МУ 4082-86

МУ 4082-86 Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

Утверждены Минздравом СССР 20 марта 1986 г. N 4082-86 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ АФЛАТОКСИНОВ В ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФЛАТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Оборудование и материалы 1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2451-78. 2. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 завод "Химлаборприбор" . 3. Кофемолка ЭКМ-ЗУ. 4. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе модель 833 ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41. 5. Жидкостный хроматограф высокой эффективности "Altex" модель 336 или другой хроматограф с аналогичными параметрами; колонка и предколонка с силикагелем типа "Ultrasphere Sf" с размером частиц 5 микрон; длина колонки 25 см предколонки 4 5 см внутренний диаметр колонок 0 46 см; флуоресцентный детектор "Kratos" модель FS-970 с кюветой заполненной силикагелем или другой детектор с аналогичными параметрами; ультрафиолетовый детектор "Kratos". 6. Микрошприц на 25 мкл. 7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками например стеклянные четырехугольные сосуды 195 x 195 x 200 мм завода "Дружная горка". 8. Пластины для ТСХ "Силуфол" размером 15 x 15 или 20 x 20 см ЧССР. 9. Воронки делительные ВД2-250 или ВД2-500 по ГОСТ 8613-75. 10. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100 - 250 микрон силикагель ЧССР . 11. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой тип 2-100 ГОСТ 1770-74. 12. Цилиндры мерные на 250 мл с притертой пробкой тип 2-250 по ГОСТ 1770-74. 13. Колбы плоскодонные конические на 250 и 500 мл с НШ 29 тип КнКШ 250-29/32 и 500-29/32 по ГОСТ 10394-72. 14. Колбы круглодонные на 1000 мл с НШ 29 тип ККШ-250-29/32 по ГОСТ 10395-72. 15. Колбы грушевидные на 50 мл с НШ 14 5 тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-72. 16. Воронки химические диаметром 150 мл по ГОСТ 8613-75. 17. Колонка стеклянная хроматографическая 2300 x 15 мм. 18. Распылитель стеклянный с грушей. 19. Афлатоксин B или смесь афлатоксинов B B G G . 1 1 2 1 2 20. Афлатоксин M . 1 21. Ацетон по ГОСТ 2603-71. 22. Гексан по ТУ 6-09-3375-73. 23. Бензол по ГОСТ 5955-75. 24. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3543-74. 25. Метанол по ГОСТ 6995-77. 26. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51. 27. Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-52. 28. Вода дистиллированная. 29. Кислота лимонная по ГОСТ 3652-29. 30. Кислота азотная концентрированная по ГОСТ 4461-67. 31. Сульфат натрия безводный по ГОСТ 4166-76. 32. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-66. 33. Свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67. 34. Окись алюминия для колоночной хроматографии нейтральный 40/250 ЧССР . 1. Определение афлатоксинов B B G G 1 2 1 2 в пищевых продуктах 1.1. Экстракция При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТ 12330-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе". Отобранную пробу измельчают в течение 1 - 2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл тщательно перемешивают с 25 мл 10-процентного раствора хлорида натрия. Добавляют 100 мл ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр отбирают 50 мл фильтрата. 1.2. Очистка экстракта К 50 мл фильтрата добавляют 20 мл 15-процентного раствора ацетата свинца и 30 мл дистиллированной воды перемешивают и оставляют стоять на 10 минут в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр отбирают 80 мл фильтрата. Обезжиривают в делительной воронке гексаном 2 x 30 мл затем переэкстрагируют в хлороформ 1-ый раз 30 мл хлороформа 2-ой раз смесью хлороформ-ацетон 3:1 - 45 мл . Объединенные хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 250 мл добавляют 5 - 7 г безводного сульфата натрия встряхивают и оставляют стоять на 30 минут в темноте. Раствор фильтруют через кусочек ваты помещенный в химическую воронку в грушевидную колбу. Хлороформный раствор упаривают на ротационном испарителе до объема 1 мл. Далее производят очистку экстракта с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты затем безводный сульфат натрия толщина слоя 5 мм наливают суспензию 2 г силикагеля в хлороформе сверху насыпают слой безводного сульфата натрия 20 мм . Дают хлороформу стечь затем на колонку наносят хлороформный экстракт образца элюируют смесью хлороформ-ацетон 9:1 60 мл. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе остаток растворяют в 2 мл хлороформа фильтруют через бумажный или капроновый фильтр в пробирку емкостью 5 мл отдувают растворитель в токе азота остаток растворяют в 400 мкл хлороформа раствор А и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. 1.3. Приготовление стандартных растворов афлатоксинов B B G G 1 2 1 2 Стандартные растворы готовят следующим образом: навески кристаллических афлатоксинов B B G G в 1 мг помещают 1 2 1 2 в мерные колбы на 100 мл и доводят до метки смесью бензол- ацетонитрил 98:2 . Концентрации афлатоксинов в приготовленных стандартных растворах составляют 10 нг/мкл. Для приготовления рабочего раствора смеси афлатоксинов B B 1 2 G и G с концентрациями 0 5 нг/мкл 0 25 нг/мкл 0 2 нг/мкл и 0 1 1 2 нг/мкл соответственно в мерную колбу на 50 мл помещают 2 5 мл стандартного раствора афлатоксина B ; 1 25 мл B ; 1 0 мл G и 1 2 1 0 5 мл G затем доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил 2 98:2 . Стандартный раствор хранится в холодильнике при температуре ниже 0 °C срок годности стандартного раствора 1 год. 1.4. Обнаружение и количественное определение афлатоксинов B B G G с помощью ВЭЖХ 1 2 1 2 Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - эфир-метанол-вода 95:4:1 скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанный метанол и бидистиллированную воду. Эфир перед использованием пропускают через колонку с оксидом алюминия. Все растворители необходимо предварительно отфильтровать. Флуоресцентный детектор устанавливается на длину волны возбуждающего излучения 360 нм или устанавливается соответствующий фильтр на линии возбуждения при работе с флуоресцентным детектором без монохроматора на линии эмиссии устанавливается эмиссионный фильтр с полосой пропускания от 418 нм. Входное напряжение самописца - 10 мВ чувствительность детектора устанавливается таким образом чтобы 1 нг афлатоксина B 1 соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Предел обнаружения при таких условиях составляет около 0 1 нг афлатоксина B во вколе 1 при флуоресцентном детектировании . Для калибровки прибора по флуоресцентному детектору в инжектор с помощью микрошприца вводится 1 мкл рабочего раствора для ВЭЖХ соответствует 0 5 нг афлатоксина B 0 25 нг B 0 2 нг G и 0 1 1 2 1 нг G и 2 мкл рабочего раствора 1 нг B 0 5 нг B 0 4 нг G 2 1 2 1 и 0 2 нг G . Для каждого количества афлатоксинов определяют 2 высоту пика. В приведенных выше условиях время выхода растворителя составляет 3 0 - 3 5 мин. время удерживания афлатоксинов: для B 9 0 - 10 0 мин. для B 11 0 - 11 8 мин. для G 13 0 - 14 0 1 2 1 мин. для G 15 6 - 17 0 мин. в зависимости от небольших изменений 2 в составе подвижной фазы и времени уравновешивания колонки. При высоких уровнях загрязнения пищевого продукта афлатоксинами свыше 10 мкг/кг по афлатоксину B рекомендуется 1 использовать также показания УФ-детектора. Калибровку прибора по УФ-детектору проводят также как в случае флуоресцентного детектора вводя в петлю инжектора 10 15 и 20 мкл рабочего раствора соответствует 5; 7 5 и 10 нг афлатоксина B ; 2 5; 3 75 и 1 5 нг афлатоксина B ; 2 3 и 4 нг G 1; 1 5 и 2 нг G . Предел 2 1 2 обнаружения по УФ-детектору составляет 1 нг по афлатоксину B . 1 В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл раствора А. При наличии пика совпадающего по времени удерживания с афлатоксином B B G G определяют его высоту h . Расчет 1 2 1 2 концентрации афлатоксина проводят по формуле: V x V x V x m x h 1 3 5 ст C = ---------------------- V x V x V x M x h 2 4 6 ст где: C - концентрация афлатоксинов в пищевом продукте в мкг/кг; V - объем водно-ацетоновой смеси в мл 125 мл ; 1 V - объем водно-ацетонового фильтрата взятый для анализа 2 50 мл ; V - объем водно-ацетонового фильтрата и раствора ацетата 3 свинца 100 мл ; V - объем фильтрата после очистки ацетатом свинца 80 мл ; 4 V - объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед 5 ВЭЖХ 400 мкл ; V - объем раствора экстракта вводимого в петлю инжектора 6 хроматографа 20 мкл ; m - количество нг афлатоксина в введенном объеме стандарта; ст h - высота пика стандарта афлатоксина в мм; ст h - высота пика афлатоксина в введенном объеме экстракта в мм; М - навеска продукта взятая в г. При приведенных в скобках объемах и навесках формула содержания афлатоксинов выражается следующим образом: h C = 2 5 x --- x m . h ст ст Если пик афлатоксина выходит за пределы шкалы самописца анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно уменьшая объем вводимого раствора экстракта V или разбавляя раствор экстракта 6 хлороформом увеличивая объем V . При необходимости подтверждения 5 проводят совместный ввод экстракта со стандартом афлатоксинов. 1.5. Подтверждение наличия афлатоксинов с помощью двумерной ТСХ Для подтверждения наличия афлатоксинов пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями. В правом нижнем углу на расстоянии 1 5 см от краев наносят 20 мкл раствора А в правом верхнем углу наносят 5 мкл рабочего раствора смеси афлатоксинов. В левом нижнем углу на расстоянии 1 2 и 3 см от левого края и 1 5 см от нижнего края пластинки наносят 2 5 и 10 мкл рабочего раствора смеси афлатоксинов. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-метанол-вода 94:4 5:1 5 и развивают пластинку в 1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 минут затем развитие пластинки проводят во втором направлении в системе хлороформ-ацетон-вода 90:10:1 . После достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии ее извлекают из камеры и сушат на воздухе. Рассматривают пластинку в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен соответствующих по хроматографической подвижности и цвету флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов свидетельствует о возможном присутствии афлатоксинов в пищевом продукте. Для подтверждения наличия афлатоксинов ТСХ-пластинку опрыскивают раствором азотной кислоты в воде 1:2 и рассматривают ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет флуоресценции стандартов афлатоксинов изменился с синего B B 1 2 или сине-зеленого G G на желтый цвет а цвет флуоресценции 1 2 пятен экстракта на желтый не изменился то афлатоксины в пробе отсутствуют. Если же цвет флуоресценции пятен экстракта также изменился на желтый то это служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в пищевом продукте. 2. Определение афлатоксинов B B G и G в маслах 1 2 1 2 2.1. Экстракция К 15 г масла добавляют 25 мл гексана 5 мл 4-процентного раствора хлорида натрия и 100 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 40 - 50 минут. Затем смесь помещают в делительную воронку и отделяют нижний ацетонитрильный слой. 2.2. Очистка экстракта Ацетонитрильный экстракт обезжиривают в делительной воронке гексаном 3 x 50 мл высушивают сульфатом натрия и упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл хлороформа и проводят очистку с помощью колоночной хроматографии. На колонку с 4 г силикагеля п. 1.2 наносят хлороформный экстракт дают хлороформу стечь и промывают 100 мл смеси гексан-бензол-эфир 1:1:2 . Афлатоксины элюируют 100 мл смеси хлороформ-ацетон 9:1 . Элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в 2 мл хлороформа фильтруют через бумажный или капроновый фильтр отдувают растворитель в токе азота растворяют в 400 мкл хлороформа и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии п. 1.4 . Расчет концентрации афлатоксина проводят по формуле: V x h x m 1 ст C = ------------ V x h x M 2 ст где: C - концентрация афлатоксина в масле; V - объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед 1 ВЭЖХ 200 мкл ; V - объем раствора экстракта вводимого в петлю инжектора 2 хроматографа 20 мкл ; m - количество нг афлатоксина во введенном объеме стандарта; ст h - высота пика стандарта афлатоксина в мм; ст h - высота пика афлатоксина во введенном объеме экстракта в мм; М - навеска продукта взятая в г. Подтверждение наличия афлатоксина с помощью двумерной ТСХ проводят аналогично п. 1.5. 3. Определение афлатоксина M в молоке 1 3.1. Экстракция В коническую колбу на 250 мл помещают 50 мл натурального молока или раствор 5 г сухого молока в 50 мл воды 10 мл водного раствора 2 г хлорида натрия и 0 24 г лимонной кислоты 120 мл хлороформа все составные части предварительно подогревают до температуры 35 - 38°. Содержимое колбы встряхивают 2 - 3 минуты переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют 15 минут при 3000 - 4000 об./мин. Отделяют нижний хлороформный слой высушивают над 10 г безводного сульфата натрия отфильтровывают замеряют объем фильтрата V и упаривают до 5 мл. 2 Очистку проводят с помощью колоночной хроматографии. На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты затем безводный сульфат натрия толщина слоя 5 мм заливают суспензию 2 г 2 мл силикагеля в гексане и сверху насыпают слой безводного сульфата натрия. Дают гексану стечь так чтобы над слоем сульфата натрия осталось около 5 мл гексана. Вносят 5 мл анализируемого экстракта дают растворителю стечь и затем колонку последовательно промывают 25 мл смеси толуол-уксусная кислота 9 5:0 5 25 мл гексана и 25 мл смеси эфир-гексан-ацетонитрил 5:3:1 . Афлатоксин M элюируют с 1 колонки 60 мл смеси хлороформ-ацетон 4:1 . Элюат упаривают досуха растворяют в 200 мкл хлороформа и анализируют с помощью высокоэффективной хроматографии. 3.2. Приготовление стандартного раствора афлатоксина M 1 Навеску кристаллического афлатоксина M в 1 мг помещают в 1 мерную на 100 мл колбу и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил 9:1 . Концентрация афлатоксина M в 1 приготовленном стандартном растворе составляет 10 нг/мкл. Для приготовления стандартного раствора афлатоксина M с концентрацией 1 0 2 нг/мкл в мерную колбу на 50 мл помещают 1 мл стандартного раствора афлатоксина M и доводят до метки смесью 1 бензол-ацетонитрил 9:1 . 3.3. Обнаружение и количественное определение афлатоксина M с помощью ВЭЖХ 1 Условия ВЭЖХ: подвижная фаза эфир-метанол-вода 90:8:2 остальные параметры как в п. 1.4. Чувствительность детектора устанавливается таким образом чтобы 0 6 - 0 8 нг афлатоксина M 1 соответствовало отклонение пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 3 до 5% от полной шкалы. Для калибровки флуоресцентного детектора в инжектор вводится 1 2 3 мкл рабочего афлатоксина M что соответствует 0 2; 0 4; 0 6 нг афлатоксина M . 1 1 Для каждого количества афлатоксинов определяют высоту пика. В приведенных выше условиях ВЭЖХ время удерживания афлатоксина M 1 8 - 9 минут. В инжектор хроматографа вводится с помощью микрошприца 20 мкл раствора очищенного экстракта. При наличии пика совпадающего по времени выхода с афлатоксином M определяют его высоту h . Расчет 1 концентрации афлатоксина M проводят по формуле: 1 V x V x h x m 1 3 ст C = ----------------- V x V x h x M 2 4 ст где: C - концентрация афлатоксина M в молоке мкг/кг; 1 V - объем хлороформа взятого для экстракции 120 мл ; 1 V - объем хлороформного экстракта взятого для анализа; 2 V - объем очищенного экстракта в хлороформе перед ВЭЖХ 3 200 мкл ; V - объем раствора экстракта вводимого в петлю инжектора 4 хроматографа 20 мкл ; m - количество нг афлатоксина M в введенном объеме ст стандарта; h - высота пика стандарта афлатоксина в мм; ст h - высота пика афлатоксина в введенном объеме экстракта в мм; М - навеска продукта взятая в г. Если пик афлатоксина M в образце выходит за пределы шкалы 1 самописца анализ с помощью ВЭЖХ проводят повторно уменьшая объем вводимого раствора экстракта V или разбавляя раствор экстракта 4 хлороформом увеличивая объем V . 3 3.4. Подтверждение наличия афлатоксина M 1 с помощью двумерной ТСХ Очистка и обнаружение афлатоксина M 1 ТСХ-очистку и обнаружение афлатоксина M проводят с помощью 1 двумерной ТСХ на пластинках "Силуфол" аналогично п. 1.5. В качестве растворителей для развития хроматограмм используют в первом направлении смесь эфир-метанол-вода 90:8:2 во втором направлении смесь хлороформ-ацетон-изопропиловый спирт 85:10:5 . Тесты подтверждающие наличие афлатоксина M в продукте 1 проводят аналогично п. 1.5.