МВ 1.1.5-121-2005

МВ 1.1.5-121-2005 Обґрунтування гранично допустимих концентрацій лікарських засобів у повітрі робочої зони і в атмосферному повітрі населених місць. Методичні вказівки

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ Н А К А З 21/10/2005 Київ № 544 Про затвердження методичних вказівок “Обґрунтування гранично допустимих концентрацій лікарських засобів у повітрі робочої зони і в атмосферному повітрі населених місць” На виконання вимог статті 9 Закону України “Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення” та з метою науково-методичного забезпечення діяльності державної санітарно-епідеміологічної служби з питань проведення гігієнічної регламентації небезпечних факторів НАКАЗУЮ: 1. Затвердити методичні вказівки “Обґрунтування гранично допустимих концентрацій лікарських засобів у повітрі робочої зони і в атмосферному повітрі населених місць” додаються . 2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров’я України методичні вказівки довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби міністерств інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку. 3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров’я України Пономаренка А.М. Заступник Міністра С.П. Бережнов Директор Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду А.М. Пономаренко В.о. начальника Юридичного управління О.П. Ковальчук Начальник Управління справами О.В. Білий Реєстр розсилки: До справи – 1 ДДСЕН – 1 Виконавець: Омельчук 2539484 ЗАТВЕРДЖЕНО наказ МОЗ України “ 21” 10 2005 р. № 544 МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ “Обґрунтування гранично допустимих концентрацій лікарських засобів у повітрі робочої зони і в атмосферному повітрі населених місць” 1. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ 1.1. Методичні вказівки призначені для органів установ та закладів державної санітарно-епідеміологічної служби МОЗ України та установ і організацій які акредитовані на право проведення робіт в галузі гігієнічного нормування лікарських препаратів у повітрі робочої зони і в атмосферному повітрі населених місць - при обґрунтуванні та апробації гігієнічних нормативів. Методичні вказівки підготовлені за результатами узагальнення багаторічного досвіду з гігієнічного регламентування лікарських засобів далі - ЛЗ у повітрі робочої зони і в атмосферному повітрі та уніфікації вимог і методів токсиколого-гігієнічної оцінки ЛЗ. 1.2. Принципові підходи до гігієнічного нормування ЛЗ у повітрі робочої зони та в атмосферному повітрі не відрізняються від загальноприйнятої методології встановлення гранично допустимої концентрації далі - ГДК шкідливих речовин. Разом з тим вони мають свої особливості обумовлені не тільки специфічними властивостями даної групи речовин але й умовами промислового виробництва невеликий об’єм виробничої продукції її висока вартість періодичність виробництва і т. і. . 1.3. ГДК ЛЗ для повітря робочої зони встановлюється для тих речовин річний об’єм виробництва яких складає не менше 50 кг на рік а в виробничому процесі бере участь не менш ніж 10 чоловік. В інших випадках встановлюється орієнтовний безпечний рівень впливу далі - ОБРВ ЛЗ в повітрі робочої зони. 1.4. Що стосується розробки ГДК ЛЗ в атмосферному повітрі то слід зазначити що в ряді випадків очевидна недоцільність їх гігієнічного нормування. Це в першу чергу стосується тих препаратів виробництво яких здійснюється періодично 2-3 міс. в рік і річний об’єм їх виробництва складає не більше 200 кг на рік. Для цих речовин встановлюється ОБРВ. 2. ОСОБЛИВОСТІ НОРМУВАННЯ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ Для хіміко-фармацевтичних підприємств характерні невеликий обсяг випуску кінцевих продуктів широка номенклатура ЛЗ і проміжних продуктів синтезу переривчастий та багатостадійний характер технологічних процесів періодичність річного виробництва невелика тривалість завершальних стадій отримання ЛЗ. Промисловому випуску ЛЗ передують різнобічні дослідження біологічної активності і токсичних властивостей в дослідах на тваринах при доклінічному вивченні ЛЗ. Це дозволяє в деяких випадках суттєво скоротити обсяг токсикологічних досліджень по обґрунтуванню гігієнічних нормативів а також використовувати результати доклінічних експериментів. При виробництві готових лікарських форм в тому числі і комбінованих гігієнічному нормуванню підлягають як субстанції усіх ЛЗ що входять у комбінацію так і допоміжні речовини наповнювачі емульгатори підсолоджувачі та ін. . При вивченні та обґрунтуванні гігієнічних регламентів ЛЗ необхідно враховувати наступне: - вибірковість фармакологічної дії; - діапазон фармакологічних ефектів та величин терапевтичних доз: від сотих часток мг естрогени та деякі гормони серцеві глікозиди до десятків грам діуретини ; - можливість розвитку віддалених ефектів вплив на синтез ДНК РНК генеративну функцію здатність викликати у людини психічну та фізичну залежність ; - великі розбіжності в обсязі виробництва від декількох кг до десятків тонн на рік ; - переважний агрегатний стан ЛЗ в повітрі робочої зони та атмосферному повітрі у вигляді дрібнодисперсних аерозолів. 2.1. Вибір адекватних методів для токсикологічних досліджень повинен включати таку інформацію: - відомості про фізико-хімічні властивості ЛЗ умови його виробництва фармакологічну активність; - особливості механізму дії та специфічна активність; - протипоказання та побічна дія ЛЗ; - рівні мінімально допустимих разових доз далі - МДРД мінімально допустимих терапевтичних доз далі - МДТД вищих допустимих разових доз далі - ВДРД та вищих добових терапевтичних доз далі - ВДТД . 2.2. ОБРВ обґрунтовується шляхом застосування параметрів токсикометрії терапевтичних доз фізико-хімічних констант а також шляхом інтерполяції та екстраполяції в рядах сполук що близькі за хімічною структурою фізико-хімічними властивостями та характером біологічної дії. ОБРВ встановлюється на період що передує проектуванню виробництва. Одночасно з обґрунтуванням нормативу розробляються методи контролю ЛЗ в повітрі робочої зони або в атмосферному повітрі. 3. ПРИНЦИПОВА СХЕМА ДОСЛІДЖЕННЯ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ 3.1. При визначенні токсикологічних параметрів речовин що нормуються в повітрі для щоденної експозиції протягом кількох місяців необхідні великі їх витрати для створення певних концентрацій в повітряному середовищі затравочних камер. Іноді для дослідження з метою гігієнічного нормування ЛЗ необхідні кількості препарату які значно перевищують об’єм їх виробництва. Враховуючи це а також високу вартість ЛЗ в порівнянні з іншими продуктами хіміко-фармацевтичної і біотехнологічної промисловості складність в забезпеченні заданої концентрації аерозолю ЛЗ доцільно враховуючи особливості біологічної дії по-перше проводити тільки субхронічні експерименти по-друге використовувати метод інтраназальних інсталяцій з подальшим перерахуванням дози яка вводиться експериментальним тваринам на концентрацію ЛЗ в повітрі що вдихається. 3.2. Прояви професійної патології робітників зайнятих виробництвом ЛЗ в цілому повторюють побічні реакції що спостерігаються в клінічних умовах при контактному пероральному і інгаляційному застосуванні ЛЗ з лікарською метою. В більшості випадків вони зводяться до явищ пов’язаних з алергічними і токсичними реакціями та дисбіотичним ефектом. Тому в принципову схему досліджень по гігієнічному обґрунтуванню ГДК ЛЗ обов’язково включається вивчення цих типів біологічної дії. 4. СПОСОБИ ЗАТРАВЛЕННЯ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ТВАРИН 4.1. Інгаляційний шлях надходження лікарських засобів Затравлення експериментальних тварин щури в умовах інгаляційного надходження ЛЗ традиційно здійснюється в спеціальних затравочних камерах. Для ЛЗ кількість яких дозволяє використовувати такий спосіб введення щоденна експозиція складає для щурів 4 години. При такому способі затравлення необхідно дотримуватись рівномірної подачі чистого повітря та речовини ЛЗ від дозуючого пристрою створення необхідного повітрообміну контролю за концентраціями ЛЗ в повітрі затравочної камери. За цих умов проводять визначення порогу гострої дії Limac та порогу хронічної дії Limch . При необхідності визначають пороги специфічної дії Limsp . У всіх інших випадках коли кількість та/або вартість ЛЗ не дозволяє мати необхідну масу речовини для дослідження в інгаляційних камерах можна використовувати альтернативні методи введення ЛЗ напр. інтраназальний інтратрахеальний . 4.2. Інтраназальний спосіб введення лікарських засобів 4.2.1. При інтраназальному моделюванні інгаляційного шляху надходження препарату забезпечується точне дозування надходження його в організм. Для введення використовується суспензія ЛЗ в стерильному фізіологічному розчині або в стерильній водопровідній воді. Суспензія вводиться піддослідним тваринам за допомогою піпетки з тупим кінцем під легким ефірним наркозом: мишам в кількості 0 007-0 05мл щурам - 0 05 - 0 25 мл. Легкий ефірний наркоз та визначені об’єми для введення ЛЗ не призводять до його попадання в ротову порожнину. 4.2.2. Перерахування введеної дози на концентрацію ЛЗ в повітрі що вдихається здійснюється за формулою: D ? K ? V де 1 K - концентрація препарату мг/м3 ; D - доза препарату мг введена тварині; V - об’єм повітря що вдихається м3 ; Величина об’єму повітря що вдихається V визначається як добуток легеневої вентиляції для даного виду тварин на масу тіла і терміну інгаляції 2 години для мишей і 4 години для щурів при визначенні параметрів гострої дії; 4 години впродовж 2-4 місяців для обгрунтування ГДК ЛЗ у повітрі робочої зони і 24 години впродовж 2-4 місяців для обгрунтування ГДК ЛЗ в атмосферному повітрі населених місць . Показники легеневої вентиляції в см3/г/хв складають: для мишей - 1 24 щурів - 0 65 морських свинок - 0 33. Приклади розрахунків величини легеневої вентиляції при введенні ЛЗ білим щурам масою 200 г: Фіксоване значення величини легеневої вентиляції впродовж 4-х-годинної експозиції складає: V 4год ? 0 65см3/г/хв ? 200 г ? 240 хв ? 0 0312м3 1000000 перерахування в м3 Фіксоване значення величини легеневої вентиляції впродовж 24-годинної експозиції: V 24год. ? 0 65 см3/г/хв ? 200 г ? 1440 хв ? 0 1872 м3 1000000 4.2.3. Приклад розрахунку дози введеного інтраназально ЛЗ щурам для умов що відповідають вимогам до проведення експерименту для повітря робочої зони: К ? 10 мг/м3 V ? 0 0312 м3 D ? 10 мг/м3 ? 0 0312 м3 ? 0 312 мг тобто щоденне інтраназальне введення тварині масою 200 г 0 312 мг препарату буде відповідати інгаляційному його надходженню при 4-годинній експозиції в концентрації 10 мг/м3. 4.2.4. Приклад розрахунку дози введеного інтраназально щурам дози ЛЗ для умов що відповідають вимогам проведення експерименту для атмосферного повітря населених місць: К ? 0 5 мг/м3 V ? 0 1872 м3 D ? 0 5 мг/м3 ? 0 1872 м3 ? 0 09 мг тобто щоденне інтраназальне введення тварині масою 200 г 0 09 мг ЛЗ буде відповідати щоденному інгаляційному його надходженню при 24-годинній експозиції в концентрації 0 5 мг/м3. 4.3. Інтратрахеальний спосіб введення лікарських засобів Препарат вводять в трахею щурів під легким ефірним наркозом за допомогою довгої голки. Для зручності використовують ЛОР-набір для огляду в який входить ЛОР-дзеркало вушна лійка. Препарат вводять у вигляді суспензії яка містить ЛЗ не більше 50 мг. Перерахунок експозиційної дози на концентрацію здійснюється так само як при інтраназальному способі введення див. розд. 4.2 . 5. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ При виборі адекватних методів і тестів для токсикологічного дослідження ЛЗ доцільно враховувати особливості нормування ЛЗ розділ 2 . При цьому необхідно розрізняти методи інтегральні які відображають загальнотоксичну дію на органи та системи і специфічні методи що обумовлені фармакологічною та побічною дією ЛЗ. Оцінку стану організму піддослідних тварин необхідно проводити в динаміці. 5.1. Вивчення загальнотоксичної дії лікарських засобів Схема токсикологічного експерименту включає: - визначення параметрів гострої токсичності; - визначення кумулятивних властивостей; - вивчення місцевої дії на шкіру і слизову оболонку ока; - визначення параметрів субхронічної токсичності; - вивчення віддалених наслідків ембріотоксичність тератогенність мутагенність канцерогенність . 5.1.1. Визначення параметрів гострої дії Визначення LD50 і СL50 проводять при введенні ЛЗ в шлунок і інтраназально лабораторним тваринам молодого віку обох статей білим мишам масою 16-18 г білим щурам - 160-180 г. Ознаки інтоксикації при одноразовому введені ЛЗ в залежності від шляху введення розвиваються як правило впродовж перших 1-2 діб тому спостереження за станом тварин можна обмежити 1 тижнем. Встановлення порогу гострої загальнотоксичної дії проводиться на білих щурах. Критеріями загальнотоксичної дії є інтегральні показники і показники які характеризують стан окремих органів і систем. Вибір останніх визначається за результатами доклінічного вивчення досліджуваного препарату. 5.1.2. Вивчення кумулятивних властивостей Найбільш поширені методи оцінки кумуляції в токсиколого-гігієнічних дослідженнях базуються на визначенні усередненої сумарної кількості речовини мг/кг яку отримали тварини в підгострому досліді до появи визначеного ефекту найчастіше - летального кінця і співставленні цієї кількості з однократною середньою ефективною дозою DE50 зокрема - ЛД50 . При цьому розраховують коефіцієнт кумуляції Кk. 5.1.2.1. Загальноприйнятим у вітчизняній токсикології і фармакології методом оцінки кумулятивних властивостей речовини і препаратів є метод розроблений Ю.С. Каганом і В.В. Станкевічем 1964 р. [1]. За цим методом коефіцієнт кумуляції Кk розраховують як співвідношення ДЕ50 n до ДЕ50 де ДЕ50 n - сумарна середньо ефективна летальна доза в підгострому досліді при введенні речовини n разів рівними разовими дозами Дp через рівні проміжки часу - 1 добу. Достатньо протягом 2 місяців випробувати 3 дози які складають 1/5 1/10 1/20 від ДЕ50. Якщо ефект що реєструється - летальний кінець - формула буде такою: ДЕ50 n Кk = ---------- 2 ДЕ50 Із зменшенням дози Дp величина Кk для різних речовин змінюється по різному: збільшується; не змінюється; знижується або змінюється двофазно - спочатку знижується потім збільшується. При цьому найбільш небезпечними є речовини 3-го типу найменше - 1-го типу. Для багатьох лікарських речовин неможливо точно визначити рівень ЛД50 в зв’язку з їх малою токсичністю. Тому необхідно провести відповідні біохімічні фізіологічні і морфологічні дослідження які при можливості завершити розрахунком Кk. 5.1.2.2. Вивчення кумулятивних властивостей фармакологічних субстанцій і лікарських препаратів для яких неможливо визначити середньо смертельну дозу відбувається при субхронічних і хронічних випробуваннях з використанням як правило умовно терапевтичної дози мінімальна дози яка не менше ніж у 10 разів вища від умовно терапевтичної можливо - токсична та проміжної між мінімальною та максимальною. Шлях введення речовини повинен співпадати або бути близьким до реального що відповідає клінічній практиці . Коефіцієнт кумуляції більше 5 вказує на відносно слабо виражену дію речовини від 3 до 5 - на середній ступень кумуляції від 1 до 3 - на виражений ступінь кумуляції а величина коефіцієнта кумуляції яка менше 1 - свідчить про наявність суперкумулятивних властивостей. 5.1.2.3. Орієнтовний мінімум інформації можна одержати в гострих дослідах - шляхом визначення індексу кумуляції. Для цього розраховують значення ДЕ50 1 - за результатами спостереження загибелі тварин в першу добу після введення речовини а також ДЕ50 14 - за результатами загибелі тварин за 14 діб спостереження після одноразового введення речовини. Ік - індекс кумуляції розраховують за формулою: ДЕ50 14 Ік = ------------- 3 ДЕ50 1 Вважається що коли ДЕ50 1 і ДЕ50 14 співпадають тобто Ік дорівнює 0 - кумуляція не виражена. Чим ближче Ік до 1 тобто чим пізніше відбувається загибель тварин - тим більше вірогідність наявності кумулятивних властивостей у речовини. 5.1.2.4. В гігієнічній практиці іноді Кk розраховують за результатами тесту субхронічної токсичності по схемі Lim et al. в модифікації К.К.Сидорова. Для цього в підгострому досліді тривалістю 28 днів 24 + 4 реєструють загибель тварин при введенні речовини наростаючими разовими дозами з інтервалом в 1 добу. В перші 4 доби доза становить 1/10 ЛД50. В кожні 4 наступні дні дозу збільшують у півтори рази. Коефіцієнт кумуляції розраховують за тією ж формулою що в методі Кагана-Станкевіча. Вважають що Кk 1 вказує на кумуляцію Кk1 - на підвищення резистентності tolerance організму. 5.1.3. Вивчення подразнюючої дії лікарських засобів на шкіру і слизову оболонку ока 5.1.3.1. Вивчення місцевої подразнюючої дії і резорбції речовин через непошкоджену шкіру проводиться у відповідності з методичними вказівками “Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно-допустимых уровней загрязнений кожи” МЗ СССР № 2102-79 от 01.12.1979 . 5.1.3.2. Для досліджень подразнюючої дії на слизову оболонку ока використовують кролів. В кон’юнктивальний мішок ока одноразово закапують 1 краплю суспензії ЛЗ або вносять 50 мг ЛЗ у нативному вигляді.. Облік ефекту проводять впродовж двох діб згідно з бальною шкалою за M. Majda і K.Chrusaielska: А. Гіперемія кон’юнктиви і рогівки: бали 1. - судини ін’єкційовані - 1 2. - окремі судини важко розрізнити - 2 3. - дифузне глибоке почервоніння - 3 Б. Набряк вій: бали 1. - слабкий набряк - 1 2. - виражений набряк з частково вивернутими віями - 2 3. - внаслідок набряку око закрите наполовину - 3 4. - внаслідок набряку око закрите повністю - 4 В. Виділення бали 1. - мінімальна кількість виділень - 1 2. - кількість виділень зволожує - 2 3. - кількість виділень зволожує віки і навколишню шкіру - 3 При різко виражених пошкодженнях ока сумарна кількість балів дорівнює 10. 5.2. Вивчення впливу лікарських засобів на імунну систему Оцінка впливу ЛЗ на імунну систему здійснюється у відповідності до вимог щодо постановки досліджень по обґрунтуванню ГДК промислових хімічних алергенів у повітрі робочої зони та в атмосферному повітрі і рекомендацій по оцінці алергенних властивостей фармакологічних засобів. При вивченні дії ЛЗ на імунну систему можливе використання різних показників які дозволяють оцінити стан неспецифічної резистентності організму виявити розвиток сенсибілізації піддослідних тварин. Рекомендується використовувати шкіряні провокаційні проби та лабораторні специфічні алерготести in vitro. Ці методи дозволяють виявити алергічні реакції різного типу: уповільненого провокаційні проби реакція гальмування розпластування макрофагів тощо негайного реагінового типу реакція дегрануляції базофільних гранулоцитів та опосередкованого імунними комплексами тести з нейтрофільними гранулоцитами . Можливе використання різноманітних методів досліджень як специфічних так і неспецифічних які свідчать про розвиток сенсибілізації піддослідних тварин. 5.2.1. Провокаційна проба опухання вуха Постановка цього тесту можлива на різних видах тварин. Для проведення тесту опухання вуха ТОВ необхідно здійснити підбір тестової концентрації ЛЗ на інтактних тваринах морських свинках . Розчинником може бути вода 700 спирт оцет. На контрольне вухо наносять якщо його застосовують розріджувач. Облік реакції здійснюють через 24 години. Тестова доза – максимальна яка не викликає подразнення нативний ЛЗ або від 0 1 до 20% . Перед проведенням тесту роблять заміри вушної раковини. На обидві поверхні вуха наносять по 25 мкл ЛЗ в робочій концентрації. Заміри товщини вуха здійснюють через 24 години і розраховують показник ТОВ по різниці товщини до і після аплікації. У морських свинок та щурів тест позитивний при показнику 0 03 мм та більше у миші – 0 01 мм та більше. Шкала для морських свинок: 0 балів – до 0 03 мм 1 бал – 0 03-0 07 мм 2 бала – 0 08 – 0 12 мм 3 бала – 0 13-0 17 мм 4 бала – 0 18-0 22 мм 5 балів – 0 23 мм та більше. 5.2.2. Проведення шкіряних проб ЛЗ розчиняється в фізрозчині 0 05-0 1 мл вводиться в оброблену спиртом шкіру зовнішньої поверхні вуха морської свинки за допомогою туберкулінового шприця. При цьому голку треба виймати зигзагоподібно щоб не було втрати речовини. Облік реакції - через 20 хв. для виявлення алергії негайного типу і через 24-48 год. для виявлення алергії повільного типу. Позитивна реакція виражається в появі на місці введення речовини почервоніння припухлості. 5.2.3. Визначення бактерицидної активності сироватки крові Реакція грунтується на здатності сироватки крові подавляти ріст мікроорганізмів що залежить від рівня нормальних антитіл пропердіну комплементу і ін. Реакція проводиться в стерильних умовах при температурі ?370С з різними розведеннями сироватки до яких додається певна доза тест-мікроорганізмів - Staphylococcus aureus № 209. З добової культури стафілококів розведеної стерильним фізрозчином до 1 млрд клітин в 1 мл за стандартом мутності готують десятикратні розведення таким чином щоб кінцеве розведення склало 1 тис. мікробних клітин робоча концентрація . Готують 2-кратне розведення сироватки тварин 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 і 1:64. Мікропіпеткою починаючи з розведення 1:64 наносять на знежирене предметне скло справа наліво по 0 2 мл розведену сироватку. До кожної краплі сироватки добавляють культуру стафілококу по 0 02 мл. Препарати розташовують в чашки Петрі які в свою чергу ставлять в ексикаторі щоб не висихали і поміщують в термостат на 1 добу при ? 370С. На наступну добу висівають кожну краплю на заздалегідь приготовлені чашки Петрі з агаром і ставлять в термостат на 1 добу. Враховують те розведення сироватки де немає росту стафілококів. Бактерицидна активність дорівнює чисельному значенню результату від ділення зворотної величини розведення на об’єм сироватки. Наприклад при розведенні сироватки 1:64 немає росту. Бактерицидна активність дорівнює 16:0 02?800 одиниць. 5.2.4. Реакція гальмування розпластування макрофагів РГРМ Метод дає можливість одночасно визнати функціональну активність макрофагів та вивчити стан алергізації організму при розвитку гіперчутливості уповільненого типу далі - ГУТ . Для отримання перитонеального ексудату в черевну порожнину морської свинки вводять 12-15 мл рідини 199 яка містить 20% сироватки крупної рогатої худоби і 5 од./мл гепарину. Через 1-2 хв. забирають ексудат в стерильний посуд. По 0 25 мл перитонеального ексудату вносять в пробірки додають 0 20 мл сироватки дослідної тварини закривають пробкою та витримують в термостаті 30 хв. при 370С. Контрольні дослідження здійснюють з середовищем 199 сироваткою дослідної тварини ЛЗ додаючи у пробірки тільки один з цих компонентів. Доводять об’єм вмісту контрольних пробірок до об’єму дослідних додаючи середовище 199. Вміст кожної пробірки перемішують піпетіруванням та заповнюють камеру Горєва яку поміщають в чашках Петрі в термостат на 30 хв. при 370С. У кожній пробі підраховують кількість розпластаних макрофагів на 100 клітин. Визначають середній відсоток їх в досліді та контролі. Вираховують індекс гальмування: відношення середнього відсотка розпластаних макрофагів в досліді до середнього відсотка розпластання у контролі множене на 100. При розвитку ГУТ індекс буде менший 0 8. 5.2.5. Реакція дегрануляції базофільних гранулоцитів тест Шеллі Тест можна здійснювати на морських свинках і щурах у яких вміст базофілів дуже низький. Для отримання базофілів з крайової вени вуха кролика забирають 1 5 мл крові у відалевську пробірку де вже знаходиться 0 05 мл лимоннокислого натрію. Центрифугують протягом 10 хв. при 1000 об./хв. та знімають лейкоцитарну плівку. Підбір концентрації ЛЗ антигену що не діє цитотоксично здійснюється шляхом постановки серії аналізів з клітинами інтактної тварини. Робоча доза не повинна змінювати спонтанного рівня реактивності клітин – агломерації дегрануляції ступеня міграції тощо. Перед постановкою реакції готують контроль сироватки та антигену. На предметне скло заздалегідь пофарбоване 0 3% нейтральротом на абсолютному спирті наносять краплю лейкоцитарної плівки дослідної сироватки та краплю фізіологічного розчину. Краплю обережно змішують та накривають покривним склом. Суміш на склі впродовж 15 хв. витримують в термостаті при 370С після чого підраховують 20 базофілів під імерсійною системою мікроскопу. Якщо відсоток дегрануляції більше 10% то сироватку необхідно розвести доки дегрануляції не буде менше 10%. Контроль антигену здійснюється як і контроль сироватки але замість краплі сироватки наносять краплю ЛЗ антигену . Постановка досліду: на профарбоване нейтральротом скло наносять 3 краплі: лейкоцитарну плівку ЛЗ алерген та дослідну сироватку. Далі все проводять як і при проведенні контролю. Реакція вважається позитивною якщо відсоток дегранульованих базофілів вище 10%. 5.2.6. Реакція специфічного пошкодження нейтрофілів В реакції визначення показника пошкодження нейтрофілів далі - ППН застосовується антикоагулянт – 5% водний розчин цитрату натрію або 1 5% розчин ЕДТА Хелатон-3 який готується на фізіологічному розчині. Робочу концентрацію ЛЗ готують на коагулянті який додають до крові. Робоча концентрація не повинна призводити до пошкодження більш ніж 4% нейтрофілів інтактних тварин. В першу силіконову пробірку дослідна додають 0 1- 0 2 мл розчину досліджуваного ЛЗ в робочій концентрації в другу контрольна – той самий об’єм антикоагулянту. В обидві пробірки додають той же об’єм крові піддослідної тварини перемішують і впродовж 1 години витримують при кімнатній температурі. Потім з обох пробірок на предметному склі готують мазок фіксують його фарбують методом який застосовують при фарбуванні мазків лейкоцитарної формули. Під імерсією підраховують 100 нейтрофілів враховуючи кількість клітин з чітким хроматинолізом пікнозом фрагментацією ядер гіперхроматозом чи каріолізисом. ППН рахується діленням на 100 різниці кількості пошкоджених нейтрофілів в дослідній та контрольних пробах. ППН 0 05 та більше свідчить про розвиток сенсибілізації тварини. 5.2.7. Визначення фагоцитарної активності лейкоцитів У відалівську пробірку наливають 0 1 мл 2% лимоннокислого натрію 0 2 мл досліджуваної крові і 0 1 мл мікроорганізмів 108 клітин/мл - Staphylococcus aureus № 209. Всі компоненти ретельно змішують і пробірку розташовують на 30 хв. в термостат ?370С . Після інкубації центрифугують впродовж 3 хв. при 1000 об/хв. потім із верхнього шару готують мазки фіксують їх сумішшю Нікіфорова і фарбують за Романовським-Гімза. Під мікроскопом розглядають 100 лейкоцитів нейтрофілів і підраховують процент фагоцитуючих лейкоцитів тобто кількість лейкоцитів із 100 що виявили фагоцитарну активність. 5.2.8. Визначення антитіл до еритроцитів барану Щурам дослідної і контрольної групи вводять внутрішньоочеревинно 0 5 мл 50% суспензії еритроцитів барану. На 7 14 21 28 добу після введення еритроцитів із хвостової вени тварин в пробірку вносять по 0 5-1 мл крові. Пробірки розміщують в термостаті при ?370С на 20 хв. потім переносять в холодильник при ?40С на 18 год. після чого пастерівською піпеткою відбирають сироватки підігрівають їх при ?560С впродовж 20 хв. на водяній бані а далі розводять двічі фізрозчином - 1:4 1:8 і т. д. в об’ємі 0 25-0 5 мл на планшетах. До розведених сироваток добавляють 0 1 мл 2% суспензії еритроцитів барану струшують і витримують при кімнатній температурі. Попередній облік результатів реакції проводять через 2 год. а остаточний - через 18-24 год. При позитивній реакції мереживоподібний осад еритроцитів у вигляді тонкої плівки з неправильними хвилястими краями перевернута парасолька розподіляється рівномірним шаром по дну. При негативній реакції еритроцити осідають у формі компактного невеликого диску або обручки з рівними краями. Результати реакції виражають в умовних одиницях титру - по найбільшому розведенню сироватки що дає позитивну реакцію тобто повну аглютинацію 0 1 мл 2%-ної суспензії еритроцитів барана. Зменшення титру антитіл свідчить про пригнічення дії препарату на гуморальну ланку імунної відповіді. Збільшення титру свідчить про стимулюючу дію. 5.3. Вивчення дії лікарських засобів на мікрофлору організму дисбіотична дія Мікроорганізм і його мікрофлора аутофлора знаходяться в постійній взаємодії і зв’язку. Будь-які зміни в організмі хазяїна під впливом тих чи інших факторів неминуче відображаються на її взаємодії зі своєю мікробною флорою викликаючи її порушення - дисбактеріоз дисбіоз . Із чисельних мікробіотів організму найважливішу роль відіграє мікрофлора кишечника. Вона має антагоністичні властивості по відношенню до патогенної флори вітамінізуючі ферментативні властивості бере участь в створенні загального імунітету. Зважаючи на багатоманітність фізіологічних функцій мікрофлора кишечнику розглядається зараз як найважливіший елемент гомеостазу. Тому при визначенні пошкоджуючої дії ЛЗ на аутофлору організму в якості тест-об’єкта використовується мікрофлора товстого кишечника. Критерієм дисбактеріозу можуть слугувати зміни порівняно з контрольною групою кількісного і якісного складу мікрофлори товстого кишечника дослідних тварин. При цьому використовують такі тест-культури мікроорганізмів: кишкова паличка посів на середовище Ендо ентерококи посів на азидовий агар або середовище з тетраетилтетразолій-хлоридом далі - ТТХ гриби на середовище Сабуро гемолітичні бактерії на 5%-ний кров’яний агар . Цей етап досліджень є обов’язковим при нормуванні ЛЗ з груп антибіотиків бактерицидних і т.п. ЛЗ. В інших випадках – на розгляд авторів. 5.3.1. Визначення порогу дисбіотичної дії 5.3.1.1. Мікробіологічне дослідження тварин проводиться в субхронічному експерименті в динаміці: до початку затравки тварин фон на 2-му і 4-му тижнях затравочного періоду через 2 і 4 місяці від початку затравки і через 1 місяць після закінчення затравки період відновлення . 5.3.1.2. Всі посіви інкубують 24-48 год. при 370C. Визначають кількість мікроорганізмів в 1 г фекалій. Для посіву використовують 10-кратні розведення фекалій в фізіологічному розчині. Критерієм дисбактеріозу слугують зміни кількісного і якісного складу мікрофлори товстого кишечнику дослідних тварин в порівнянні з контрольною групою. 5.3.1.3. Якщо показники кількісного складу мікрофлори більш ніж по 2-м групам мікроорганізмів відрізняються від контролю але після періоду відновлення ці зміни зникають то дисбіотична дія оцінюється як помірно виражена. При гігієнічному нормуванні дозу чи концентрацію ЛЗ що викликає дисбактеріоз слід вважати порогом дисбіотичної дії. 5.3.1.4. Якщо показники кількісного складу мікрофлори кишечнику дослідних тварин відрізняються від контролю хоча б по одній із дослідних груп але зміни не зникають після відновного періоду то це розглядається як сильна дисбіотична дія. Доза або концентрація яка обумовила сильну дисбіотичну дію вважається діючою за цим ефектом. 5.4. Визначення віддалених наслідків дії лікарських засобів 5.4.1. При необхідності оцінки дії ЛЗ на генеративну функцію особливо ЛЗ призначених для вагітних жінок дослідження проводяться згідно з методичними рекомендаціями “Методы экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования” М. МЗ СССР № 1744 -77 . 5.4.2. Визначення мутагенних властивостей ЛЗ проводиться згідно “Методичних рекомендацій з оцінки мутагенних властивостей нових лікарських засобів” Київ 1996 - Фармакологічний комітет МЗ України вивчення ембріотоксичності і гонадотоксичності згідно “Методичних рекомендацій по експериментальному вивченню ембріотоксичної активності лікарських препаратів” Київ 1998 Фармкомітет МОЗ України та “Методичних рекомендацій по вивченню гонадотоксичної дії нових лікарських засобів і їх впливу на репродуктивну функцію тварин” Київ 1998 Фармкомітет МОЗ України . 6. ОБГРУНТУВАННЯ ВЕЛИЧИНИ ГДК 6.1. При встановленні ГДК ЛЗ в повітрі робочої зони необхідно виходити з порогу лімітуючого показника шкідливої дії в субхронічному експерименті див. п.п. 4.2.2 4.2.3 . При переході від порогової концентрації до ГДК в повітрі робочої зони необхідно вибрати коефіцієнт запасу. Коефіцієнт запасу повинен збільшуватись: при збільшенні абсолютної токсичності при збільшенні кумулятивних властивостей коефіцієнта кумуляції при вираженій подразнюючій дії на слизові оболонки чи шкіру при значних розбіжностях видової чутливості досліджуваних тварин. Коефіцієнт запасу не повинен бути менше 3 і не повинен перевищувати 20. 6.2. При встановленні ГДК в атмосферному повітрі також враховується порог лімітуючого показника шкідливої дії в субхронічному експерименті але виходячи з інших доз концентрацій відповідно до умов обгрунтування ГДК в атмосферному повітрі див. п.п. 4.2.2 4.2.4 . 6.3. Коефіцієнт запасу при розрахунку ГДК в атмосферному повітрі приймається рівним 100. 7. РОЗРАХУНКОВІ ТА ЕКСПРЕС-ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ МЕТОДИ ВСТАНОВЛЕННЯ ОРІЄНТОВНО БЕЗПЕЧНИХ РІВНІВ ВПЛИВУ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ У ПОВІТРІ РОБОЧОЇ ЗОНИ 7.1. Приведені нижче підходи по визначенню токсикометричних параметрів та розрахунків на їх основі тимчасових гігієнічних нормативів - ОБРВ у повітрі робочої зони стосуються серцево-судинних гормональних препаратів препаратів діючих на нервову систему а також інших ЛЗ за виключенням препаратів яким присутня алергенна дія та антимікробні властивості. 7.2. В основу розрахункових формул по визначенню параметрів середньосмертельних доз ЛЗ покладені зв’язки між цими показниками встановленими на піддослідних тваринах при різних шляхах надходження в організм: при внутрішньоочеревинному в/ч шлунковому в/ш підшкірному п/ш внутрішньовенному в/в . При цьому розрахунок DL50 в гострому експерименті при переході від одного шляху введення до іншого здійснюється згідно з формулами 4-7. lg LD50 в/ш = 0 87 1g LD50 в/ч + 0 78 4 lg LD50 в/ш - 0 77 lg LD50 п/ш + 0 77 5 lg LD50 в/ш = 0 66 1g LD50 в/в + 1 41 6 lg LD50 в/ч = 0 89 lg LD50 в/ш – 0 13 7 7.3. Необхідно відмітити що кількісне значення діапазону різниці між середньо смертельними дозами ЛЗ при різних шляхах введення у ряді випадків дозволяє орієнтовно оцінювати особливості кінетики та токсикодинаміки досліджуваної речовини. Так при відносно великій різниці у значеннях середньо смертельних доз при внутрішньошлунковому та внутрішньовенному введенні більш як в 3 рази можна передбачити що речовина руйнується або погано всмоктується в шлунково-кишковому тракті. 7.4. При визначенні інгаляційної токсичності ЛЗ можуть бути використані рівняння засновані на виявлених зв’язках між середньо смертельними концентраціями СL50 мг/л та порогами гострої дії при внутрішньочеревному та внутрішньошлунковому мг/кг надходженні: lg CL50 = 1 04 1g LD50 в/ш- 2 71 8 lg СL50 = 0 91 1g LD50 в/ч - 1 97 9 lg Limас =- 0 7 1g LD50 в/ч + 0 06 10 lg Limас = 0 91 lg LD50 в/ш - 0 63 11 lg Limас = 0 9 lg LD50 в/ш + 0 05 12 lg Limас = 1 02 lg Limac в/ш + 0 10 13 7.5. Визначення порогів гострої інгаляційної та хронічної дії ЛЗ від мінімальних значень добових терапевтичних доз МДТД в/ч та максимальних значень найбільших добових терапевтичних доз НДТД може бути здійснено з допомогою формул 14-18: lg Limас = 0 65- lg МДТД + 1 75 14 lg Limch = 0 6l Limac + 0 36 lg МДТД - 0 27 15 lg Limch = 0 82 1g Limac + 0 36 1g НДТД - 0 78 16 lg Limch = 0 71 МДТД + 0 82 17 lg Limch = 0 74 1g Limac - 0 83 1g Lіmsp - 0 46 18 7.6. Визначення порогів хронічної дії ЛЗ що знаходяться в порошковій формі визначається за формулами в основу яких покладені параметри токсикометрії: Кк- коефіцієнт кумуляції за Ю.С. Каганом при введенні 1/10 LД50; КВР - коефіцієнт видових розбіжностей формули 19 20 . lgLimch = 0 72 1gLimаc + 0 11 1gLD50 в/ш + 0 ЗЗ lgКк + 0 18 lgKBP - - 0 66 1gLimsp - 1 11 19 lgLimch = 0 59 1gLD50 в/ш + О 3LgКк + 0 31 lgKBP - 0 64 1gLimsp - 1 51 20 7.7. Розрахунок значень тимчасових гігієнічних нормативів ОБРВ мг/м3 в повітрі робочої зони далі - п.р.з. по параметрам токсикометрії та терапевтичним дозам здійснюється за формулами 21-24: lg ОБРВ п.р.з. = 0 77 lg МДТД + 0 34 21 lg ОБРВ п.р.з. = 0 8 1g HДТД - 0 068 22 lg OБРВ п.р.з. = 0 45 lg Limас + 0 5 1g MДTД - 0 43 23 lg ОБРВ п.р.з. = 0 49 1g МДТД + 0 42 1g Limас + 0 11 lg LD50 в/ш – 0 75 24 7.8. Для порошкоподібних ЛЗ найбільш надійні та вірогідні рівні прогнозованих величин ОБРВ в п.р.з. дають формули 25- 27 що враховують параметри токсикометрії : lg ОБРВ п.р.з. = 0 78 1g Limас + 0 87 1g Кк - Ig Limsp - 1 96 25 lg ОБРВ п.р.з. - 0 62 1g LD50 + 0 78 1g Кк + 0 25 1g КВР - 0 97 1g Lіmsp - 2 71 26 lg ОБРВ п.р.з. = 0 66 lg Limac + 0 18 lg LD50 + 0 78 1gКк – - lg Limsp - 2 25 27 7.9. Розрахунок ОБРВ п.р.з. ЛЗ при наявності обгрунтованої ГДК в атмосферному повітрі а.п. населених місць проводиться за формулою: lg OБРВ п.р.з. = 0 3 1g ГДКа.п+0 67 1gLimас - 0 67 28 7.10. Розрахунок ОБРВ п.р.з. ЛЗ за максимально недіючою дозою визначеною для води водоймищ МНД мг/кг проводиться за формулою: lg ОБРВ п.р.з. = 0 68 1g Limас + 0 32 МНД - 0 61 29 При використанні формули 29 слід враховувати що ГДК речовини у воді водоймищ за токсикологічної ознакою шкідливості пов’язана з МНД наступним співвідношенням: ГДК мг/л = 20 МНД мг/кг . 7.11. Орієнтовний розрахунок вірогідного значення ОБРВ п.р.з. ЛЗ може бути проведений також з використанням модифікації формули Габера: ОБРВ мг/м3 = МДТД або НДТД мг К1 /V . t . K2 30 де V –об’єм легеневої вентиляції людини м3 /год. t- час роботи на підприємстві за добу в год. . При здійсненні розрахунків похідну величину Vt слід приймати рівною 10 м3. K1 - коефіцієнт що враховує ступінь затримки аерозолю в організмі для порошкових форм ЛЗ K1 дорівнює 1 0 ; K2 - коефіцієнт що враховує критерій безпечності для працюючих та їх потомства кількісного значення переходу від МДТД або НДТД до рівня ГДК. Середнє значення К2 для раніш нормованих ЛЗ при розрахунках за МДТД становить 30; при розрахунках за НДТД – 100. Слід зазначити що величини К2 для окремих фармакологічних груп які мають специфічну вибіркову дію гормони цитостатики сульфаніламіди та інші можуть бути вище приведених значень 300-500 ?. Рівняння регресії отримані при аналізі загальної сукупності аерозолів порошкових форм рекомендується використовувати для прогнозування ОБРВ п.р.з. ЛЗ в тих випадках коли такі розрахунки по величині терапевтичної дози неможливі при переважному парентеральному шляху введення . ЛІТЕРАТУРА 1. Каган Ю.С. Красовский Г.А. Штабский Б.М. Кумулятивные свойства химических соединений их изучение и оценка //Токсикометрия химических веществ загрязняющих среду/ под редакцией А.А. Каспарова и И.В. Саноцкого. -М.: Центр международных проектов ГКНТ. - 1986. - С. 104-133. 2. Методичні вказівки “Обґрунтування орієнтовних безпечних рівнів впливу ОБРВ хімічних речовин в атмосферному повітрі населених місць” МВ 2.2.6-111-2004 затв. наказом МОЗ України від 07.10.2004 р. №485. 3. Методичні вказівки “Критерії обгрунтування необхідності і визначення черговості розробки гігієнічних нормативів шкідливих речовин у повітрі робочої зони атмосферному повітрі населених місць у воді водних об’єктів” МВ 1.1.5-109-2004 затв. наказом МОЗ України від 21.07.2004 р. №369. 4. Методичні рекомендації по доклінічному вивченню фармакокінетики лікарських засобів // Головенко М.Я. Безверха І.С. Живала В.А. Зінковський В.Г. Жуков О.В. / Київ.: МОЗ України Фармакологічний комітет - 1995 - 27 с. 5. Методичні рекомендації "Особливості ведення запобіжного та поточного санітарного нагляду за розробкою та впровадженням нормативів гранично-допустимих викидів ГДВ біологічних факторів в атмосферне повітря. МР 2.2.6.-004-98// Збірн. важл. офіційн. матеріалів з сан. і протиепідем. питань.- Київ 1998. - Т. 5 ч. 2. - С. 59. 6. Методичні рекомендації по експериментальному вивченню ембріотоксичної активності лікарських препаратів. - Київ.- Фармкомітет МОЗУ.- 1998.- 28с. 7. Методичні рекомендації з оцінки мутагенних властивостей нових лікарських засобів.- Київ.- Фармкомітет МОЗУ.- 1996.- 30с. 8. Методические указания ’’Постановка исследований по установлению допустимых концентраций антибиотиков в воздухе рабочей зоны’’ МЗ СССР М. 1989 -22 с. 9. Методические указания по установлению ориентировочных безопасных уровней воздействия вредных веществ в воздухе рабочей зоны. МЗ СССР М. 1985 - 33 с. 10. Методические указания по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды. / Москва МЗ СССР. “.1991 -21 с. 11. Новиков С.М. Тепикина Л.А. Шашкина Л.Ф. Голубева М.И. Рожнов Г.И. Методические подходы к ускоренному гигиеническому нормированию лекарственных препаратов и полупродуктов их синтеза в атмосферном воздухе.//Environment. Health - 1997- № 3. – С.23-25. 12. Омельянец Т.Г. Присяжнюк В.Е. Ганева С.Л. Методические аспекты гигиенической регламентации в воздухе продуктов микробиологического синтеза с низким их выходом из биомассы продуцента /Гигиена населенных мест. Сб. науч. ст. УНГЦ. - Киев 1998 - Вып. 33. - C. 58-63. 13. Трахтенберг И.М. Количественные критерии трактовки нормы в связи с оценкой сдвигов и нарушений при воздействии пестицидов // В кн. Проблемы гигиены и токсикологии пестицидов. - Киев: Здоровье. - 1981 ч. II. - С. 8 - 14. 14. Требования к постановке исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосфере. Методические указания ./М.-1997.- 23 с. ? При застосуванні формули 30 слід попередньо встановити значення К2 для раніше регламентованих ЛЗ досліджуваної фармакологічної групи і тільки в разі незначних коливань цих величин можна використати величину коефіцієнту для розрахунків ОБРВ п.р.з. ЛЗ що вивчається. ?? ?? ?? ??