Медико-биологические исследования производственных штаммов микроорганизмов и токсиколого-гигиеническая оценка микробных препаратов, определение их безопасности и обоснование гигиенических нормативов и регламентов.Методические указания

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ ПРИКАЗ 26.10.2004 N 521 Об утверждении методических указаний "Медико-биологические исследования производственных штаммов микроорганизмов и токсиколого-гигиеническая оценка микробных препаратов определение их безопасности и обоснование гигиенических нормативов и регламентов" Согласно статье 40 Закона Украины "Об обеспечении санитарного и эпидемического благополучия населения" ПРИКАЗЫВАЮ: 1. Утвердить методические указания "Медико-биологические исследования производственных штаммов микроорганизмов и токсиколого-гигиеническая оценка микробных препаратов определение их безопасности и обоснование гигиенических нормативов и регламентов" прилагаются . 2. Департаменту государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Украины методические указания довести до учреждений и заведений государственной санитарно-эпидемиологической службы министерств других центральных органов исполнительной власти в установленном порядке. 3. Контроль за выполнением приказа возложить на директора Департамента государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Украины Бережнова С.П. Первый заместитель Министра Главный государственный санитарный врач Украины О.В. Лапушенко УТВЕРЖДЕНО Приказ МОЗ Украины 26.10.2004 N 521 Методические указания "Медико-биологические исследования производственных штаммов микроорганизмов и токсиколого-гигиеническая оценка микробных препаратов определение их безопасности и обоснование гигиенических нормативов и регламентов" 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Методические указания предназначены для специалистов которые занимаются обоснованием гигиенических нормативов производственных штаммов микроорганизмов-продуцентив и готовых форм препаратов которые их содержат в объектах производственной и окружающей сред. Штамм микроорганизмов - это генетически однородная популяция микроорганизмов с определенными стабильными специфическими морфологическими культуральными и биохимическими свойствами. 1.2. Методические указания составлены с учетом особенностей токсиколого-гигиенической оценки биологических препаратов на основе производственных штаммов микроорганизмов. Производственный штамм - штамм микроорганизмов который используется в промышленности при производстве того или другого продукта биопрепарата . Патогенные микроорганизмы не допускаются к использованию как производственные. Штам-продуцент - штамм микроорганизмов который продуцирует то или иное вещество антибиотик фермент и др. и используется для получение конечного продукта т.е. продукта биотехнологии . Биотехнология - технология производства продуктов при использовании живых клеток организмов микроорганизмов растений животных . 1.3. К производственным штаммам микроорганизмов относятся микроорганизмы различных категорий грибы бактерии являющиеся действенными факторами биопрепаратов или продуцентами биологически активных веществ которые используются для создания препаратов для различных отраслей народного хозяйства и здравоохранения микробиологические средства защиты растений от вредителей и болезней стимуляторы роста растений и микробиологические удобрения антибиотики ферменты витамины аминокислоты субстанции для лекарственных препаратов кормовые белки пищевые добавки деструкторы химических загрязнителей и др. . 1.4. Микробный препарат - это препарат который содержит в своем составе как действующий ингредиент жизнеспособные микроорганизмы в нативном или высушенном состоянии. Микробные препараты могут в своем составе иметь как монокультуры так и ассоциации микроорганизмов различных групп они могут содержать или только микроорганизмы например препараты для пищевой промышленности или кроме микроорганизмов продукты их жизнедеятельности разные минеральные и органические наполнители стабилизаторы эмульгаторы консерванты привлекательные продукты например микробные пестициды стимуляторы роста растений микробиологические удобрения . В отличие от химических веществ микроорганизмы являются живыми объектами способными сохранять жизнеспособность и размножаться при наличии определенных условий в окружающей среде или в макроорганизме. Продукты биотехнологии которые содержат в своем составе производственные штаммы микроорганизмов как правило не токсичны для теплокровных организмов но могут вызывать дисбиотическое сенсибилизирующее имуномодулирующе или другое специфическое действие. Использование производственных штаммов микроорганизмов и производство препаратов на основании микробного синтеза осуществляется предприятиями микробиологической промышленности и территориальными биотехнологическими предприятиями различной мощности биофабриками и биолабораториями. Штаммы зарегистрированные как возбудители инфекционных заболеваний у людей и полезных животных к применению как производственные не разрешаются. 1.5. Цель предложенных методических указаний - содействовать получению однородных данных которые можно сопоставить а также выбору и проведению оптимального объема исследований необходимых для обоснования гигиенических регламентов производственных штаммов микроорганизмов и готовых форм препаратов которые их содержат. Предусмотренный этими методическими указаниями объем исследования - обязательный минимум для исследователей однако он не является препятствием для использования других методов при условии их обоснования. Исследования предусматривают оценку опасности производственного штамма микроорганизмов и продуктов биотехнологии на их основе при поступлении в организм лабораторных животных путями адекватными реальным условиям трудовой деятельности и проживания человека с целью выбора лимитирующего критерия вредности и установления ПДК предельно допустимой концентрации . 1.6. Проведение токсиколого-гигиенических исследований и определение патогенных свойств новых производственных штаммов микроорганизмов разработка ГДК штаммов и продуктов биотехнологии на основе микроорганизмов определение опасности для здоровья этих продуктов осуществляется лабораториями научно-исследовательских учреждений различных ведомств которые аккредитованы в установленном порядке Комитетом по вопросам гигиенического регламентирования МОЗ Украины. Гигиеническому регламентированию подлежат штаммы микроорганизмов которые прошли в указанных учреждениях первичную токсиколого-гигиеническую оценку как действующие факторы биопрепаратов или как продуценты для микробиологического синтеза и получили в установленном порядке разрешение МОЗ Украины на их использование в технологических процессах а также готовые формы препаратов изготовленные на основании этих микроорганизмов или продуктов их метаболизма. 1.7. В случае направления на токсиколого-гигиенические исследования производственного штамма или группы штаммов микроорганизмов разработчику владельцу штамма необходимо предоставить паспорт штамма со сведениями о его таксономическом положении источнике выделения культурально-морфологические и биохимические свойства тесты и критерии идентификации условия культивации способ применения. В случае направления на исследование готового биопрепарата необходимо предоставить сведения о составе препарата содержании действующего ингредиента и посторонней микрофлоры наполнютелей эмульгаторов и других вспомогательных веществ агрегатное состояние назначение способ производства . 1.8. В последние годы в связи с развитием биотехнологии предлагается промышленное использование генетически модифицированных микроорганизмов. Степень их опасности зависит не только от патогенных свойств штамма-хозяина и рекомбинантной ДНК способности к выживанию в объектах производственной и окружающей среды но особенно от способности к передаче генетической информации другим организмам. В связи с отсутствием методических подходов к гигиеническому регламентированию таких штаммов и недостаточностью научных данных для разработки критериев оценки их потенциальной опасности выброс генетически-модифицированных микроорганизмов в процессе производства в воздух рабочей зоны и в окружающую среду запрещается. При получении необходимых данных это положение может быть пересмотрено. 1.10. При проведении исследований с микроорганизмами следует обязательно соблюдать правила техники безопасности при работе с микроорганизмами с целью предотвращения заражения экспериментаторов и лабораторных животных в соответствии с ГСП 9.9.5-080-02 "Правила устраивания и безопасности работы в лабораториях отделах отделениях микробиологического профиля". 2. ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Исследования по токсиколого-гигиенической оценке микробных препаратов включают несколько этапов: 1 исследование опасного действия производственного штамма микроорганизма-продуцента 2 токсикологические исследования готовой формы микробного препарата 3 гигиенические исследования. 2.2. Изучение действия на организм теплокровных животных новых производственных штаммов микроорганизмов является первым этапом исследований при проведении гигиенического регламентирования микробных препаратов в объектах производственной и окружающей сред направленное на выяснение патогенности микроорганизма под которой понимается потенциальная способность последнего вызывать специфическое инфекционное заболевание у макроорганизма определенного вида. Патогенность является видовым генетическим признаком микроорганизма и определяется многими факторами так называемыми "факторами патогенности" основными из которых являются инфекционность инвазивность и токсичность. Инфекционность - способность вызывать инфекционный процесс в естественных условиях тесно связанная с инвазивностью - способностью преодолевать защитные барьеры организма проникать и размножаться в его тканях. Инвазивность осуществляется при помощи определенного набора средств в число которых в частности входит капсюльное вещество микроорганизмов которое защищает их от фагоцитоза гемолизины лейкоцидины коагулаза фибринолизин и ряд других. Токсичность - способность при помощи токсических продуктов бактериальной клетки экзо- и эндотоксинов вмешиваться в метаболические функции хозяина нарушая стабильность его внутренней среды. 2.3. Многолетний опыт изучения производственных штаммов микроорганизмов-продуцентив и влияния их на состояние здоровья лиц постоянно контактирующих с ними при производстве биотехнологических продуктов свидетельствует о возможной способности этих объектов вызывать также аллергенное или дисбиотическое действие. Следовательно принципиальная схема исследований опасности производственных микроорганизмов включает в дальнейшем изучение следующих типов действия: патогенности имунотоксичности и дисбиотического действия. 2.4. На втором этапе токсиколого-гигиенических исследований проводят изучение готовой формы микробного препарата который содержит живые вегетативные клетки микроорганизмов или споры . При токсиколого-гигиенической оценке микробного препарата прежде всего следует учитывать численность микроорганизмов и состояние в котором они находятся в препарате высушенные или нативные клетки и от которого зависит их патогенность. На последнюю могут влиять также и другие компоненты которые входят в микробный препарат: продукты жизнедеятельности остатки питательной среды различные минеральные и органические наполнители стабилизаторы эмульгаторы и т.д. Каждое из этих веществ может воздействовать на организм как самостоятельно так и в комплексе с микроорганизмом усиливая действие последнего. Поэтому в дополнение к исследованиям которые проводятся для определения безопасности производственного штамма микроорганизмов - основного действующего фактора препарата определяют также общетоксическое действие препарата в острых и субхронических экспериментах выявляют сенсибилизирующее и дисбиотическое действие раздражающее действие на кожу. 2.5. При наличии производства опытного или промышленного проводится гигиеническое исследование условий производства микробиологическое исследование воздуха рабочей зоны и атмосферного воздуха. При изучении микробных препаратов которые при применении вносятся в окружающую среду например микробные пестициды удобрения и стимуляторы роста растений микробные деструкторы изучают выживание микроорганизмов которые входят в состав микробного препарата в объектах окружающей среды и влияние на процессы микробной самоочистки воды и грунта. 3. МЕТОДЫ ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ 3.1. Предпосылки проведения исследований 3.1.1. При проведении работ по исследованию штаммов микроорганизмов необходимо использовать свежую культуру продуцента которую выращивают учитывая скорость роста и того возраста культуры при котором согласно регламенту конкретного производства наиболее достоверно попадание штамма в воздух производственной и окружающей сред. При этом используют те питательные среды которые обеспечивают оптимальный рост исследуемой культуры. 3.1.2. Методические указания включают специальные тесты необходимые для определения патогенного/токсического действия микроорганизмов на организм теплокровных животных. Следует указать что расчеты доз микроорганизмов которые вводятся в организм проводятся не так как для химических веществ когда количество препарата выражается как правило во мг на кг массы животного или человека. При оценке опасности микроорганизмов такие расчеты непригодны потому что видовая восприимчивость макроорганизма к микроорганизму имеет не меньшее значение чем патогенные свойства микроорганизма в связи с чем доза микроорганизмов которая вводится выражается не в мг а по количеству микробных клеток на весь организм а не на его вес. Выражается это количество в единицах введенных микроорганизмов на одного экспериментального животного: для бактерий за такую единицу принимается образование которое продуцирует одну колониеобразующую единицу КУО на соответствующей твердой питательной среде для грибов - отдельная спора которая определяется микроскопически или дает одну КУО на соответствующей питательной среде. 3.1.3. Для получения биомассы микроорганизмов культуру несколько раз отмывают от питательной среды в физиологическом растворе при повторном центрифугировании потом в маточном завесе по оптическому стандарту мутности готовят нужные концентрации микроорганизмов в физрастворе для введения лабораторным животным. 3.1.4. Исследования проводят с использованием лабораторных пловозрелых животных молодого возраста: белые мыши масса тела 16-18 г белые крысы масса тела 120-160 г морские свинки масса тела 200-250 г кролики масса тела 1500-2000 г . Указывается линия пол животных из какого питомника получены пищевой рацион и другие условия при которых проводилась каждая серия экспериментов. Условия содержания животных должны отвечать требованиям "Санитарных правил по устройству оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник вивариев " МЗ СССР 1973 и методических рекомендаций "Содержание лабораторных животных и уход за ними в учреждениях Минздрава УССР" МЗ УССР 1976 . Подбор животных и формирование из них однородных контрольных и опытных групп осуществляют с учетом одинаковой массы тела разница не должна превышать 20% средней массы каждого пола отсутствии разницы в поведении общем состоянии содержании лейкоцитов в крови и состоянии нормальной микрофлоры организма. Животные не должны иметь паразитов и патогенных микроорганизмов. Соблюдают также общепринятые правила при работе с микроорганизмами. 3.1.5. Микроорганизмы вводятся животным в виде гомогенной суспензии в стерильном физиологическом растворе NaCl. При изготовлении суспензии микроорганизмы осторожно в стерильных условиях гомогенизируют в физиологическом растворе. Густота суспензии зависит от природы микроорганизма количества его клеточных элементов в растворе. При определении рабочей концентрации клеток в суспензии пользуются оптическим стандартом мутности или камерой Горяева согласно морфологии и величины клеток бактерии или грибы . 3.1.6. Гомогенизация суспензии и асептичность являются обязательными условиями подготовки материала для экспериментального заражения. Максимальный объем жидкости который может быть введен однократно зависит от вида животного. При пероральном введении мышам вводят культуру микроорганизмов в объеме который не должен преувеличивать 1 мл для мышей и 5 мл для крыс. Диапазон отклонений должен быть минимальным. При интраназальном заражении суспензию микроорганизмов вводят под легким эфирным наркозом мышам в объеме 0 07-0 05 куб. см и крысам - 0 05-0 2 куб. см. При внутриполостном заражении суспензию вводят мышам в объеме 0 1 куб. см и крысам - 0 25 куб. см. 3.2. Определение патогенности микроорганизмов 3.2.1. Условной мерой патогенности микроорганизмов является их вирулентность которая выражается ЛД - дозой жизнеспособных микробных 50 клеток которая вызывает гибель 50% зараженных животных. Определение дозы для введения в организм экспериментальных животных зависит от рода и вида микроорганизмов к которым относится штамм который изучается. В острых экспериментах следует 8 использовать одну дозу - не меньше чем 10 КУО/животное при 6 поступлении через желудок и не меньше чем 10 КУО/животное при поступлении через органы дыхания интраназально . Вирулентность определяют на 2-х видах животных отдавая преимущество мышам и крысам. При использовании других видов животных исследователю необходимо обосновать причины такой альтернативной замены. Вирулентными считаются штаммы микроорганизмов ЛД которых 50 8 при поступлении через желудок меньше чем 10 КУО/животное для мышей 9 и меньше чем 10 КУО/животное для крыс а при поступлении 6 интраназально - меньше чем 10 КУО/животное для мышей и меньше чем 7 10 КУО/животное для крыс. Если штамм по величине ЛД является вирулентным то проведение 50 дальнейших исследований этого штамма не целесообразно. В этом случае заказчику выдается заключение о вирулентности штамма и невозможности его использования в производстве. Невирулентные штаммы подлежат дальнейшим исследованиям. 3.2.2. При определении вирулентности исследуемых микроорганизмов используют живые микроорганизмы при определении токсичности - инактивированные микроорганизмы. Инактивацию следует осуществлять тем способом который бы разрешал не разрушать микробную клетку. Лучше всего использовать прогрев микробной суспензии на водяной бане при 60-80 град. С на протяжении 1 часа. Токсичность определяется по токсикометрическому показателю ЛД 50 инактивированных микроорганизмов. 3.2.3. В эксперименте по определению инфекционности должно быть не меньше 6 опытных животных по 3 животного каждого пола . При этом используют суспензию живых микроорганизмов. Контрольные животные получают вместо микробной суспензии соответствующий объем физиологического раствора. Наблюдения за животными проводят на протяжении 15 дней в случае заражения бактериями и 30 дней - в случае заражения грибами. При этом учитывают внешний вид и поведение животных проводят термометрию определение массы тела исследуют наличие микроорганизмов в крови внутренних органах и выделениях животных и скорость очистки организма от них проводят морфологические исследования крови. Особое внимание следует уделять наблюдениям за появлением тремора конвульсий поноса сонливости слюнотечения и других симптоматических проявлений инфекционности. При выявлении гибели животных а также после их забоя проводят бактериологические и морфологические исследования внутренних органов животных. 3.2.4. Если в экспериментальных исследованиях не обнаружены какие-либо клинические симптомы и отклонения в общем состоянии лабораторных животных микроорганизмы не инвазивные т.е. не способны проникать в клетки организма и не инфекционные следует считать такие микроорганизмы не патогенными. Направляются первичные данные опытов в виде таблиц и результатов статистической обработки. 3.3. Изучение раздражающего/воспалительного действия на слизистую оболочку глаза 3.3.1. В условиях промышленного производства а в ряде случаев и применения микробных препаратов например в сельском хозяйстве возможно попадание производственных штаммов микроорганизмов на открытые участки кожи и слизистые оболочки работающих. В связи с этим при лабораторном исследовании патогенных свойств микроорганизмов проводится определение влияния производственных микроорганизмов на коньюнктиву глаз кроликов как общепринятую модель которая применяется для изучения повреждений слизистых оболочек а также на кожу кролей желательно альбиносов или морских свинок. В коньюнктивальную полость одного глаза кролей вводится 0 1 мл суспензии культуры микроорганизмов в 7 физиологическом растворе который содержит не меньше 10 КУО. Другой глаз является контрольным. Для контроля не нужна отдельная группа животных потому что каждое экспериментальное животное является в то же время и контрольным один глаз - опытный второй - контрольный . В эксперименте должно быть использовано не меньше 6 кролей. До начала эксперимента тщательно исследуются оба глаза животные с любыми повреждениями слизистой оболочки не должны использоваться. Нанесение суспензии микроорганизмов в коньюнктивальную полость осуществляется после мягкого отведения нижнего века от глазного яблока. Потом веки поднимают вместе на протяжении 1 сек. чтобы предотвратить вытекание суспензии. Наблюдение за животными проводятся ежедневно на протяжении 15 дней после введения при исследовании бактерий и 21 дня после введения грибов. При исследовании состояния глаза и коньюнктивы используются бинокулярная лупа прожекторная лампа другие оптические средства. 3.3.2. Оценка травмирующего действия на слизистые оболочки глаза кроля проводится согласно таблице 1 по Majda и Chrusaielska . Таблица 1 Оценка травмирующего действия микроорганизма на слизистую оболочку ------------------------------------------------------------------ Показатели Балы ---------------------------------------------------+------------ А. Гиперемия коньюктивы и роговицы: ---------------------------------------------------+------------ Сосуды иньециированные 1 ---------------------------------------------------+------------ Отдельные сосуды трудно различить 2 ---------------------------------------------------+------------ Диффузное глубокое покраснение 3 ---------------------------------------------------+------------ Б. Отек ресниц: ---------------------------------------------------+------------ слабый отек 1 ---------------------------------------------------+------------ выраженный отек с частично завернутыми ресницами 2 ---------------------------------------------------+------------ вследствие отека глаз закрыт наполовину 3 ---------------------------------------------------+------------ вследствие отека глаз закрыт полностью 4 ---------------------------------------------------+------------ В. Выделения: ---------------------------------------------------+------------ минимальное количество выделений 1 ---------------------------------------------------+------------ количество выделений увлажняет веки 2 ---------------------------------------------------+------------ количество выделений увлажняет веки 3 и окружающую кожу ------------------------------------------------------------------ При резко выраженных повреждениях глаза суммарное количество балов равно 10. Специальных опытов по выявлению сенсибилизирующего действия микроорганизмив-продуцентов не проводят поскольку они как не свойственные для макроорганизмо живой клетки являются облигатными аллергенами и отличаются только степенью проявления данного эффекта. 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ МИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА 4.1. Определение токсичности микробного препарата в острых экспериментах 4.1.1. Токсичность микробных препаратов определяется путем вычета ЛД при различных путях введения лабораторным животным 50 белым мышам и крысам - в желудок через органы дыхания в различных концентрациях в физиологическом растворе. Передается этот показатель в зависимости от путей введения в мг/кг и КУО/животное при введении в желудок и в КУО/куб. м при введении через органы дыхания . перечисление количества введенных интраназально микроорганизмов на концентрацию их в воздухе приведено в разделе 4.2. 4.1.2. Введение классификации производственных штаммов микроорганизмов по классам опасности как это принято в профилактической токсикологии не является целесообразным поскольку все микроорганизмы которые разрешаются МОЗ Украины как производственные штаммы относятся к непатогенным и/или в отдельных случаях к условно патогенным. По классификации ВООЗ эти микроорганизмы относятся к II группы риска умеренный индивидуальный риск и ограниченный риск для населения в целом т.е. по степени опасности отвечают III классу согласно ГОСТ 12.1.007-76 "Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности". 4.2. Определение субхронической токсичности микробных препаратов 4.2.1. Исследования предусматривают определение лимитирующих критериев вредности и установления ГДК в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе. При проведении эксперимента при поступлении микроорганизмов через органы дыхания интраназально используют те виды лабораторных животных которые оказались наиболее чувствительными в острых экспериментах. Используют не меньше 20 опытных животных по 10 каждого пола которые получают ежедневно не 4 меньше 10 жизнеспособных клеток на животного для условий рабочей 3 зоны и не меньше 10 для условий атмосферного воздуха. 4.2.2. Перечисление введенного количества микроорганизмов на концентрацию их в воздухе который вдыхается осуществляется по формуле: K = D: V 1 где: К - количество микробных клеток в 1 куб. м воздуха КУО/куб. м Д - количество микробных клеток введенных животному КУО/животное V - объем воздуха который вдыхается куб. м . Величина объема воздуха который вдыхается V определяется как произведение легочной вентиляции для данного вида животных на массу тела и срока ингаляции 2 часа в сутки для мышей и 4 часа для крыс и морских свинок при обосновании ПДК в воздухе рабочей зоны и 24 часа при обосновании ПДК в атмосферном воздухе населенных мест . Показатели легочной вентиляции в куб. см/г/мин составляют: для мышей - 1 24 крыс - 0 65 морских свинок - 0 33. 4.2.3. Примеры расчетов величины легочной вентиляции для крыс: А. Фиксированное значение величины легочной вентиляции на протяжении 4- часовой экспозиции для крыс весом 200 г составляет: 0 65 куб. см/г/мин х 200 г х 240 мин = 0 0312 куб. м V 4 час = --------------------------------------------------- 1000000 перечисление в куб. м Б. Фиксированное значение величины легочной вентиляции на протяжении 24- часовой экспозиции составляет для крыс: 0 65 куб. см/г/мин х 200 г х 1440 мин = 0 1872 куб. м V 24 час = --------------------------------------------------- 1000000 4.2.4. Примеры расчетов величины легочной вентиляции для мышей: А. Фиксированное значение величины легочной вентиляции на протяжении 4- часовой экспозиции для мышей весом 18 г составляет: V 4 час = 1 24 куб. см/г/мин х 18 г х 240 хв = 0 0027 куб. м ------------------------------------------------- 1000000 Б. Фиксированное значение величины легочной вентиляции на протяжении 24- часовой экспозиции составляет для мышей: V 24 час = 1 24 куб. см/г/мин х 18 г х 1440 мин = 0 032 куб. м ------------------------------------------------- 1000000 4.2.5. Примеры расчета концентрации микроорганизмов в 4 воздухе при интраназальном введении крысам массой 200 г 10 КУО/животное: А. Для условий рабочей зоны: К = 10000 = 3 2 х 105 КУО/куб. м ------ 0 0312 Б. для условий атмосферного воздуха: 4 К = 10000 = 5 3 х 10 КУО/куб. м ------ 0 1872 4.2.6. Ежедневно наблюдают за общим состоянием животных за состоянием кожи и мехового покрова потребления корма и воды. Особое внимание уделяется проявлениям симптомов поноса конвульсий сонливости слюнотечения. Масса животных определяется перед введением материала через 1 мин при гибели животных и при забое. При гибели животных и при забое проводится вскрытие животных бактериологическое и гистологическое исследование внутренних органов. Через 1 месяц от начала введения культуры перед забоем и до конца восстановительного периода проводятся также гематологические исследования определение иммунотоксичности и дисбиотического действия. 5. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ МИКРОБНОГО ПРЕПАРАТА НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ ОРГАНИЗМА 5.1. Определение порога иммунотоксического действия Иммунотоксическое действие микробного препарата может проявляться сенсибилизацией иммунизацией признак антигенности микроорганизма и неспецифической имуномодуляцией. 5.1.1. Проведение кожаных проб Исследуемый материал прогретой при 80 град. С живая культура производственного штамма суспензируется в физрастворе. 0 05-0 1 куб. см вводится в обработанную спиртом кожу внешней поверхности уха морской свинки с помощью туберкулинового шприца. При этом иглу нужно вынимать зигзагообразно чтобы не было потери суспензии. Учет реакции - через 20 мин. для выявления аллергии немедленного типа и через 24-48 час. для выявления аллергии медленного типа. Положительная реакция выражается в появлении на месте введения вещества покраснения припухлости. Используется 6 опытных и 6 контрольных животных. При необходимости в зависимости от интенсивности эффектов может быть использован более широкий спектр методов и показателей. 5.1.2. Определение гиперчувствительности медленного типа ГПТ Животных которые подлежали длительному ежедневному действию препаратом 5 иммунизируют одноразово внутрикожно 2 х 10 эритроцитов барана 8 в 0 05 куб. см физиологического раствора. На 5-в сутки вводят 10 эритроцитов в 0 05 куб. см физиологического раствора в подушечку задней лапки решающая инъекция . В контрольную лапку вводят физраствор в том же объеме. Местную воспалительную реакцию интенсивность ГУТ оценивают через 24 час. по разнице толщины опытной и контрольной лап замеряют инженерным микрометром МК-0-25 . Вычисляют среднеггрупповые показатели отека у животных контрольной 6 животных и опытной групп 6 животных . Результаты выражают в условных единицах одна равна 0 01 мм. 5.1.3. Определение антител к эритроцитам барана Крысам опытной 6 животных и контрольной 6 животных групп вводят внутриполостно 0 5 куб. см 50% суспензии эритроцитов барана. На 7-е 14-е 21-е 28 сутки после введения эритроцитов из хвостовой вены животных в пробирку вносят по 0 5-1 куб. см крови. Пробирки размещают в термостате при +37 град. +-1 град. С на 20 мин потом переносят в холодильник при +6 град. +-2 град. С на 18 час. после чего пастеровской пипеткой отбирают сыворотки подогревают их при +56 град. С на протяжении 20 мин на водяной бане а далее разводят дважды физраствором - 1:4 1:8 и в объеме 0 25-0 5 куб. см на планшетах. К разведенным сывороткам добавляют 0 1 куб. см 2% суспензии эритроцитов барана встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Предварительный учет результатов реакции проводят через 2 час. а окончательный - через 18-24 час. При положительной реакции кружевоподобный осадок эритроцитов в виде тонкой пленки с неправильными волнистыми краями перевернутый зонтик распределяется равномерным слоем по дну. При отрицательной реакции эритроциты оседают в форме компактного небольшого диска или обручального кольца с ровными краями. Результаты реакции выражают в условных единицах титрах - по наибольшему разведению сыворотки которая дает положительную реакцию т.е. полную аглютинацию 0 1 куб. см 2%-ной суспензии эритроцитов барана. Уменьшение титра антител свидетельствует об угнетении действия препарата на гуморальное звено иммунного ответа. Увеличение титра свидетельствует о стимулирующем действии. 5.1.4. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов Из исследуемой культуры производственного штамма микроорганизма готовят суспензию на физиологическом растворе в концентрации 9 10 клеток/мл; 0 1 куб. см этой суспензии добавляют в 0 1 куб. см гепаринизованой крови опытных и контрольных животных смешивают и инкубируют при +37 град. +-1 град. С на протяжении 30 мин. после чего готовят мазки для подсчета форменных клеток крови. Подсчитывают 200 нейтрофилов вычисляют процент фагоцитирующих нейтрофилов т.е. количество лейкоцитов с 100 которые обнаружили фагоцитарную активность. В опыт берутся не меньше чем по 6 животных как в опытной так и в контрольной группе. 5.2. Изучение дисбиотического действия 5.2.1. При изучении действия производственного штамма микроорганизмов или микробного препарата на аутофлору резидентную микрофлору организма как тест-система используется микробиоценоз толстого кишечника лабораторных животных. На каждую дозу исследуемого объекта используется не меньше 6 животных. Контрольная группа которая находится в тех же условиях существования но не получает продуцента или биопрепарата также должен иметь не меньше 6 животных. Следует заметить что животные которых применяют для изучения аутофлоры не подлежат другим исследованиям т.е. у них не забирают кровь не травмируют другими исследованиями . Бактериологическое исследование содержимого толстого кишечника животных проводится в динамике: до опыта фон через 1 и 2 месяца от начала опыта и в конце восстановительного периода. 5.2.2. Для посева используют десятикратные разведения фекалий в физиологическом растворе. Определяют количество микроорганизмов: кишечной палочки посев на среду Эндо гемолитических бактерий посев на 5%-ной кровяной агар энтерококков на азидовом агаре стафилококков посев на солевой агар грибов на среде Сабуро общее количество анаэробов на МПА в анаэростате . Все посевы на аэробы инкубируют 24-48 час. при +37 град +-1 град. С посевы на анаэробы - 24-48 час. в анаеростате при +37 град. +-1 град. С. Определяют количество микроорганизмов в 1 г фекалий. Критерием дисбактериоза служат изменения по сравнению с контрольной группой количественного состава микрофлоры толстого кишечника опытных животных. 5.2.3. Если показатели количественного состава микрофлоры более чем по двум группам микроорганизмов отличаются от контроля но после периода восстановления эти изменения исчезают то дисбиотическое действие оценивается как умерено выраженное. При гигиеническом нормировании дозу или концентрацию производственного штамма микроорганизмов или биопрепарата которая вызывает дисбактериоз следует считать порогом дисбиотического действия. Если количественный состав микрофлоры кишечникы опытных животных отличается от показателей контрольной группы хотя бы по одной из выученных групп микроорганизмов но изменения не исчезают после восстановительного периода то это рассматривается как сильное дисбиотическое действие. Дозу или концентрацию которая вызвала сильное дисбиотическоне действие следует считать действующей по этому эффекту. 6. ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 6.1. Исследование влияния микробного препарата на процессы микробной самоочисткиводы и грунта 6.1.1. Исследование влияния микробного препарата на санитарный режим воды и грунта проводится в случаях когда имеет место загрязнение окружающей среды. Например когда при производстве микробного препарата наблюдаются выбросы производственных штаммов микроорганизмов в окружающую среду и загрязнение воды водоемов или грунта или когда микробные препараты вносятся в окружающую среду при их применении микробные пестициды микробные биоудобрения и стимуляторы роста растений деструкторы химических загрязнителей . Опыты проводятся со штаммом микроорганизма-продуцента - основным действующим ингредиентом микробного препарата. 6.1.2. В эксперименте с водой используют аквариумы емкостью 5 куб. дм и больше. Микроорганизмы вносят одноразово в воду отобранную из открытого водоема в количестве которое отвечает максимальной норме его сельскохозяйственного или экологического применение а также на 1-2 порядка выше и ниже. Исследуются сроки выживаемости продуцента в воде и влияние на процессы микробной самоочистки от санитарно-показательной и патогенной микрофлоры. Для этого в исследуемую воду вносят кроме производственного штамма также Э. coli S. typhimurium в количестве 5 5 х 10 КУО/куб. дм. 6.1.3. Действие продуцента на процесс нитрификации органических веществ определяют по содержанию нитритов и нитратов. Контролем служит вода в которую не вносился продуцент. Исследования проводят при комнатной температуре в динамике: до внесения продуцента в воду фон сразу после внесения и на протяжении 1-3 месяцев до исчезновения продуцента . 6.1.4. При исследовании самоочищающей способности грунта используют чернозем или другой грунт с хорошей поглощающей способностью высоким содержанием гумуса и нейтральной реакцией рН . Устанавливают влажность на уровне 60% от полной влагоемкости. Порции грунта не меньше 1 кг в стеклянной посудине перемешивают с продуцентом и вносят санитарно-показательные микроорганизмы. Наблюдения проводят в динамике как и исследование воды. 6.2. Гигиенические исследования условий производства микробного препарата 6.2.1. При наличии опытного или промышленного производства необходимо проведение гигиенических исследований с целью определения загрязнения воздуха рабочей зоны микроорганизмами-продуцентами. Для этого используются методики разработанные для каждого конкретного вида производственного штамма микроорганизмов. Кроме того целесообразно параллельно проводить определение общего количества микроорганизмов для оценки микробного фона в помещении а также возможного загрязнения воздуха микроорганизмами не производственного назначения. При этом используются общепринятые питательные среды. 6.2.2. Для забора проб воздуха на микробное загрязнение используются специальные приборы для микробиологического исследования воздуха прибор Кротова Андерсена многокаскадные импакторы и другие приборы . При этом пробы воздуха засеваются непосредственно на специфическую для исследуемого штамма питательную среду - жидкую или твердую в зависимости от прибора. 6.2.3. Наряду с обследованием воздуха в производственных помещениях необходимо проводить медицинские осмотры работающих по общепринятой схеме для биотехнологических предприятий и анализ заболеваемости. Полученные результаты гигиенических исследований используют вместе с результатами экспериментальных исследований при обосновании ГДК биопрепаратов. 6.2.4. Натурные наблюдения целесообразно проводить после выполнения экспериментальных токсиколого-гигиенических исследований когда уже должны быть известны лимитирующие признаки вредности биопрепарата. Цель гигиенических исследований - определить количество микробного препарата производственного штамма которое может поступать в организм человека вследствие загрязнения производственной или окружающей среды оценить реальную угрозу здоровью человека и обосновать требования к условиям безопасности процессов производства биопрепарата или его применения. 7. ОБОСНОВАНИЕ ВЕЛИЧИНЫ ПДК 7.1. При установлении ПДК микробных препаратов в различных объектах расчеты следует проводить по основному действующему фактору - производственному штамму микроорганизма-продуцента и давать ее величину в микробных клетках КУО на единицу измерения объекта среды для которого предлагается норматив. Если в товарную форму препарата входят несколько штаммов микроорганизмов то норматив направляется по сумме штаммов. 7.2. Величина ПДК устанавливается исходя из лимитирующего порога субхронического действия иммунотоксического дисбиотического . В случае если лимитирующим признаком вредного действия производственного штамма микроорганизмов является сенсибилизирующее ставится пометка А аллерген . Коэффициент запаса для ПДК в воздухе рабочей зоны и воде водоемов принимается равным 10 а для ПДК в атмосферном воздухе - равным 100. Максимальная величина ПДК микроорганизмов-продуцентов в воздухе 4 рабочей зоны ограничивается величиной 5 х 10 КУО/куб. м 3 а в атмосферном воздухе - 5 х 10 КУО/куб. м. 7.3. При нормировании микроорганизмов-продуцентов в воде или грунте в случае обоснования необходимости такого нормирования кроме результатов токсикологических исследований учитывают также данные по оценке влияния на процессы микробной самоочистки воды или грунта. Если лимитирующим признаком вредности является влияние на процессы самоочистки водоема то ПДК устанавливается на уровне пороговой концентрации. Максимальная величина ПДК в воде составляет 4 5 х 10 КУО/куб. дм. 7.4. В дальнейшем гигиеническая проверка и корректировка экспериментально установленной ПДК микроорганизмов-продуцентов и готовых форм препаратов проводится с использованием методических приемов которые приняты в практике гигиенического нормирования. Для воздуха рабочей зоны она предусматривает гигиеническую оценку производственной среды и изучение общей и профессиональной заболеваемости рабочих. Для атмосферного воздуха - оценку загрязнения микроорганизмом-продуцентом или готовой формой препарата воздушной среды селитебной зоны и изучение заболеваемости населения. ЛИТЕРАТУРА 1. Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны. / МЗ СССР Г. 1980. - 20 с. 2. Санитарно правила "Безопасность работы с рекомбинантными молекулами ДНК". - Г.: МЗ СССР 1989. - 17 с. 3. Промышленная микробиология. Термины и определения. - ГСТУ 2424-94. - Изд. официальное. - Киев: Госстандарт Украины 1994. - 7 с. 4. Омельянец Т.Г. Мельник Г.П. О некоторых методических приемах оценки дисбактериотического действия микробных средств защиты растений. // Актуальные вопросы гигиены. - Кишинев 1987 ч. II. С. 22. 5. Omelianets T.G. Artuch V.P. Ganeva S.L. The methodical approaches to biological indications of air wastes of the enterprises of а microbiological industry // Aerosols Science devices soft ware and technologies . 1998 V. 4c N 1 - Р. 123-126. 6. Omelianets T.G. Biological hazards as risk factors in microbiological industry // Pharmacology and Toxicology An international journal . 1997. v. 80 suppl. III Copenhagen. - Р. 141-143. 7. Методические рекомендации "Особенности ведения предохранительного и текущего санитарного надзора за разработкой и внедрением нормативов предельно-допустимых выбросов ПДВ биологических факторов в атмосферный воздух. МР 2.2.6.-004-98 // Сбирн. важн. офиц. материалов по сан. и противоэпид. вопросам. - Киев 1998. - Т. 5 ч. 2. - С. 59. 8. Омельянец Т.Г. Присяжнюк В.Е. Ганева С.Л. Методические аспекты гигиенической регламентации в воздухе продуктов микробиологического синтеза с низким их выходом из биомассы продуцента / Гигиена населенных мест. Сб. науч. ст. УНГЦ. - Киев 1998 - Вып. 33. - C. 58-63. 9. Государственные санитарные правила ГСП 9.9.5-080-02 "Правила устройства и безопасности в лабораториях отделах отделениях микробиологического профиля". Киев: МОЗ Украины 2002 - 18 С. 10. Директива 2000/54/ЕС от 18.09.2000 г. "О защите работников от опасностей связанных с влиянием биологических агентов на производстве". - 27 с.