МР 1514-76

МР 1514-76 Методические рекомендации об определении свободного формальдегида в биосредах методом тонкослойной хроматографии

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ УТВЕРЖДАЮ Заместитель Главного санитарного врача МЗ СССР В.Е.Ковшило 20.10.1976 N 1514-76 Методические рекомендации об определении свободного формальдегида в биосредах методом тонкослойной хроматографии ВВЕДЕНИЕ Формальдегид H*COH молекулярный вес 30 03. Бесцветный газ с резким запахом. Порог восприятия запаха 0 2 мг/куб.м. Температура плавления 92 град.С температура кипения - 21 град.С. Хорошо растворим в воде; 35-40% водный раствор формальдегида называется формалином. Он легко полимеризуется с образованием параформальдегида легко конденсируется с аммиаком аминами и фенолами. Формальдегид находит большое применение при производстве полимерных материалов на основе мочевино-формальдегидной феноло-формальдегидной и др. смол. Для определения формальдегида в биосредах в литературе описан метод основанный на способности формальдегида восстанавливать окраску бесцветного раствора фуксинсернистой кислоты [1]. Однако он оказался недостаточно чувствительным при определении H*COH в органах подопытных животных подвергавшихся длительной затравке формальдегидом на уровнях соответствующих его выделению из полимерных материалов. По этой же причине оказался неудовлетворительным метод описанный в работе [2]. Настоящий метод предназначен для определения формальдегида в печени почках легких мозге подопытных животных. Извлечение формальдегида из органов животных делалось так как описано в работе [1] синтез формдимедона по прописи представленной в руководстве [3] условия хроматографирования и количественного определения формдимедона разработаны авторами. Принцип метода 1. Метод основан на извлечении формальдегида из органов его взаимодействии с димедоном 5 5-диметилдигидрорезорцином с последующим выделением продукта взаимодействия формдимедона в тонком слое сорбента. В качестве алюента применяется хлороформ. Проявление пластины осуществляется хлороформенным раствором йода. 2. Открываемый минимум - 0 2 мкг в пробе. 3. Веществ мешающих определению не установлено. Реактивы растворы 1. Соляная кислота d=1 19 "хч" ГОСТ 3118-67; Ін; 0 1н р-ры. 2. Димедон "ч" ГОСТ 6622-53 перекристаллизованный; 5% спиртовый р-р свежеприготовленный. 3. Гидроокись натрия "хч" ГОСТ 4328-66; 0 1н; 0 05н и 20% р-ры. 4. Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67; перегнанный. 5. Вода бидистиллат. 6. Бромфеноловый синий "чда" ГОСТ ТУ 6-03-311-70. 7. Ацетат натрия "ч" ТУ 6-09-246-70. 8. Нитрат серебра "хч" ГОСТ 1277-63; 0 1н р-р. 9. Хлороформ "хч" ГОСТ 3160-51. 10. Трихлоруксусная кислота "ч" МРТУ 6-09-2299-65; 5% р-р. 11. Йод "чда" ГОСТ 4159-64. 12. Крахмал растворимый для йодометрии ГОСТ 10163-62. 13. Формалин медицинский ГФ-10. 14. Буферный р-р: смешивают 2 объема Iн р-ра ацетата натрия с 1 объемом Iн р-ра HCl pH=4 0. 15. Бромфеноловый синий: 0 1 г индикатора растворяют в 3 мл 0 05н p-pa NaOH в мерной колбе емкостью 250 мл добавляют горячей бидистиллированной воды остывший р-р взбалтывают в мерной колбе затем доводят до метки водой и хорошо перемешивают. 16. Проявляющий р-р: 0 5% р-р йода в хлороформе и 1% р-р крахмала. 17. Синтез формдимедона: в стакан вносят 5 мл 4% р-ра формальдегида прибавляют 0 5 мл 5% спиртового р-ра димедона подкисляют несколькими каплями 0 1н р-ра HCl в присутствии бромфенолового синего. Затем прибавляют несколько капель 0 1н р-ра NaOH до изменения окраски в красно-фиолетовую и 5 мл буферного р-ра. Содержимое стакана оставляют стоять на 12 часов после чего фильтруют через стеклянный фильтр с пористой пластинкой N 4. Осадок промывают бидистиллированной водой до отрицательной реакции на ион хлора проба с р-ром AgNO и сушат до постоянной массы в 3 течение 4 5 часов при температуре 100 град.С. 18. Стандартный р-р формдимедона концентрацией 50 мкг/мл готовится обычным способом. Приборы и посуда 1. Центрифуга. 2. Форвакуумный или водоструйный насос. 3. Стеклянная ловушка. 4. Стеклянные пластинки размером 9х12 см. 5. Поглотитель Полежаева на шлифе с оттянутым концом. 3. Мерные колбы для приготовления стандартного р-ра микропипетки. 7. Батарейные стаканы. 8. Пульверизатор. 9. Реактивные склянки. 10. Фарфоровые чашки. Приготовление пластин для хроматографии Тщательно вымытые хромовой смесью пластины промывают водой затем дистиллированной водой сушат в сушильном шкафу а потом на них наносят слой сорбента. Для приготовления сорбционной массы использовался силикагель марки КСК и медицинский гипс которые предварительно просеивались через сито с отверстиями с частотой ячеек 100 меш. Адсорбционная масса готовилась следующим образом: 14 г силикагеля + 1 г гипса + 50 мл дистиллированной воды смешивают и интенсивно встряхивают в плоскодонной колбе в течение 20 минут. Однородную массу наносят на 10 пластинок и встряхиванием добиваются равномерного распределения слоя на поверхности каждой пластины. Стеклянные пластинки после нанесения слоя сорбента сушат на воздухе в течение суток. В дальнейшем пластинки хранят в эксикаторе. Описание определения 0 5 г органа подопытного животного печени почек легких мозга тщательно растирают в ступке желательно с кварцевым песком. Затем прибавляют 3 мл 5% трихлоруксусной кислоты перемешивают и переносят в пробирку. Чашку дважды ополаскивают 2 мл бидистиллированной воды и смывы также переносят в пробирку. Содержимое пробирки центрифугируют жидкость над осадком осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и к фильтрату по каплям прибавляют 20% раствор NaOH до нейтральной реакции проба с лакмусовой бумажкой . Далее прибавляют 0 2 мл раствора димедона и проводят синтез формдимедона так как описано выше. После того как проба была выдержана 12 часов при комнатной температуре ее переносят в испаритель и упаривают под вакуумом досуха. В качестве испарителя можно использовать поглотитель Полежаева. Чтобы ускорить процесс упаривания целесообразно между насосом и испарителем поместить ловушку со льдом. Остаток растворяют в 0 1 мл этилового спирта. В период обработки органа проведения синтеза формдимедона упаривания растворов возможно попадание формальдегида в пробу из воздуха. Поэтому для контроля в той же постановке опыта проводят анализ соответствующего органа животного которое не подвергалось затравке. Результаты анализа учитываются при окончательном расчете. Проба и контроль наносятся на середину пластинки на расстоянии 1 см от нижнего края. Во избежание потерь стенки испарителей аккуратно споласкивают спиртом и смывы переносят в те же точки куда были нанесены проба и контроль. Слева и справа наносят пятна стандартного раствора формдимедона в количестве 0 2; 0 4; 0 6 мкг что соответствует 0 004; 0 008; 0 012 мл стандартного раствора. Для ускорения процесса высыхания пятен на пластине ее подогревают феном. Разделение вещества производят в камере с насыщением представляющей собой сосуд любой формы с притертой крышкой на дно которого наливают смесь хлороформа с ацетоном ацетон добавляется в количестве 1/10 от объема хлороформа . После подъема растворителя на высоту 10 см пластинку вынимают сушат на воздухе и опрыскивают хлороформенным раствором йода. На пластинке появляются желтые пятна. После подсушивания пластинки и обработки ее раствором крахмала пятна приобретают синий цвет. Непрореагированный димедон дает пятно около старта; формдимедон - с R = 0 4-0 5. f Расчеты Количество вещества в пробе определяется путем сравнения площади пятна пробы с площадью пятен стандартных растворов. Количество определяемого формальдегида в пробе в том или ином органе рассчитывается в мкг/г по формуле: C1 - C2 g = ------- мкг/г где 0 5 C1 - количество формальдегида в органе подопытного животного мкг; C2 - количество формальдегида в органе контрольного животного мкг; 0 5 - навеска взятого для анализа органа г. ЛИТЕРАТУРА 1. Перегуд Е.А. Санитарная химия полимеров Изд-во "Химия" Л. 1967 стр. 60. 2. Розенберг П.Я. Беялко Н.К. Химические методы исследования биологических субстратов в профпатологии. М. Изд-во "Медицина" 1969 стр. 171-173. 3. Nash T. The colorimetric estamation of formaldehyde by means of the Hantrsch Reaction Biochem. J. 1953.55.3.416.