° спирті - 20 0 см3 спирт етиловий 96 ° - 80 0 см3 гліцерин - 100 0 см3 воду дистильовану - 100 0 см3 кислоту оцтову концентровану -10 0 см3 Галуни алюмо-калієві - 3 г Отриманий розчин залишають на світлі для "достигання". Перед застосуванням розчин фільтрують. Приготування 0 25 % або 0 5 % розчину еозину У лабораторну склянку місткістю 250 0 см3 насипають 1 г сухого еозину та наливають 199 г спирту етилового 96 ° - 248 см3. У темряві розчин "достигає" тиждень. Перед застосуванням розчин фільтрують. Виконання забарвлення Зрізи завтовшки 7 мкм які виготовляють з замороженої тканини фіксують у 96° спирті етиловому 20-30 хв ; парафінові зрізи завтовшки 5-7 мкм депарафінують 1-2 хв у ксилолі; 1-2 хв у 70 ° 96 ° спиртах ; зрізи целоїдинові використовують без підготовки. Підготовлені зрізи ополіскують водою і вміщують у гематоксилін найкраще накапати барвником прямо на зріз під час фільтрування барвника - 1-2 хв. Промити зріз дистильованою водою 3-5 хв. Перенести зрізи у 0 25-0 5% розчин еозину у спирті - 0 5-2 хв термін забарвлення підбирають згідно здібності еозину до фарбування . Змивають еозин зріз промивають у чашці водопровідною водою -1 хв. Переносять зрізи до склянки з 96 ° спиртом етиловим - 1 хв. Друга порція 96 ? спирту етилового - 1 хв. Освітлюють зрізи поміщуючи їх у склянку з ксилолом - 0 5-1 0 хв. Містять під покривне скло у кедровий канадський бальзам або у полівінілпіралідон. Примітка: після кожного забарвлення слід зі зрізу або предметного скла знімати залишки вологи легким доторканням фільтрувального паперу. Мікроскопують. Результати забарвлення При мікроскопічному дослідженні: ядра клітин забарвлюються у різні відтінки синього; цитоплазматичні та волокнисті структури забарвлюються у різні відтінки червоного кольору. Метод Ван-Гізона з забарвленням фуксиліном. Метод основується на використанні ядерного основного барвника - залізного гематоксиліну Вейгерта та квасного барвника - пікрофуксину. Це дозволяє диференційовано фарбувати колагенові волокна та гладкі м'язи. Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви та матеріали Мікротоми - санний або ротаційний Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Мікроскоп бінокулярний Центрифужні пробірки ємністю 10 0 см3; склянки ємністю 50 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 1 0; 5 0; 10 0 см3 за ГОСТ 20292; дозатори ємністю 0 5 см3; Скло годинникове d 20 0 мм Чашки Петрі Лабораторні склянки ємністю 250 0; 500 0 см3 Предметне та покривне скло Фільтри паперові. Реактиви Гематоксилін Спирт етиловий 96 ° Ксилол о.с.ч. Кислота пікринова Залізо хлорне водне Кислота соляна концентрована густиною 1 19 г/см3 ч.д.а. Фуксин кислий ч.д.а . Вода дистильована Підготовка до виконання Залізний гематоксилін Вейгерта: змішують у мірному циліндрі рівні об'єми розчинів Вейгерту І та II Вейгерт І - 1 % розчин гематоксиліну у спирті етиловому 96 ° Вейгерт ІІ - 29 % розчин водного хлорного заліза - FеСІ3 · 6Н2О - 4 0 см3 соляна кислота концентрована - 1 0 питома вага 1 15-1 19 - 1 0 см3 вода дистильована - 95 0 см3 Виготовлення пікринфуксину У мірному циліндрі змішують розчини: насичений розчин пікринової кислоти 1 2 г на 100 см3 дистильованої води та 1 % розчин кислого фуксину. Співвідношення розчинів які змішують: 10 частин пікринової кислоти: 1 частина кислого фуксину. Методика забарвлення Целоїдинові зрізи завтовшки 7 мкм одразу після виготовлення а парафінові 5 мкм після депарафінування 1-2 хв у ксилолі; 1-2 хв у 96 ? спирті етиловому переносять у щойно приготовлений гематоксилін Вейгерту - на 3-5 хв. Зрізи ретельно промивають у двох порціях водопровідної води. Зрізи фарбують у пікрофуксині 2-3 хв. Швидко ополіскують зрізи водою 5-15 секунд. Промивають послідовно у 2-3 порціях 96 ? спирту етилового по 1-2 хв. Просвітлюють ксилолом. Переносять під покривне скло у канадський бальзам. Примітка: скло та зрізи на кожному етапі обережно висушують фільтрувальним папером для зняття залишків рідини. Мікроскопують при необхідному збільшенні. Результати забарвлення Ядра клітин забарвлені у чорний колір; цитоплазма - жовто-рудого кольору; колаген - червоний; гладенькі м'язи - жовто-червоні. Метод забарвлення толуїдиновим синім. Методика основується на використанні тіоніну або толуїдинового синього як основного та дифузного барвника. Це дозволяє диференційно фарбувати хроматофільну речовину та ядра нервових клітин а також побудову гліальних клітин. Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви та матеріали Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Термостат Мікроскоп бінокулярний Посуд мірний лабораторний скляний: градуйовані циліндри ємністю 100 0; 250 0 см3за ГОСТ 1770; Посуд лабораторний скляний: стакани ємністю 50 0; 100 0 смЗ; колби ємністю 100; 2000 см3 за ГОСТ 25336; Склянки ємністю 250; 500 см3; Колби термостійкі ємністю 1 0; 2 0 дм3; Чашки Петрі; Покривне та предметне скло Тіонін або толуїдиновий синій Спирт етиловий 96 ° Ксилол Вода дистильована Підготовка до забарвлення Приготування розчину тіоніну або толуїдинового синього. 1 г тіоніну або толуїдинового синього уміщують у колбу заливають 1000 смЗ дистильованої води та витримують у термостаті при 37 ± 1 °С 36-48 годин. Потім колбу з розчином залишають при кімнатній температурі на 90 діб щоб барвник достиг. Виконання забарвлення Целоїдинові зрізи завтовшки 7 мкм перед початком виконання методу переносять у 96 ° спирт етиловий на 1-2 доби при 37 ± 1 °С термостат . Зрізи переносять у водний розчин толуїдинового синього або тіоніну розведення 1:1000 на 24 години при температурі 20 ± 2 °С. Промивають зрізи у водопровідній воді - 1-2 хвилини. Диференціюють зрізи у 96 ° спирті етиловому під контролем мікроскопу доки ядра клітин та деталі цитоплазматичних структур не будуть чітко видними. Диференціюють постійно змінюючи порції спирту. Термін цього стану може продовжуватися десятки хв або 2-3 години. Промивають зрізи у абсолютному спирті - 1-3 хв. Просвітлюють зрізи карбол-ксилолом та ксилолом. Переносять зрізи під покроєне скло у канадський бальзам або полівінілпіролідон. Мікроскопію проводять при необхідному збільшенні. Цитоплазматичні та ядерні структури забарвлені у різні відтінки синього кольору. Метод забарвлення азокарміном за Гейденгайном. Метод основується на диференційному забарвленні ретикулярних та колагенових волокон та м'язової тканини із використанням азокарміну як барвника. Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви та матеріали Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Мікроскоп бінокулярний Циліндри ємністю 50; 250; 500 см3; пробірки центрифужні ємністю 10 см3 за ГОСТ 1770 Посуд лабораторний скляний за ГОСТ 25336: лабораторні стакани ємністю 50; 70; 100 см3 Покривне та предметне скло Фільтри паперові Чашки Петрі Баня водяна Реактиви та матеріали для проведення досліджень Азокармін G ч.д.а. Кислота оцтова концентрована густиною 1 049 г/см3 ч.д.а. Анілінове мастило Кислота фосфорно-вольфрамова Аніліновий синій ч.д.а. Оранж G ч.д.а. Спирт етиловий 96 ° Вода дистильована Підготовка до забарвлення Приготування розчину азокарміну 0 1 г азокарміну G розчиняють у 100 0 см3 дистильованої води. Нагрівають до кипіння охолоджують та фільтрують. Приготування анілін-блау-оранж Змішують: аніліновий синій водорозчинний - 0 5 г оранж G - 2 0 г дистильована вода - 8 см3. Суміш кип'ятять охолоджують фільтрують. Для забарвлення виготовлений розчин розводять дистильованою водою втричі. Приготування анілінового спирту 1 смЗ анілінового мастила на 1000 см3 спирту етилового 96 ° Приготування 1 % оцтовокислого спирту 1 см3 льодяної оцтової кислоти розводять 100 см3 спирту етилового 96° Виконання забарвлення Депарафіновані або целоїдинові зрізи промивають дистильованою водою - 3-5 хв. Зрізи забарвлюють азокарміном при 50-60 °С - 1-2 години посуд повинен бути герметично зачинений . Зрізи промивають у дистильованій воді. Зрізи диференціюють у аніліновому спирті. Термін диференціювання підбирають індивідуально критерієм є чіткість клітинних ядер. Промивають зрізи у 1 % оцтовокислому спирті. Зрізи промивають у дистильованій воді. Переносять зрізи у 5 % водний розчин фосфорно-вольфрамової кислоти - 1-3 години. Термін підбирають індивідуально. Зрізи промивають у дистильованій воді. Забарвлюють зрізи анілін-блау-оранж -1-3 години. Зрізи промивають у дистильованій воді. Зрізи диференціюють спиртом етиловим 96 ° до чіткого виділення волокон синього кольору. Просвітляють абсолютним спиртом ксилолом. Переносять під покривне скло у кедровому бальзамі або полівінілпіролідоні. Мікроскопію проводять при необхідному збільшенні. Результати забарвлення Колагенові та ретикулярні волокна - синього кольору; м'язова тканина - червона або червоно-жовта; ядра клітин - червоні; слиз - синій. Гістохімічні дослідження Гістохімічні реакції виявлення металів у тканинах Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви та матеріали Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл точності за ГОСТ 24104 Термостат Мікроскоп бінокулярний Колби ємністю 250; 500 см3; пробірки ємністю 10 см3 за ГОСТ 1770; піпетки ємністю 2 0; 5 0; 10 0 см3 за ГОСТ20292 Склянки ємністю 50; 100 см3 за ГОСТ 25336 Чашки Петрі Покривне та предметне скло Паперовий фільтр. Реактиви та матеріали для проведення досліджень Срібла нітрат ч.д.а. Натрію тіосульфат ч.д.а. Сафранін Спирт етиловий 4-п-нітробензол-азо-1 - нафтол Натрію гідроксид ч.д.а. Кислота соляна концентрована густиною 1 19 г/см3 ч.д.а. Красна-кров'яна сіль ч.д.а. Нейтральний червоний ч.д.а. Бензидин солянокислий ч.д.а. Амонію тіоцианат ч.д.а. Натрію нітропрусід ч.д.а. Калію сульфат ч.д.а. Калію біхромат ч.д.а. Калію фосфат одно- та двозаміщений ч.д.а. Вода дистильована Визначення наявності кальцію. Метод основується на реакції витискання сріблом іонів кальцію з карбонатів з наступною заміною карбонату сульфідом. Методика визначення Промивають зрізи у декількох порціях дистильованої води. Зрізи переносять у розчин 5 % азотнокислого срібла на 30-40 хв при яскравому світлі. Добре промивають зрізи у декількох порціях води. Зрізи переносять у 2 5 % розчин тіосульфату натрію на 2-3 хв. Промивають зрізи водою. Дофарбовують зрізи 1 % розчином сафраніну. Диференціюють у 96 ° спирті етиловому просвітлюють ксилолом заключають у бальзам. Результат визначення наявності кальцію У місцях розміщення кальцію чорний осад Аg2S; ядра забарвлені червоним до фарбування сафраніном . Визначення наявності магнію Метод основується на адсорбції магнію солями барвника 4-п-нітробензол-азо-1-нафтолу. Методика визначення Депарафіновані зрізи переносять у розчин барвника 1 г 4-п-нітробензол-азо-1-нафтолу на 95 см3 5 % розчину гідроксиду натрію на 30 хв. Промивають зрізи у 5 % розчині гідроксиду натрію. Обезводнюють зрізи у спиртах 70-96 ° . Просвітлюють зрізи ксилолом. Заключають зрізи у бальзам. Результат визначення магнію У місцях розміщення магнію гранули забарвлені у темно-синій колір. Визначення наявності заліза Метод основується на вірогідній взаємодії іонів Fе+3 з гексаціаном II фератом калію з утворенням берлінської лазурі. Методика визначення заліза Депарафіновані зрізи переносять у розчин барвника рівні обсяги 1 % НСІ та 2 % гексаціан II ферату на 40-60 хв. Промивають зрізи у дистильованій воді 10 хв. Дофарбовують ядра 3-5 хв 1 % розчин нейтрального червоного . Промивають зрізи дистильованою водою. Обезводнюють зрізи у спиртах просвітлюють ксилолом заключають у бальзам. Результати визначення заліза Дільниці в яких локалізується Fе+3 забарвлюються берлінською лазур'ю. Ядра забарвлюються в червоний колір. Визначення наявності міді Метод основується на окислюванні Сu+2 бензидину до бензидинового синього. При цьому Сu+2 відновлюється до Сu який взаємодіє з аніоном тіоціанату амонію що утворює нерозчинений ціанат блакитного або синього кольору. Методика визначення міді Зрізи переносять у робочий розчин 10 мг бензидину та 30 мг тіоціанату амонію на 10 хв. Промивають зрізи у воді. Дофарбовують 1 % розчином нейтрального червоного. Промивають зрізи у воді. Обезводнюють зрізи у спиртах просвітлюють ксилолом заключають у бальзам. Результат визначення Локалізація міді визначається по синьому осаду. Визначення наявності цинку Принцип методу остаточно не з'ясований. Методика визначення цинку Депарафіновані зрізи переносять у 10 % розчин нітропрусиду натрію при 50 ± 1 °С на 15-20 хв термостат . Промивають зрізи 15 хв проточною водою. Покривають зрізи покривним склом та вносять під нього 1 краплину 5 % розчину сульфату натрію. Результат визначення Локалізація цинку визначається осадом червоного кольору. Визначення наявності стронцію Метод визначення стронцію за Утерхаузеном основується на здібності стронцію утворювати хелатні комплекси з родізоном натрію яскраво-червоного кольору. Порядок визначення Депарафіновані зрізи переносять на 2-3 хв у 3 % розчин біхромату калію. Переносять зрізи у 0 2 % водяний розчин родізонату натрію при 60 ± 1 °С на 1 5-2 години термостат . Швидко промивають у воді обезводнюють у спиртах просвітлюють ксилолом заключають у бальзам. Результат визначення Локалізація стронцію визначається яскраво-червоним забарвленням. 3.4.3 Гістохімічні реакції визначення активності окислювально-відновних ферментів енергоутворюючих циклів Принцип методів заснований на реакції відновлення солей тетразолію іонами Н+ які відколюються під дією дегідрогеназ від відповідного субстрату. Солі тетразолію безбарвні відновлення іонами водню перетворює їх у кольорові сполуки які називають формазанами. Нітросиній тетразолій НСТ який широко використовується при відновлюванні переходить у діформазани - сполуки синього кольору. Гістохімічно виявлені дегідрогенази можливо поділити на кофермент-незалежні такі що не потребують для реалізації своєї активності присутності нікотінамід-аденіндінуклеотиду НАД+ або нікотінамід-аденіндінуклеотид-фосфату НАДФ+ та кофермент-залежні - ті що переносять водень на НАД+ та НАДФ+. Для спрощення способів виявлення активності дегідрогеназ водні розчини інкубаційних середовищ виготовляють на базі універсального основного розчину. Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви та матеріали Мікротом - кріостат заморожуючий Універсальний іономір Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Термостат Магнітна мішалка Реактиви та матеріали для проведення досліджень Трисоксіметиламінометан ч.д.а. НСТ ч.д.а. . Магнію хлорид кристалічний ч.д.а. Ди-Nа-сукцинат Феназінметасульфат ч.д.а. Вітамін К3 офіцінальний Натрію b-оксібутірат ч.д.а. Натрію лактат Натрію глутамат Натрію глюкозо-6-фосфат ч.д.а. Вода дистильована Підготовка до проведення Приготування основного розчину інкубаційних водяних середовищ 0 2 М-трис-НСІ-буфер - 10 0 см3 0 4 % розчин НТС НТС розчинюють у 0 5 см3 N N-діметілформаміда та додають 9 5 см3 дистильованої води - 10 0 см3 1 % розчин кристалічного МgСl2 - 4 0 см3 Вода дистильована - 12 0смЗ Приготування водяних інкубаційних середовищ для кожної дегідрогенази. а інкубаційне середовище для СДГ Основний розчин - 2 0 см3 1 М сукцинат 270 мг ди-Na-сукцінату о 6Н2О на 1 см3 дистильованої води - 0 2 см3 Вітамін КЗ офіцінальний - 3 краплі Феназінметасульфат - 3 см3 рН - 7 2 ± 0 2 од. рН б інкубаційне середовище b-ОБДГ Основний розчин - 2 0 см3 НАД+ - 2 0 мг 1 М b-оксібутират 127 мг/1 см3 води - 0 2 см3 рН - 7 2 ± 0 2 од. рН в інкубаційне середовище для ГДГ Основний розчин - 2 0 см3 НАД+ - 2 0 мг 1 М L-глутамат Nа 187 мг/1 см3 води - 0 2 см3 рН - 7 2 ± 0 2 од. рН г інкубаційне середовище для F6ФДГ Основний розчин - 2 0 см3 НАДР+ - 2 0 мг 1 М глюко-6-фосфат Nа 304 мг/1 см3 води - 0 2 см3 рН - 7 2 ± 0 2 о.д. рН д інкубаційне середовище ЛДГ Основний розчин - 2 0 см3 НАД+ - 2 0 мг 1 М лактат Nа 112 мг/1 см3 води - 0 4 см3 рН - 7 2 ± 0 2 од.рН Виконання реакції Нефіксовані криостатні зрізи вміщують у інкубаційне середовище з відповідним субстратом на 30-45 хв при 37 ± 1 °С термостат . Промивають зрізи у дистильованій воді. Вміщують зрізи у 4 % розчин формаліну на 10 хв. Промивають зрізи у дистильованій воді. Заключають зрізи у гліцериновий гель. Результат реакції визначають мікроцитоспектрофотометром або при мікроскопії полукількісним методом. Місця дегідрогеназної активності забарвлюються у різні відтінки синього кольору. Визначення ГАМК-трансамінази Метод основується на відновленні солі нитросинього тетразолію іонами водню Н+ які утворюються у ході переамінування ГАМК у а-кетоглутарову кислоту. Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви та матеріали Мікротом-кріостат Універсальний іономір Термостат Пробірки ємністю 10 см3 за ГОСТ1770 Склянки ємністю 50 см3 бюкси ємністю 10; 25 см3 за ГОСТ 25336 Чашки Петрі Покривне та предметне скло. Реактиви та матеріали для проведення досліджень Натрію а-кетоглутарат Натрію азид НАД+ Нітросиній тетразолій Натрій малоновокислий Триоксіметіламінометан Спирт полівініловий Гліцерин Желатина Вода дистильована Підготовка до проведення реакцій Приготування інкубаційного середовища у 2 см3 дистильованої води змішують: 5 мМ ?-кетоглутарата натрію 7 мМ НАД+ 10 мМ азиду натрію 6 мМ НТС 0 3 см3 15 % розчину полівінілового спирту у 0 05 М трис-буфері рН=8 0. Проведення визначення Нативні криостатні зрізи вміщують у інкубаційне середовище на 30 хв у термостат при 37 ± 1 °С. Промивають зрізи у дистильованій воді. Вміщують зрізи у 4 % розчин формаліну на 10 хв. Промивають зрізи у дистильованій воді. Заключають зрізи у гліцериновий гель. Результати визначають за допомогою мікроцитоспектрофотометру. В місцях активності ГАМК-трансферази відкладаються сині гранули діформазану. Гісто-цитохімічне визначення сумарних катехоламінів за методом Ю.М. Коломійця та співавторів. Метод визначення Суть методу полягає в окисненні катехоламінів біхроматом калію і забарвленні утворених адренохромів азотнокислим сріблом яке при цьому відновлюється до металічного і визначається під мікроскопом у вигляді темних брилок у тих місцях цитоплазми клітини де локалізовані адренохроми. Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви та матеріали Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Ваги лабораторні 4 кл. точності за ГОСТ 24104 Термостат Мікроскоп-бінокуляр Покривне та предметне скло Лабораторні склянки ємністю 250 см3; Стакани ємністю 50 см3; Піпетки ємністю 0 5; 1 0; 10 0 см3 за ГОСТ 20242 Чашки Петрі Реактиви та матеріали для проведення досліджень Біхромат калію ч.д.а. Азотнокисле срібло ч.д.а Спирт етиловий Ксилол Вода дистильована Еозин ч.д.а. Бальзам канадський полівінілпіролідон. Підготовка до виконання Заздалегідь готують 2 % розчин біхромату калію для чого 2 г біхромату вміщують в лабораторну склянку та заливають 100 0 мл дистильованої води склянку поміщають в сухе темне приміщення доки весь біхромат не розчиниться. Еозин готують розчиненням 1 0 г на 100 0 мл води 1 % розчин . Розчинення та дозрівання еозину відбувається в сухому темному місці. Безпосередньо перед виконанням дослідження готують 5 % розчин азотнокислого срібла в об'ємі 10 0-20 0 мл. Навіска AgNO3 - 0 5-1 0 г відповідно. Порядок забарвлення 1. Швидко виготовляють тонкий мазок крові або мазок - відтиск з слизової оболонки. 2. Після висихання мазок фіксують у 2 % розчині K2Cr2O7 2-36 годин. 3. Фіксовані мазки промивають у 3-4 порціях дистильованої води. 4. Промиті зрізи вміщують в 5 % розчин AgNO3 на 5 хв. 5. Мазки промивають у дистильованій воді. 6. Дофарбування 1 % розчином еозину 30 сек. 7. Збезводнюють мазки крізь спирти висхідній концентрації закривають канадським бальзамом та покривним склом. Препарати досліджують під мікроскопом при збільшенні х 800. Результати забарвлення В клітинах слизових оболонок та еритроцитів виявляють чорні брилки - включення катехоламінів. Оцінка інтенсивності реакції здійснюється підрахунком кількості гранул у цитоплазмі 150 клітин мазку. Відсутність реакції - 0 брилок в клітині; слабка реакція - 1-2 брилки в цитоплазмі; помірна - 3-5 брилок; висока - 6-9 брилок; дуже висока > 10 брилок. Оцінка сумарної активності здійснюється за рахунок визначення середньої арифметичної кількості брилок срібла по всім дослідженим клітинам. Гістохімічне визначення активності NO-синтази. Принцип методу застосовано на реакції відновлення солей тетразолію іонами Н+ у фіксованій в 4 % параформальдегіду тканині. Фіксація в параформальдегіді позбавляє активності всі окислювально-відновлюючи ферменти окрім NO-синтази НАДФН-діафорази . Іони водню Н+ відщеплюються від субстрату НАДФН під впливом NO-синтази приєднуючись до тетразолію ці іони переводять його з безбарвної форми в забарвлену але на відміну від інших реакцій цього класу колір формазанів буде не синій а жовто-коричневий. Вимірювальна техніка допоміжні пристрої реактиви та матеріали Мікротом-кріостат заморожуючий Універсальний іономір Ваги лабораторні 2 кл. точності за ГОСТ 24104 Термостат Мікроскоп-бінокуляр Піпетки Пастера Реактиви та матеріали для проведення досліджень Нікотинамідаденіндінукліотидфосфат відновлений; тритон Х-100; нітросиній тетразолій; алюмокалієві квасці; желатин; стандартний 0 1 М фосфат-буфер рН=7 2; гліцерин. Підготовка до проведення Заздалегідь готують стандартний 0 1 М фосфат-буфер рН=7 2. Для виготовлення 0 3 % розчину тритон Х-100 0 3 мл цього реактиву розчиняють в 100 0 мл дистильованої води. 0 2 % розчин алюмокалієвих квасців виготовляють розчиняючи 0 2 г квасців ч.д.а. в 100 0 мл дистильованої води. Інкубаційне середовище складається з: НАДФН - 2 мл. НСТ - 1 мл/ розчинений в 2 мл фосфат-буферу 0 1 М; рН=7 2. 0 3 % розчин тритон Х-100 - 3 краплини. Всі компоненти змішують в пробірці. Порядок проведення реакції: 1. Кріостатні зрізи 10 мкм завтовшки з нативної тканини. 2. Зрізи фіксують 20-30? в парах 4 % розчину параформальдегіду при температурі 37 ?С. 3. Зрізи інкубують у відновлювальному середовищі 30? при температурі 37 ?С. 4. Зрізи промивають дистильованою водою. 5. Зрізи промивають у 2 % розчині алюмокалієвих квасців 30-60". 6. Зрізи промивають дистильованою водою. 7. Препарати закривають покривним склом на желатин-гліцерині. Оцінка результатів В тих містах де є активність NO-синтази відкладаються грудочки формазинів від сіро-жовтого до чорного кольору. Шкала активності NO-синтази яку слід використовувати: слідова активність - дифузне прозоре жовтувато-сірувате забарвлення окремих ділянок в препараті; слабка активність - прозоре жовтувато-сірувате забарвлення ділянок в препараті. Дрібні сіруваті або сірувато-жовтуваті гранули по контуру судин та/або окремих клітин паренхімі; помірна активність - в препараті дифузне жовтувате забарвлення ділянок. В паренхімі дрібні або середні жовтуваті гранули окантовують тіла кліток. В сосудах жовто-коричневі або сіро-чорні дрібні гранули розташовані по контуру; висока активність - обширні ділянки дифузної жовто-коричневої окраски препарату. В паренхімі клітини окантовані коричневими гранулами. По контуру сосуду - коричневі або сіро-чорні гранули. Глава 4 ОРГАНІЗАЦІЯ РОБОТИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ЛАБОРАТОРІЙ Експериментальна бальнеологія потребує проведення дослідів на тваринах. Для виявлення біологічної активності засобів природного походження встановлення їх безпеки для організму людини та прогнозування лікувальних властивостей у експерименті використовуються білі щури лінійні та нелінійні . Оптимальними вважаються тварини з масою тіла 180-200 г незалежно від статі Під час експерименту тварини мають знаходитись у звичайних умовах віварію харчовий і питний режими підтримуються постійними на повсякденному рівні. У роботі віварію нема та не може бути дрібниць тому що через незначну як здавалося б погрішність у ній може бути зведено нанівець попередню велику роботу. Вимогливість до чистоти експерименту його сучасній оснащеності та високій етичній культурі обумовлюють цілу низку вимог до експериментально-біологічної клініки "віварію" . 4.1 УТРИМАННЯ ТВАРИН У ВІВАРІЇ 4.1.1 Приміщення віварію У залежності від потреб закладу віварій може розташовуватися на достатньо великій території на верхніх поверхах лабораторних корпусів але краще за усе аби існувала окрема будівля. При цьому важливо одне щоб усі віварії підлягали одним і тим же вимогам: дотриманню однакових для усіх зоогігієнічних правил та норм. Створення віварію необхідно узгоджувати з ветеринарно-санітарною та санітарно-епідеміологічною службами за місцем розташування закладу. Кожен віварій повинен мати набір приміщень за допомогою яких забезпечувалися б на належному санітарному рівні усі етапи знаходження в ньому тварини. Набір та площа приміщень визначаються об'ємом та характером досліджень які проводяться. У кожному віварії повинно бути приміщення для прийому тварин що надходять найкоротший шлях повинен вести до карантинного відділення яке складається із декількох ізольованих кімнат та оснащене пересувними стелажами з клітками для тварин а також приміщення для утримання тварин. Крім вищевказаних приміщень у віварії повинна розташовуватися низка служб які забезпечують утримання тварин та проведення експериментальної роботи з ними. Набір приміщень для експериментальної роботи визначається потребами закладу. Зазвичай це декілька ізольованих кімнат: кімната для маніпуляцій призначена для огляду тварин вивчення обмінних процесів у них взяття проб для аналізів та інших робіт із тваринами; операційна; дезінфекційно-мийна; склад чистого знезараженого запасного інвентарю; кормокухня для переробки та приготування кормів; службовий кабінет завідуючого віварієм та побутове приміщення для обслуговуючого персоналу. Відокремлено розташовують технічні споруди для вентиляційних електротехнічних та інших спеціальних установок та кондиціонерів. Опалювальна система повинна забезпечувати постійну температуру в помешканні на протязі всього року на рівні необхідному для даних видів тварин. Приміщення у яких працюють з тваринами чи утримують їх повинні бути забезпечені гарячою та холодною водою та каналізацією. Усі приміщення повинні мати природне та штучне освітлення. Стіни приміщень для утримання тварин та кормокухні від полу до стелі повинні бути покриті глазурованою плиткою. 4.1.2 Правила роботи у віварії Для віварію відводять окреме приміщення з окремим входом відокремлене від лабораторій і робочих кімнат капітальною стіною. У віварії на видному місці повинні бути вивішені: "Правила внутрішнього розпорядку" затверджені керівником установи. Обслуговування тварин проводиться постійно закріпленим персоналом. СТОРОННІ ОСОБИ В ПРИМІЩЕННЯ ВІВАРІЮ НЕ ДОПУСКАЮТЬСЯ. Кожен віварій повинен бути зареєстрований в органах ветеринарного нагляду. Усіх тварин що надходять у віварій піддають обов'язковому ветеринарному огляду в день надходження. Не рідше 2 рази в рік усі приміщення віварію повинні оброблятися інсектицидами. Спільне утримання тварин які тільки надійшли і тварин які пройшли карантин ЗАБОРОНЯЄТЬСЯ. Дрібні заражені тварини миші свинки щури й ін. утримуються в спеціальних пластмасових або дерев'яних клітках. Не допускається скупчення в клітках корму виділень і ін. Клітки що звільнилися з-під знову прибулих тварин обробляють дезінфікуючими розчинами потім розчин зливають через сітку в трап каналізації що влаштована у віварії а залишки корму і гною вивозяться в спеціальних контейнерах. Доставка тварин з віварію в лабораторію і назад здійснюється в спеціальних продезінфікованих клітках. Щурів і мишей переносять у тих же клітках у яких вони утримуються у віварії. Для попередження травматизму подряпин і укусів усі маніпуляції з лабораторними тваринами роблять у спеціальних пристосуваннях з малими тваринами працюють у рукавичках. Прибирання віварію роблять щодня в наступному порядку: - столи полки табуретки стіни і підлогу протирають вологою ганчіркою змоченою дезінфікуючим розчином; - чищення кліток із тваринами починають з контрольних кліток у яких містяться тварини що пройшли карантин; - годівниці для очищення від залишків корму витягають із кліток корнцангом поміщають у бак з дезінфікуючим розчином після чого ретельно промивають водою. Корнцанг теж занурюють у дезінфікуючий розчин; - мишей і інших тварин при чищенні кліток пересаджують у чисту клітку; - у гумовій рукавичці чи корнцангом залишок підстилки чи корму зсипають у бак. Клітку де тимчасово знаходилися тварини обробляють дезінфікуючими розчинами; - клітки ретельно зрошують дезінфікуючим розчином і наступного дня миють проточною водою. По закінченні роботи у віварії співробітники зобов'язані прийняти душ. 4.1.3 Інструкція з охорони праці для персоналу що обслуговує віварій До роботи в віварії допускаються особи не молодше 18 років лаборанти молодший обслуговуючий персонал що одержали докладний інструктаж з питань охорони праці і режиму роботи віварію. При цьому роз'ясняються специфічні особливості роботи лабораторії правила особистої гігієни внутрішнього розпорядку. Інструктаж проводить зав. віварієм. Надалі інструктаж із правил особистої профілактики і техніку безпеки проводять не рідше 1 разу на півроку. При впровадженні нових методів і прийомів роботи а також при освоєнні нового виду чи устаткування пристосувань повинний проводиться додатковий позаплановий інструктаж з реєстрацією в журналі інструктажів. Перед прийомом на роботу персонал що обслуговує віварій повинний пройти попереднє медичне обстеження що включає дослідження на бацилоносійство збудників туберкульозу і всієї групи кишкових інфекцій. Хворі туберкульозом шкірними й іншими заразними захворюваннями до роботи у віварії не допускаються. Згодом профілактичний медогляд проводиться не рідше 1 разу на рік. Той кого інструктують повинен вивчити заходи медичної допомоги при травмах вивчити інструкцію з протипожежних норм освоїти правила користування засобами первинного пожежогасіння вогнегасник і т.д. . Працівник віварію повинний бути забезпечений спецодягом спецвзуттям та іншими засобами індивідуального захисту ЗІЗ предметами необхідними до видачі працівникам даної професії згідно діючих норм. Обов'язково мати в наявності укомплектовану аптечку для надання першої медичної допомоги. Персоналу віварію варто пам'ятати що внаслідок невиконання вимог викладених у даній інструкції Правилах внутрішнього трудового розпорядку Правилах безпечної експлуатації електроустановок споживача можуть виникнути небезпеки: ураження електричним струмом травми укуси тварин та ін. За невиконання цих вимог працівник несе відповідальність відповідно до діючого законодавства. Вимоги безпеки перед початком роботи Перед початком роботи персонал віварію зобов'язаний: а приходячи на роботу знімати верхній одяг і взуття і надягати спецодяг і спецвзуття; б вішати домашній одяг і спецодяг обов'язково в різних відділеннях індивідуальної шафи; в періодично але не рідше одного разу на місяць дезінфікувати індивідуальні шафи. Для попередження травматизму подряпин укусів усі маніпуляції з лабораторними тваринами проводити з обов'язковим застосуванням рукавичок. При роботі з електроустаткуванням перевірити цілісність корпуса живильного та заземленого проводів. Працювати з незаземленим устаткуванням не допускається. При виявленні несправностей в устаткуванні та інших недоліків довести до відома зав. віварію чи старшого фахівця. Вимоги безпеки під час виконання роботи Під час роботи в кімнатах із тваринами кормокухні дезінфекційно-мийному відділенні операційній та діагностичному кабінеті необхідно мати дезінфікуючий розчин для знезаражування рук. По закінченні кожного окремого етапу роботи відповідно до розкладу дня а також перед прийомом їжі обов'язково мити і дезінфікувати руки. В усіх виробничих приміщеннях клініки віварію категорично забороняється приймати їжу і курити. Під час роботі обслуговуючий персонал зобов'язаний: стежити за справністю електричних мереж вентиляції контрольно-вимірювальних приладів; готувати дезінфікуючі розчини і стежити за їхньою якістю не допускаючи застосування старих що втратили активність розчинів; тримати в порядку робочі місця; працюючи на мийці посуду захищати руки від води і миючих речовин гумовими рукавичками; застосовувати при вологому прибиранні приміщень свіжі розчини дезінфікуючих речовин у встановленій концентрації; не допускати сторонніх осіб у приміщення віварію без дозволу зав. віварієм; суворо дотримуватися вказівок даної інструкції! Правил внутрішнього розпорядку клініки; прибирання приміщень віварію робити щодня згідно встановленого порядку з застосуванням дезінфікуючих розчинів; у випадку порізів чи укусів тваринами вживати заходів по знезаражуванню рани і у разі потреби звертатися по допомогу в медичну установу. При виявленні в обслуговуючого персоналу респіраторних захворювань токсоплазмозу й інших хвороб спільних для людей і тварин зав. віварієм має право тимчасово усунути співробітника від роботи. Вимоги безпеки по закінченні роботи По закінченні роботи знеструмити електроустаткування зробити необхідне згідно встановленого порядку прибирання приміщень і кліток із тваринами дотримуючись Правил роботи в віварії. При відході після чищення кліток із тваринами гумові рукавички знешкоджують не знімаючи з рук зануренням у дезінфікуючий розчин. Після зняття рукавичок руки вимити з милом. По закінченні роботи у віварії співробітники зобов'язані прийняти душ. Вимоги безпеки в аварійних ситуаціях Причиною аварійної ситуації може бути замикання електропроводки загоряння пальних матеріалів. При виникненні аварійної ситуації необхідно терміново прийняти заходу для відновлення нормального режиму роботи і докласти зав. віварієм чи науковому співробітнику. При нещасному випадку необхідно повідомити керівництво надати допомогу потерпілим використовуючи знання правил надання першої допомоги зберегти до розслідування обставин обстановку такою якою вона була в момент події якщо немає загрози життю та здоров'ю оточуючих людей. При виникненні пожежі приступити до гасіння пожежі негайно самотужки ужити заходів до евакуації майна. У разі потреби викликати пожежну команду по тел. "01". 4.1.4 Приміщення патогістологічної лабораторії Згідно Наказу МОЗ України від 12.05.92 р. № 81 "Про розвиток та удосконалення патологоанатомічної служби в Україні" патогістологічні лабораторії повинні бути відокремлені від приміщень де знаходяться хворі. Крім того патогістологічні лабораторії повинні формуватися як компактний блок приміщень. До складу патогістологічної лабораторії повинні входити не менш як три окремих кімнати. Кімнати підготовки біологічного матеріалу В цьому приміщенні здійснюється розтин експериментальних тварин вилучення органів та тканин на гістохімічні дослідження. В цьому ж приміщенні здійснюється вирізка матеріалу та усі операції по заливці його в згущуючи середовища. В цьому ж приміщенні повинен знаходитися мікротом-кріостат для виготовлення заморожених препаратів з нативних тканин. Маніпуляції по заливці тканин у згущуючи середовища здійснюють з використанням спирту хлороформу ефіру та інших летючих речовин. Вихід з цього приміщення обов'язково повинен бути обладнаний витяжною шафою. Кімната-лабораторія для забарвлення гістологічних препаратів та виконання гістохімічних реакцій Роботи по забарвленню гістологічних препаратів та гістохімічні реакції здійснюються з використанням ксилолу карболксилолу толуолу та інших шкідливих речовин тому необхідне обладнання лабораторії примусовою приточно-витяжною вентиляцією. Крім того оскільки робота по забарвленню спрямована на утворення різнокольорових комбінацій робочі місця лаборантів повинні мати природне освітлення високого рівня. Кімната-лабораторія мікроскопічних досліджень В приміщенні де знаходяться мікроскопи повинне бути природне освітлення але слід запобігати проникненню прямих сонячних променів які можуть пошкодити оптичні лінзи. Крім того в приміщенні де розташовані мікроскопи ні в якому разі не можуть знаходитися летючі речовини та агресивні речовини кислоти луги формалін та ін. тому що випаровування цих речовин можуть пошкодити оптичні та механічні складові мікроскопів. В приміщенні патогістологічної лабораторії забороняється зберігати та приймати їжу курити. їжу треба приймати в особливо відведеному місці. Всі реактиви в приміщенні патогістологічної лабораторії повинні зберігатися з написом на тарі який пояснює вміст цієї тари. Заборонено зберігати реактиви без етикеток. Летючі реактиви повинні мати відповідне маркірування та зберігатися під витяжною шафою. Перед початком роботи співробітники патогістологічної лабораторії повинні вдягнути спецодяг. Якщо передбачається робота з біологічним матеріалом треба приготувати гумові рукавички. Перед початком роботи треба перевірити справність приладів та неушкодженість посуду. Робота з біологічним матеріалом розтин тварин отримання та вирізки тканин виготовлення заморожених зрізів здійснюється тільки у гумових рукавичках. Заповнення піпеток розчинами здійснюється тільки за допомогою гумової груші або за допомогою автоматичного дозатора. Насасування реактивів ротом категорично заборонено. Усі роботи з летючими рідинами повинні здійснюватись під витяжною шафою. По закінченні роботи з біологічним матеріалом належить розташувати посуд у місткості з дезінфекційним розчином. По закінченні роботи поверхні робочого місця мають бути оброблені дезінфекційними засобами які дозволені Міністерством охорони здоров'я України. Гумові рукавички в яких виконувались маніпуляції з біологічним матеріалом треба після закінчення роботи обробити дезрозчином. Після зняття рукавичок руки треба вимити та обробити розчином спирту не менш як 30 ° . 4.2 ВИМОГИ БЕЗПЕКИ При проведенні вимірювань у біохімічній лабораторії необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.30-1.06.77 "Загальні правила безпечної роботи в хімічних лабораторіях" затверджених 27.07.77 р. Мінхімпромом СРСР "Державний реєстр міжгалузевих і галузевих нормативних актів про охорону праці" Реєстр ДНАОП за станом на 01.02.95 р. Київ: Держоглядохоронпраці 1995 224 с; правил безпечної роботи які викладені в експлуатаційних документах на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої. Вимоги до охорони праці при роботі з електроприладами у патогістологічній лабораторії не відрізняються від загальних вимог при здійсненні таких робіт. При проведенні імунологічних досліджень необхідно дотримуватись вимог "Временной инструкции о соблюдении противоэпидемического режима в клинико-диагностических лабораториях" від 22.04.97 р. затвердженої Головним державним санітарним лікарем Одеської області Л.І. Засипко. 4.3 ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ОПЕРАТОРА ТА КОНТРОЛЬ ЗБІЖНОСТІ ВІДТВОРЕННЯ ТА ПРАВИЛЬНОСТІ ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ До виконання робіт допускаються особи що мають кваліфікацію лаборанта і досвід лабораторної роботи не менше одного року. Умови виконання вимірювань При проведенні вимірювань повинні виконуватись наступні умови: - температура в лабораторії від 18 до 20 ± 5 °С; відносна вологість повітря в лабораторії при 25 °С на більше 85 %; - повинна бути в наявні приточно-витяжна вентиляція ефективністю не менше 3-х кратного обміну повітря. Розраховуються наступні параметри: 1 Середньоарифметична величина М М = ? Xn де n М - середньоарифметична величина; Xn - сума усіх набраних результатів; n - кількість узятих у розрахунок результатів. 2 Середньоквадратичне відхилення S S =v ? M - Xn n - 1 3 Коефіцієнт варіації V V = S х 100 M Для біохімічних тестів "V" не повинен перебільшувати 5 % що відповідно забезпечує роботу з похибкою яка не перебільшує 1/8 допущеної межі похибки. Для ферментів - 8 %. Якщо "V" - вище то необхідно з вибірки даних виключити ці результати за допомогою критерію "Т" Якщо "Т" більше 2 62 то цей результат виключається. До роботи в патогістологічній лабораторії можуть бути допущені чоловіки та жінки не молодші 18 років. На посаду лаборанта можуть бути прийняті особи які мають середню спеціальну медичну освіту за станом здоров'я можуть працювати у патогістологічній лабораторії та пройшли відповідний інструктаж з техніки безпеки. На посаду старших лаборантів можуть бути прийняті особи які мають вищу медичну або біологічну освіту і за станом здоров'я можуть працювати у лабораторіях відповідного профілю та пройшли відповідний інструктаж з техніки безпеки. На посаду керівника або наукових співробітників патогістологічної лабораторії можуть бути зараховані особи з вищою медичною освітою які мають сертифікат фахівця з патологічної анатомії бажана наукова ступінь зі спеціальності "патологічна анатомія" або "гістологія". Стан здоров'я кандидатів повинен задовольняти вимогам роботи в лабораторіях відповідного профілю крім того кандидати повинні пройти відповідний інструктаж з техніки безпеки. До виконання імунологічних досліджень можуть бути прийняті особи що отримали навчання з цих методів та ознайомлені з інструкцією щодо експлуатації відповідних засобів вимірювання та допоміжної техніки. висновок Вивчення біологічної відповіді організму на дію засобів природного походження є необхідним етапом що випереджає клінічні випробування та в більшій мірі визначає раціональність їх використання у лікувальній практиці. В цьому відношенні надзвичайно важливим є використання раціональних методологічних підходів у проведенні таких досліджень. В цьому посібнику пропонується методологічний підхід що передбачає послідовне поетапне проведення досліджень в умовах експерименту. При цьому на першому етапі проводиться вивчення загальних реакцій на вплив поведінкові реакції токсичність експрес-тестування реакцій з боку органів-мішеней та ін. в наступному з врахуванням отриманих результатів досліджується реакція з боку морфо-функціональних структур органів та тканин імунної системи та біохімічних показників що характеризують функціональний стан відповідних органів нирки печінка та ін. . Такий системний підхід до оцінки дії природних факторів дозволяє виявити як специфічні особливості впливу так й характер та інтенсивність неспецифічних реакцій що у сукупності прогнозує їх лікувальний ефект. У зв'язку з тим що вплив природних лікувальних джерел далеко не байдужий для організму у програму досліджень включено набір показників які дозволяють визначити наявність шкідливої дії фактору що досліджується на різноманітні системи гомеостазу функціональну активність органів та процеси метаболізму. В цьому відношенні надзвичайно важливим є вивчення реакції з боку морфо-функціональних структур тканин органів-мішеней інтенсивність процесів ПОЛ - як одного з провідних показників пошкодження цитоплазматичних мембран визначення в сироватці крові антитіл до різноманітних тканинних антигенів - показник деструктивних процесів та ін. Викладення усіх методик представлених у "Посібнику" однотипне та вміщує основні етапи виконання технологічного процесу засоби приготування реактивів перелік необхідної вимірювальної апаратури методи розрахунку одиниці вимірювання та ін. Такий детальний опис рекомендованих методів дослідження значно полегшить їх виконання та зробить доступним для використання на практиці у лабораторіях що займаються подібними дослідженнями. Запропонований у "Посібнику" методологічний підхід використовується у роботі Державного центру стандартизації та контролю якості природних та преформованих засобів в клініко-діагностичній лабораторії Українського НДІ медичної реабілітації та курортології МОЗ України для оцінки біологічної активності природних та преформованих лікувальних ресурсів та їх безпечності для організму а також для проведення планових наукових досліджень які розкривають механізм корегуючих властивостей засобів природного походження при різноманітних патологічних процесах. Це дозволяє визначити спрямованість подальших клінічних випробувань та обґрунтувати рекомендації з їх подальшого диференційованого використання при різноманітній патології. СПИСОК ПОСИЛАНЬ 1. Бабов К.Д. та ін. Методичні рекомендації /Доклінічні дослідження специфічної активності та нешкідливості мінеральних вод. Київ 2000. - 40 с. 2. Иванов В.В. Невраев ГА. Классификация подземных минеральных вод. - М.: Недра 1964. - 168 с. 3. Вайсфельд Д.Н. Голуб Г.Д. Методы применения грязей. К. 1980. -112 с. 4. Зольникова А.И. Кубли С.Х. Невструева В.Г. Изменения катехоламинов в тканях животных под влиянием различных по химическому составу грязевых апликаций. // Вопросы курортологии физиотерапии и ЛФК. 1967. - № 5. - С. 439-442. 5. Невраев Г.А. О бальнеологической оценке различных типов лечебных грязей пелоидов // Вопросы курортологии физиотерапии и ЛФК. - 1961. - № 5. - С. 385-390. 6. Petez A. Adaptation Persistent und Immynsistem in Beziehung zur Balneotherapie // Z. Physiother 1971. - v. 73 № 5. - s. 333-340. 7. Gee K. Zukseh R Prozek B. Zur Frege der per kutanen Ostrogenresorption and dem Bademoor. Z. angew. Bader-u Klimaheik - 1966. - v.13.31. - p. 55-63. 8. Лещинский А.Ф. Зуза З.И. Пелоиды в фармакотерапии при воспалительных заболеваниях. - К.: Здоровье. - 1985. - 184 с. 9. Зуза З.И. Масленко Е.П. Исследования противовоспалительного действия пелоидов с различными физико-химическими свойствами. / Материалы VIII Эстонской республиканской научной конференции по курортологии и физиотерапии. - Таллинн: Б.И. 1971. - С. 62-65. 10. Лобасюк Б.А. Алексеенко Н.А. Колкер И.А. Нейрофизиологический анализ влияния раствора пищевой добавки полифенольных веществ в минеральной воде "Куяльник" // Медицинская реабилитация курортология физиотерапия. - 1996. - № 2. - С. 50-57. ?? ?? ?? ?? 2