МР 1959-79

МР 1959-79 Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и количественному определению N-нитрозаминов в пищевых продуктах

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ГЛАВНОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ УПРАВЛЕНИЕ УТВЕРЖДАЮ Начальник Главного санитарно- эпидимиологического управления Министерства здравоохранения СССР В.Е.Ковшило 11.01.1979 N 1959-79 Методические рекомендации по обнаружению идентификации и количественному определению N-нитрозаминов в пищевых продуктах Выборочный лабораторный контроль за содержанием в пище канцерогенных токсичных и других чужеродных веществ является одной из главных задач гигиены питания. Среди канцерогенов имеются соединения образующие в пищевых продуктах в естественных условиях технологической обработки и хранения. К таким соединениям относятся N-нитрозамины НА обладающие высокой канцерогенной активностью. Канцерогенность НА доказана на лабораторных животных причем эффект проявляется при действии черезвычайно низких доз НА порядка 0 075 мг/кг веса тела. Кроме того НА обладают мутагенными свойствами а некоторые из них - достаточно высокой токсичностью. В отличие от других химических канцерогенов НА представляют собой простые по химической структуре соединения общей формулы R1\ = N-NO . R2/ НА относительно стабильные вещества хорошо растворимые во многих органических растворителях хлористый метилен хлороформ эфир и др. и умеренно в воде. Многие НА в частности N-нитрозодиметиламин НДМА N-нитрозодиэтиламин НДЭА N-нитрозодипропиламин НДПА N-нитрозодибутиламин НДБА N-нитрозопирролидин НПир и N-нитрозопиперидин НПип обладают высокой летучестью с водяным паром летучие НА . НА способны легко оборазовываться из предшественников - нитритов или нитратов и аминов или других веществ содержащих аминогруппу. Нитриты содержатся в растениях почве природных водах. В этих же объектах но в значительно больших концентрациях имеются нитраты которые с помощью бактерий и ферментов могут восстанавливаться в нитриты. Кроме того нитриты и нитраты вносятся в пищевые продукты в процессе технологической обработки копчение соление консервирование и др. для фиксации цвета увеличения срока хранения и улучшения запаха. В ряде пищевых продуктов особенно рыбных и мясных содержится значительное количество аминов которые являются промежуточными веществами метаболизма белков. Вследствие этого НА могут образовываться в пищевых продуктах в побочных условиях технологической обработки и хранения. В плане профилактики заболеваний элиментарного происхождения важнейшее значение приобретает проведение санитарно-гигиенических исследований с целью обнаружения НА в пищевых прдуктах. Отсутствие унифицированных надежных методов анализа микроколичеств НА затрудняет сопоставление полученных результатов и является одной из причин большого разброса опубликованных данных количественного анализа. В пищевых продуктах в основном обнаружены НДМА НДЭА НПип а в отдельных случаях также НПир НДБА и др. Материалы характеризующие содержание летучих НА в некоторых отечественных и зарубежных пищевых продуктах приведены в таблице. В Институте питания АМН СССР в последние годы ведутся систематические исследования по разработке методов обнаружения идентификации и количественного определения НА а также по изучению содержания НА в отечественных пищевых продуктах. В результате проведенных исследований для серийных анализов разработан относительно простой и быстрый метод определения летучих НА в различных видах пищевых продуктов основанный на денитрозировании НА получении флуоресцирующих и окрашенных производных взаимодействием образовавшихся вторичных аминов с 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-I 3-диазолом НБД-хлоридом и визуальном сравнении на хроматографической пластинке интенсивностей флуоресценции и окрасок стандартных опытных и котрольных отличающихся от опытных только отсутсвием НА проб. При необходимости возможно также точное количественное определение НА путем элюирования соответствующих зон и флуриментрирования. К выгодным особенностям метода относяться простота выделения НА из пищевых продуктов значительное упрощение очистки экстрактов оценка содержания НА непосредственно на хроматографической пластинке. Важным преимуществом метода является возможность использования в качестве стандартов на самих НА а соответствующих вторичных аминов. Предел обнаружения в расчете на НА составляет в УФ-свете 1-5 нг а в видимом свете 10-30 нг в пятне. Различные окраски пятен желтая оранжевая розовая могут быть использованы для дополнительной идентификации НА. Метод позволяет надежно определять НА в любых пищевых продуктах при содержании 1 мкг/кг ивыше. Следует подчеркнуть что все испытательные результаты определения подтверждаются хромато-масс-спектрометрически. Результаты сравнительного анализа ряда мясных рыбных молочных и овощных продуктов хромато-масс-спекрометрическим флуориметрическим и предлагаемым нами методами близки. Воспроизводимость предлагаемого метода относительно мало отличается от воспроизводимости хромато-масс-спекрометрического метода коэффициент корреляции составляет 0 2-0 4 и 0 15-0 25 соответсвенно . Продолжительность определения - 3 часа; один аналитик за рабочий день может провести 7-8 анализов. В настоящий "Методических рекомендациях" описаны общие методические приемы проведения серийных определений НА в пищевых прдуктах и рекомендованы необходимая аппаратура и реактивы. МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА Оборудование и материалы 1. Парообразователь. 2. Колба круглодонная с длинным горлом на 1000 мл с нормальным шлифом НШ N 29 по ТУ 48-52. 3. Колба плоскодонная на 100 мл с НШ N 14 5 по ТУ 48-52. 4. Холодильник прямой с НШ N 14 5 с алонием по ГОСТ 9499-70. 5. Цилиндры мерые вместимостью 250 100 и 50 мл по ГОСТ 1770-74. 6. Плитки электрические. 7. Весы технические по ГОСТ 19491-74. 8. Делительная воронка вместимостью 250 мл по ГОСТ 8613-75. 9. Колба для упаривания на 50 мл с НШ N 14 5 по ГОСТ 10394-72. 10. Дефлегматорная насадка по ГОСТ 20789-75. 11. Ротационный испаритель с ловушкой по МРТУ 42-2589-66. 12. Насос водоструйный по ГОСТ 10696-75. 13. Баня водяная по ТУ 64-1-423-72. 14. Пипетка на 1 и 2 мл по ГОСТ 20292-74. 15. Термометр 0-100 град.C по ГОСТ 2045-71. 16. Чашки фарфоровые выпарительные диаметр 50 мм по ГОСТ 9147-73. 17. Микропипетки на 0 1 мл по ГОСТ 1770-74. 18. Пробирки на 5 мл с НШ N 14 5 с притертыми пробками по ГОСТ 10515-7. 19. Шкаф сушильный типа МРТУ 42-1411-61 . 20. Микрошприц МШ-10 или калиброванный капилляр. 21. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе модель ВЗЗ МРТУ 64-1-1080-63 или ртутно-кварцевая лампа типа ПРI-4 с фильтром прпускающим область 360 км типа УФС-6 . 22. Камера для ТСХ с притертой крышкой например стеклянный четырехугольный сосуд 195х195х200 мм завода "Дружная горка". 23. * * * пластинки стеклянные 9х12 см с нанесенным слоем силикагеля КСК 0 25-0 5 мм для ТСХ СССР . 24. Натрий сернокислый по 4166-76 хч. 25. Серная кислота по ГОСТ 14252-69 хч 8 н 22 мл H2SO4 плотностью 1 84 разбавляют 78 мл дистиллированной воды . 26. Сульфаниловая кислота по ГОСТ 5821-69. 27. Уксусная кислота ледяная по ГОСТ 61-75 или 18270-72. 28. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72. 29. Натрий углекислый по ГОСТ 8363 хч. 30. Едкий натрий по ГОСТ 4328-66 хч или 11078-71. 31. Эфир диэтиловый медицинский или ГОСТ 6265-52. 32. Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76. 33. Бромистоводородная кислота конц. по ГОСТ 2062-67; 3% раствор бромистоводородной кислоты в ледяной уксусной кислоте 1 4 мл HBr разбавить 18 6 мл уксусной кислоты . 34. 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-1 3-диазол НБД-хлорид ; раствор в 0 2 мг/мл в изопропиловом спирте. 35. Спирт изопропиловый ГОСТ 5.595-70. 36. Натрий кислый углекислый по ГОСТ 4143-69; 1% раствор в дистиллированной воде. 37. Диметиламин по ТУ 6-09-1426-71 хч. 38. Диетиламин по ТУ 6-09-68-70 хч. 39. Дибутиламин по ТУ 6-09-1802-72 хч. 40. Пиперидин по МРТУ 6-09-6855-69 хч. 41. Пироллидин * * *. 42. Соляная кислота конц. по ГОСТ 3118-67 или 14261-69; водный раствор 0 5 мг/мл. 43. Этилацетат по ГОСТ 5.1070-71 хч. 44. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51 хч. 45. Бензол по ГОСТ 5955-75 хч. 1. Выделение НА из пищевых продуктов. Схема установки для выделения НА перегонкой с водяным паром приведена на рис.1. До начала перегонки воду в парообразователе нагревают до кипячения. В круглодонную колбу помещают 100-120 г мелко измельченного образца продукта заливают раствором 80 г сульфата натрия 1 г сульфаниловой кислоты и 10 мл уксусной кислоты в 200 мл воды перемешивают 5 мин. добавляют 8 г серной кислоты. Затем колбу устанавливают в прибор для перегонки с водяным паром подогревают ее содержимое до начала кипения и начинают перегонку. Перегонку проводят до тех пор пока объем дистиллята не достигнет 100 мл. 2. Экстракция НА и концентрирование экстракта. В дистилляте 100 мл растворяют 3 г едкого натрия и 20 г углекислого натрия охлаждают и экстрагируют НА 60 мл эфира. Слои разделяют водный слой повторно экстрагируют 60 мл эфира. Эфирные экстракты объединяют сушат 3-4 г сульфата натрия безводного и коцентрируют в колбе для упаривания частями на ротационном испарителе при температуре 30-35 град.С с дефлегматорной насадкой до 0 4 мл. Схема установки для упаривания приведена на рис.2. Дефлегматорную насадку промывают 0 3 мл уксусной кислотй. 3. Денитрозирование НА и получение производных. К концентрату добавляют 0 4 мл 3% бромистоводородной кислоты в ледяной уксусной кислоте; смесь делят на две равные части опыт и контроль помещают в фарфоровые чашки и осторожно упаривают при перемешивании на плитке с асбестовой сеткой досуха. В одну из чашек контроль добавляют 0 5 мл 0 2% раствора углекислого натрия перемешивают и упаривают досуха. После охлаждения в обе чашки приливают по 0 45 мл раствора НБД-хлорида тщательно перемешивают стеклянной палочкой и сливают в пробирки. В пробирки добавляют по 0 05 мл раствора кислого углекислого натрия перемешивают закрывают пробками и выдерживают в сушильном шкафу при темпиратуре 65+ -5 град.С в течение часа. Приготовление стандартов. Исходный раствор I : навески диметиламина - 0 61 г с учетом процентного содержания в растворе диэтиламина - 0 72 г пиперидина - 0 75 пироллидина - 0 71 г и дибутиламина - 0 82 г количественно переносят в мерную колбу на 1 л и доводят до метки раствором соляной кислоты в воде. Концентация аминов в исходном растворе эквывалентна содержанию соответствующих НА 1 мг/мл. При приготовлении исходного раствора допускается использование вместо навесок точно отмеренных объемов: диметиламин - с учетом процентной концентрации раствора диэтиламин - 0 51 мл пиперидин - 0 64 мл пироллидин - 0 61 мл дибутиламин - 0 60 мл. В зависимости от поставленной задачи номенклатура аминов в исходном растворе может варьироваться в частности соответвующие редко встречающимся в отечественных продуктах НПир и НДБА амины могут быть опущены. Эталонный раствор II готовят разбавлением раствора I в 10 раз 0 1 мг/мл в расчете на НА ; эталонный раствор III готовят разбавлением раствора II в 2 раза 0 05 мг/мл в расчете на НА ; эталонный раствор IV готовят разбавлением раствора III в 5 раз 0 01 мг/мл в расчете на НА . В три пробирки наливают по 0 45 мл раствора НБД-хлорида по 5 мкл эталонных растворов II III и IV и по 0 05 мл раствора кислого углекислого натрия и выдерживают при 65+ -5 град.С вместе с опытными и контрольными пробами. Содержание аминов в стандартах в пересчете на НА составляет 1 0 5 и 0 1 мг/мкл соответсвенно. Все стандартные растворы хранят в холодильнике в герметичных стеклянных сосудах. Срок годности исходного раствора до з месяцев а эталонных растворов - до 15 дней. 4. ТСХ разделение идентификация и определение содержания НА в исследуемом образце. На пластинку на линию старта 1 5-2 0 см от края пластинки наносят по 10-20 мкл опытных конрольных и стандартных образцов таким образом чтобы расстояние между пятнами было не менее 1 см а от краев пластинки 1 5-2 см. Пластинку подсушивают на воздухе помещают в камеру в которую предварительно заливают смесь хлороформ-бензол-этилацетат-уксусная кислота 18:10:3:0 5 с таким расчетом чтобы высота слоя жидкости не превышала 1 см и закрывают крышкой. Хроматографию заканчивают когда фронт растворителя достигнет заранее отмеченной высоты 1-2 см от верхнего края пластинки . Длина пробега растворителя должна быть не менее 9-10 см. Пластинку вынимают подсушивают на воздухе рассматривают в видимом свете а затем в темной комнате в УФ свете. Сравнивают интенсивности окрасок и флуоресценции стандартных опытных и контрольных пятен с одинаковыми значениями Rf. Содержание НА в прдукте рассчитывают по формуле: К х n С = 1000 ----- где V х M С - содержание НА в продукте в мкг/кг; n - содержание НА в пятне в мг; V - объем пробы нанесенный на пластину в мкл; М - масса образца взятая для анализа в г; К - коэффициент учитывающий полноту извлечения НА из пищевых продуктов в разных НДМА - 1 28; НДЭА - 1 16; НДБА - 1 20; НПип - 1 49; НПир - 1 40. В случае необходимости точного количественного определения НА в пищевых продуктах пятна опытных контрольных и стандартных образцов с одинаковым значениями Rf соскребывает с пластинки элюируют бензолом центрифугируют элюаты и измеряют их флуоресценцию при лямбда возбуждении = 470 нм и лямбда флуоресценции = 520 нм. Как правило при измерении флуоресценции используют один стандарт наиболее близкий к опыту. При флуориметрическом определении содержание НА в продукте рассчитывают по формуле: К х N [Hоп. - Нконтр.] С = 1000 х ---------------------- х мкг/кг где Нст. х V х М N - количество НА рассчитаное в элюате пятна стандарта в нг; Нст. Ноп. и Нконтр. - показания прибора при измерении интенсивности флуоресценции элюатов пятен стандарта опыта и контроля в относительных единицах; V - объем пробы нанесенный на пластину в мкл; М - масса образца взятая для анализов в г; К - коэффициент учитывающий полноту извлечения НА из пищевых продуктов и равных для НДМА - 1 28; НДЭА - 1 16; НДБА - 1 20; НПип - 1 49; НПир - 1 40. Таблица Материалы характеризующие содержание НА в ряде отечественных и зарубежных продуктов в мгк/кг Продукты НДМА НДЭА НПип Летуч.НА НДМА НДЭА НДБА НПир НПип отечественные данные зарубежные данные мясо свежее и свежеморо- женное не обнаружено не обнаружено мясо жаренное 0-4 0-4 0-1 1 0-19 0-8 мясо копченое 0-8 0-7 0-1 0-1 0-2 сосиски 0-5 6 0-2 3 0-1 7 0-84 0-7 0-40 0-50 колбасы варенные чайнная отде- льная докторс- кая и др. 0-5 4 0-6 1 0-2 6 хлеб мясной 0-3 9 0-2 9 0-2 0 0-12 0-16 0-18 0-50 колбасы полу- копченые кра- ковская украи- ская и др. 0-13 0-5 2 0-3 8 колбасы свинные 0-12 0-11 0-58 0-15 0-5 0-33 колбасы свин- ные со специя- ми 0-80 0-80 0-1600 колбасы сыро- капченые там- бовская сове- тская салями 0-5 5 0-5 1 0-3 7 0-80 0-0 3 0-3 9 0-4 3 0-0 4 ветчина окорок 0-2 6 0-1 5 0-2 4 0-6 0-2 8 0-0 7 0-20 0-12 бекон 0-30 0-13 0-40 бекон жареный 0-30 0-4 3 0-1 5 0-207 0-8 2 консервы мясные 0-45 0-105 0-60 рыба свежая 0-5 0-9 0-4 0-3 рыба жареная и печеная 0-10 0-18 следы рыба холодного копчения 0-4 0-2 0-54 0-22 рыба горячего копчения 0-22 0-4 0-75 0-10 0-4 консервы рыбные 0-12 0-25 0-3 рыбная мука 5-2000 0-36 икра черная 0-10 морские про- дукты кревет- ки гребешок и др. 0-12 0-37 молоко не обнаружено 0-3 сыры разные 0-3 0-2 0-4 0-2 0-1 зерновые не обнаружено 0-2 фрукты разные не обнаружено яблоки 0-1 0-2 овощи свежие и вареные не обнаружено свекла после хранения 0-1 5 0-5 шпинат после хранения 0-500 0-100 0-5 бобы соевые 0-20 0-19 соления 0-63 0-19