МР 8.1.4.104- 2003

МР 8.1.4.104- 2003 Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації. Методичні рекомендації

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ Н А К А З 25/07/2003 № 356 м. Київ Про затвердження методичних рекомендацій “Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієніч- ній регламентації” Відповідно до статті 40 Закону України “Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення” Н А К А З У Ю: 1. Затвердити методичні рекомендації “Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації” що додаються. 2. Головному санітарно-епідеміологічному управлінню Міністерства охорони здоров’я України ці методичні рекомендації довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби міністерств інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку. 3. Контроль за виконанням наказу покласти на начальника Головного санітарно-епідеміологічного управління Міністерства охорони здоров’я України Бережнова С.П. Перший заступник Державного секретаря Головний державний санітарний лікар України О.В. Лапушенко Начальник Головного санітарно- епідеміологічного управління С.П. Бережнов Начальник управління справами М.М. Корнієнко Начальник юридичного відділу М.Г Бєлотєлов Реєстр розсилки: До справи – 1 ГСЕУ – 1 Виконавець: Омельчук 2539484 МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ ДЕПАРТАМЕНТ ДЕРЖАВНОГО САНІТАРНО-ЕПІДЕМІОЛОГІЧНОГО НАГЛЯДУ КОМІТЕТ З ПИТАНЬ ГІГІЄНІЧНОГО РЕГЛАМЕНТУВАННЯ МОЗ УКРАЇНИ ЗАТВЕРДЖЕНО Наказ МОЗ України від 2003 р. № 8. Гігієна і токсикологія пестицидів полімерних та синтетичних матеріалів 8.1. Пестициди і агрохімікати 8.1.4. Стан здоров’я працюючих та населення у зв’язку із застосуванням агрохімікатів та пестицидів Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації Методичні рекомендації МР 8.1.4.104- 2003 1. Галузь застосування Токсикологія і гігієна застосування хімічних речовин у промисловості сільському господарстві і побуті Видання офіційне ? Міністерство охорони здоров’я України Ці методичні рекомендації не можуть бути повністю або частково скопійовані тиражовані і поширені без дозволу Головного державного санітарного лікаря України Київ-2003 Передмова МР 8.1.4.104 - 2003 1. Методичні рекомендації призначені для науково-дослідних установ токсиколого-гігієнічного профілю МОЗ України що займаються гігієнічною регламентацією хімічних речовин розроблені Проданчук М.Г. директор Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України Жмінько П.Г. Зінченко Д.В. Кузьмінський С.М. Янкевич М.В. Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України Київ-03022 вул. Героїв Оборони 6 Методичні рекомендації підготовлені з урахуванням нових наукових дослідженнь в галузі токсикології і імунотоксикології хімічних речовин. 1. Методичні рекомендації запропоновані Інститутом екогігієни і токсикології ім. Л.І.Медведя МОЗ України. 2. «Введено в дію вперше» 3. Методичні рекомендації – можуть бути використані при дослідженні імунотоксичної дії встановленні безпечних рівнів хімічних речовин та розробці їх гігієнічних нормативів у об‘єктах навколишнього середовища з урахуванням впливу хімічного фактору на імунну систему організму. ? Міністерство охорони здоров’я України Ці методичні рекомендації не можуть бути повністю або частково скопійовані тиражовані і поширені без дозволу Головного державного санітарного лікаря України 2 ЗМІСТ ВСТУП 6 1. СТРУКТУРА І ФУНКЦІЯ ІМУННОЇ СИСТЕМИ 7 2. СХЕМА І ПОСТАНОВКА ЕКСПЕРИМЕНТУ ПО РЕГЛАМЕНТАЦІЇ ХІМІЧНИХ РЕЧОВИН 11 2.1. Схема експерименту 11 2.2. Тварини 9 2.3. Дози концентрації і кратність введення 9 3. ПОКАЗНИКИ І ОЦІНКА ІМУНОТОКСИЧНОЇ ДІЇ ХІМІЧНИХ РЕЧОВИН 9 3.1. Показники стану імунної системи 9 3.2. Оцінка отриманих результатів 10 4. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 11 4.1. Показники неспецифічної резистентності організму 11 4.1.1. Формула крові 11 4.1.2. Фагоцитарна активність макрофагів і нейтрофілів 11 4.1.3. Оцінка функціональної активності нейтрофілів в реакції віднов- лення нітросинього тетразолію НСТ-тест /14/ 13 4.1.4. Визначення кількості природних клітин-кілерів ВГЛ - великих гранульованих лімфоцитів /15/ 14 4.1.5. Визначення активності природних кілерів /16/ 15 4.1.6. Активність комплементу сироватки крові за 50% гемолізом /17/ 16 4.1.7. Визначення активності лізоциму у сироватці крові турбідиметричним методом /18 19/ 17 4.2. Клітинні реакції клітинний імунітет 19 4.2.1 Реакція гіперчутливості повільного типу РГПТ /10 20/ 19 4.2.2. Реакція трансплантат проти хазяїна РТПХ /10 21/ 19 4.2.3. Визначення кількості лімфоцитів та іх субпопуляцій. 20 4.2.4. Визначення активності кислої фосфатази методом азосполучен- ня /24/ 21 4.2.5. Визначення активності кислої неспецифічної естерази /25/ 22 4.2.6. Реакція бласттрансформації лімфоцитів РБТЛ під впливом Т- та В-клітинних мітогенів /20 26 27/. 23 4.3. Гуморальні реакції гуморальний імунітет 24 4.3.1. Визначення титру гетерофільних аглютинінів /26/ 24 4.3.2. Визначення титру гемаглютинінів і гемолізинів /28 29/ 25 4.3.3. Виявлення кількості антитілоутворюючих клітин АУК в се- лезінці метод Єрне і Нордіна /19 30/ 26 4.3.4. Визначення концентрації імуноглобулінів класів IgG IgА IgМ у сироватці крові за методом Маnсіnі /26 31/ 27 4.3.5. Скринінг-тест для оцінки патогенних властивостей циркулюючих імунних комплексів ЦІК /33/ 27 4.4. Інші показники стану імунної системи 28 4.4.1. Визначення маси та клітинності лімфоїдних органів 28 4.4.2. Морфологічні дослідження 29 ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ 30 3 ВСТУП У працях останніх років показано що багато хімічних речовин спроможні чинити імунодепресивну дію переважно по Т-типу викликати алергічні та аутоімунні захворювання порушувати формування набутого імунітету. Зниження імунної реактивності організму під впливом хімічних речовин також сприяє росту простудних інфекційних алергічних і онкологічних захворювань. При дії багатьох ксенобіотиків зміна неспецифічної резистентності і імунної реактивності організму настає раніше від специфічних ознак інтоксикації та відновлюється значно пізніше. Це свідчить про те що показники імунної системи можуть бути використані як лімітуючі при регламентації хімічних речовин та для діагностики прихованих форм інтоксикації у людей які професійно контактують з цими речовинами. Досі імунологічні критерії шкідливості використовували переважно при токсиколого-гігієнічній оцінці хімічних алергенів. Це пов'язано з тим що більшість імунологічних методів досліджень трудомісткі складні не завжди можуть бути відтворені у звичайних лабораторних умовах токсиколого-гігієнічного профілю потребують використання дефіцитних імпортних реактивів. Одною із перешкод для постановки імунологічних тестів є погана розчинність більшості хімічних речовин у воді. В зв‘язку з цим розробка критеріїв оцінки імунотоксичної дії хімічних речовин та удосконалення методичних підходів до їх гігієнічної регламентації в об'єктах навколишнього середовища з урахуванням впливу їх на імунну систему є актуальною проблемою. Дані методичні рекомендації включають загальні положення щодо структури імунної системи ролі клітинних і гуморальних факторів в імунній відповіді. Приводяться інструкції щодо використання деяких сучасних імунологічних методик оцінка отриманих результатів з гігієнічних позицій. Однак Методичні рекомендації не обмежують вибору інших інформативних методів досліджень. В кінці методичних рекомендацій подано список літератури де науковець може знайти відомості не тільки про сучасні методи досліджень але і протеоретичні розробки в імунології. 4 Дані методичні рекомендації орієнтовані на спеціалістів що займаються гігієнічною регламентацією хімічних речовин в об'єктах навколишнього середовища. 1. СТРУКТУРА І ФУНКЦІЯ ІМУННОЇ СИСТЕМИ Імунна система організму являє собою сукупність усіх лімфоїдних органів і скупчень лімфоїдних клітин. Для імунної системи характерні 3 особливості: вона генералізована по всьому тілу; її клітини постійно рециркулюють завдяки кровообігу по всьому організму; вона здатна виробляти специфічні антитіла різноманітні своєю специфічністю для кожного антигену. Імунітет - це засіб захисту організму від живих тіл і речовин що несуть на собі ознаки генетично чужорідної інформації. Головне призначення імунітету - знищення клітин що генетично відрізняються від клітин власного організму незалежно від того чи ці клітини є чужорідні чи змінені в генетичному відношенні конкретного організму Петров Р.В. 1987 /1/. Розрізняють центральні первинні і периферичні вторинні органи імунітету. До центральних органів імунітету відносяться - вилочкова залоза тимус і сумка Фабриціуса у птахів. До периферичних - селезінка лімфатичні вузли мигдалик периферична кров. Центральною фігурою імунної системи є лімфоцит. Крім функції імунологічного нагляду діяльність лімфоцитів пов'язана із забезпеченням морфологічної цілісності організму за рахунок морфо-генетичної активності і виконує загальнорегуляторну функцію Бабаева А.Г. 1986 /2/. Родоначальницею усіх клітин імунної системи є кровотворна стовбурна клітина. Вона генерує лімфоїдну стовбурну клітину що дає початок 2 типам імунокомпетентних клітин - Т- і В-лімфоцитам. Розвиток Т-лімфоцитів відбувається в тимусі і під впливом його гормонів - тимозину і тимопоетину відбувається дозрівання їх у крові. Т-лімфоцити тимоцити у свою чергу генерують на 3 типи клітин: Т-хелпери Тh Т-супресори Тs Т-ефектори Тe . Останнім часом виділяють ще декілька субпопуляцій 5 Т-лімфоцитів - Т-ампліфайєри Та Т-диференціюючі лімфоцити Тd контрсупресори. Тh є важливою складовою частиною кооперуючої системи. Розрізняють 2 типи Т-хелперів - Тh1 і Тh2. Вони включають В-лімфоцити в проліферацію і диференціювання що забезпечує накопичення відповідного клону зрілих антитілопродуцентів - плазматичних клітин а також відіграють посилюючу роль у реакціях клітинного імунітету Moretta et. al. 1981; Петров Р.В. 1987 . Т-еффектори - клітини під впливом чужерідних антигенів формують клон сенсибілізованих лімфоцитів - кілерів. Вони відповідають за клітинні форми імунної відповіді реакції ГЗТ відторгнення трансплантанта специфічний лізис клітин мішеней in vitro протипухлинний і противірусний імунітет . Т-супресори гальмують включення В-лімфоцитів у проліферацію і диференціювання гальмують розвиток ГЗТ формування цитотоксичних Т-лімфоцитів. Виділяють специфічні і неспецифічні Тs. Зниження їхньої функції відіграє патогенетичну роль у формуванні аутоімунних і алергічних захворювань. Підвищення функціональної активності Тs веде до розвитку імунодефіцитних станів а також онкологічних захворювань. Т-ампліфайери підсилювачі виконують роль помічників в імунологічних реакціях клітинного типу. Т-диференціюючі лімфоцити регулюють диференціювання стовбурних клітин у мієлоїдному або лімфоїдному напрямку а також впливають на їхню міграцію і проліферацію. Основним маркером Т-лімфоцитів є рецептор для еритроцитів барана що дозволяє ідентифікувати їх в тесті спонтанного Е-розеткоутворення. У нормі в периферичній крові людини - 55-60% Т-лимфоцитів. Про функціональний стан Т-лімфоцитів судять по реакції бласттрансформації лімфоцитів на вплив мітогенів Вершигора А.Е. 1980 /3/. Другою великою популяцією лімфоцитів у периферичній крові яка складає 25-30% є В-лімфоцити. В-лімфоцити у птахів розвиваються в сумці Фабриціса у 6 людини - під впливом невідомого чинника. Вони генерують на 3 типи клітин - що продукують антитіла IgM IgG і IgA. В-клітини відповідають за гуморальний імунітет. Завдяки наявності на поверхні В-лімфоцитів імуноглобулінових детермінант рецепторів до Fe-фрагмента IgG і третьому компоненту комплементу С3 їх можна ідентифікувати за допомогою комплементарного ЕАС розеткоутворення. Про функціональну активність В-лімфоцитів судять по реакції бласттрансформації на вплив мітогенів гемагглютинації рівню імуноглобулинів у сироватці крові. Популяція В-лімфоцитів складається із декількох типів В-клітин. В-хелперів що посилюють функцію деяких субпопуляцій Т-лімфоцитів і В-супресорів категорія незрілих В-клітин що пригнічують як клітинний так і гуморальний імунітет. Вони гальмують синтез ДНК і проліферацію попередників антитілопродуцентів функцію деяких субпопуляцій Т-лімфоцитів відповідь лімфоцитів на мітогени. Розрізняють також нульові клітини 0-лімфоцити - лімфоцити що не несуть маркерів подібних до Т- і В-клітин. Нульові клітини складають 10-20% від загальної кількості лімфоцитів периферичної крові людини. Ця субпопуляція клітин не є однорідною а містить у собі ще L- і К-лімфоцити та природні кілери NК-клітини які розрізняються між собою за функцією та антигенними маркерами. NК-клітини здійснюють протипухлинний захист лізують і елімінують бактеріальні і вірусні антигени і разом із К-клітинами відіграють важливу роль у підтримці гомеостатичної рівноваги в організмі. Існує незначна частина лімфоцитів Д-лімфоцити які мають одночасно маркери Т- і В-лимфоцитів. Природа і функції їх остаточно не з‘ясовані. Для нормальної імунної відповіді необхідні макрофаги. Антиген оброблений макрофагом розпізнається Т-хелперами. Т-хелпери за допомогою 2-х сигналів включають В-лімфоцити в антитілогенез. Кооперація макрофагів Т- і В-лімфоцитів і їх механізм взаємодії докладно описані Петровим Р.В. 1976 1987 . 7 Відомо що при впливі на організм ксенобіотиків у реакцію включаються як клітинні й гуморальні механізми імунітету так і неспецифічні фактори захисту організму. Неспецифічні фактори захисту виникли у філогенезі значно давніше ніж специфічна реактивність і включаються в знешкодження різноманітних ксенобіотиків раніше від імунологічних специфічних факторів. Неспецифічні фактори тісно пов'язані з механізмом імунної відповіді. Порушення процесу фагоцитозу активності комплементу веде до порушення реагування імунної системи. У зв'язку з цим вивчення механізму токсичної дії хімічних речовин на імунну систему організму без урахування стану неспеціфічної резистентності буде неповним оскільки неспецифічна резистентність та імунна система складають єдиний механізм реактивності що включають стереотипні і специфічні реакції. Неспецифічна реактивність організму містить у собі механічні фізичні клітинні і гуморальні фактори. Механічні фактори - бар'єрна функція шкіри і слизових оболонок. Фізичні фактори - кисле середовище шкіри і шлункового соку бактерицидність шкіри слини крові. Клітинні фактори - фагоцитоз піноцитоз. Гуморальні фактори - природні антитіла лізоцим комплемент ?-лізин лейкіни пропердин інтерферон та інші. Важливе значення в імунній відповіді мають фагоцитоз і комплемент. У процесі фагоцитоза головне місце відводиться макрофагам і нейтрофілам. Макрофаги синтезують велику кількість лізосомальних ферментів які використовуються для перетравлення фагоцитованого матеріалу і ряд інших ферментів і білків що беруть участь узахисті організму від чужорідних агентів. Це є лізоцим коллагеназа еластаза інтерферон медіатор температурної реакції піроген фактори комплементу С2 С3 С4 і фактор У простагландини а також супероксидний аніон і перекис водню що мають бактерицидну дію Томпсон Р.А. 1983 . 8 Крім того макрофаги беруть участь у підготовці антигенів і переробці їх у імуногенну форму та у кооперації Т- і В-лімфоцитів необхідних для ініціювання імунної відповіді. Функція макрофагів і їхня роль в імунітеті докладно висвітлені в монографії Учителя І.Я. 1978 . Про активність фагоцитів судять по спроможності до адгезії міграції захопленню і перетравленню бактерій. Комплемент - це термолабільний неспецифічний фактор сироватки крові що є сумішшю глобулінів сироватки крові і мукопротеїну. Він впливає головним чином не на антиген а на комплекс антиген-антитіло. Активація системи комплемента - це важливий етап ефективного механізму гуморальних і клітинних імунних реакцій. Призначення інших факторів неспецифічного захисту організму і методи їх дослідження описані в ряді монографій і посібників з імунології. 2. СХЕМА І ПОСТАНОВКА ЕКСПЕРИМЕНТУ З РЕГЛАМЕНТАЦІЇ ХІМІЧНИХ РЕЧОВИН 2.1. Схема експерименту При прогнозуванні й оцінці сенсибілізуючої та імунотоксичної дії пестицидів і агрохімікатів необхідно додержуватися принципу етапності. Етапи гігієнічної регламентації хімічних речовин з урахуванням імунної реактивності організму подані у схемі. Етапи досліджень 1.  На основі даних про хімічну структуру і аналізу літератури прогнозують можливість алергенного і імунотоксичного ефектів у досліджуваної речовини. 2. Вивчають можливі алергенні властивості за загальноприйнятою схемою в токсикології /4-8/. В разі виявлення сенсибілізуючих властивостей оцінюють вираженість алергенного ефекту і класифікують за ступенем алергенної небезпечності згідно СанПіН 8.8.1.002-98. 9 Речовини 1 класу небезпечності не допускають до застосування 2 класу небезпечності - регламентують по алергенному ефекту 3 і 4 класів небезпечності - регламентують з урахуванням специфічної і загальнотоксичної дії. 3.Проводять дослідження імунотоксичної і імуномоделюючої дії в гострому і субхронічному експериментах визначають вираженість ефекта в залежності від дози. Якщо препарат не має вказаних ефектів то регламентацію проводять за загальноприйнятою схемою з урахуванням специфічної і загальнотоксичної дії. 4. В разі виявлення будь-яких порушень імунологічної реактивності поряд з дослідженням специфічного і загальнотоксичного ефектів досліджують стан неспецифічної реактивності організму клітинного і гуморального ланцюжків імунітету можливість розвитку аутоімунних порушень в хронічному експерименті. Визначають порогові і недіючі рівні доз концентрацій препарату. 5. При необхідності проводять епідеміологічні дослідження вивчають механізм імунотоксичної дії. 2.2. Тварини В експерименті використовують статевозрілих тварин. Різниця в масі тіла тварин в дослідних групах не повинна перевищувати 15%. Експериментальні групи складаються не менш як з 8-10 тварин обох статей що дозволяє провести статистичну обробку отриманих результатів. Для дослідження імуномоделюючої дії препарату пропонуються дві опозитні щодо імунної відповіді лінії мишей - С57ВL та СВА. Для дослідження алергенних властивостей ксенобіотиків використовують морські свинки білої масті. В експериментах з гігієнічної регламентації препаратів використовують 2 види тварин - щурі або миші кролики. 2.3. Дози концентрації і кратність введення Дози і концентрації Вибір доз і концентрацій повинен базуватись на основних параметрах токсичності - ЛД50 ЛК50 токсичні порогові і недіючі дози концентрації 10 Схема гігієнічної регламентації хімічних речовин з урахуванням сенсибілізуючої і імунотоксичної дії. встановлені за інтегральними показниками. Імуномоделюючу дію визначають в гострому і субхронічному експериментах на різних рівнях доз концентрацій . Кількість доз концентрацій - не менше 3 інтервал між дозами - має становити не більше ніж 1 порядок. Встановлюють порогові і недіючі рівні доз концентрацій за імунологічними показниками. Для регламентування хімічних речовин проводять хронічний експеримент. Досліджують не менше як 3 дози препарату. Встановлюють порогові і недіючі рівні доз концентрацій за імунологічними показниками. Для оцінки потенційної небезпечності пестицидів важливо дослідити імунотоксичну дію препарату на рівнях доз і концентрацій які можуть бути в реальних умовах. Для вибору таких доз концентрацій слід виходити із розрахункових величин гігієнічних параметрів речовини ГДК МДР ДДД . Кратність введення і експозиція В гострому експерименті кратність введення препарату - одноразово підгострому - 1 місяць субхронічному 2-3 місяці хронічному - 1-2 роки. Експозиція при інгаляційному і дермальному надходженні препарату в організм - 4 години. 3. ПОКАЗНИКИ І ОЦІНКА ІМУНОТОКСИЧНОЇ ДІЇ ХІМІЧНИХ РЕЧОВИН 3.1. Показники стану імунної системи Для оцінки стану імунної системи при дії хімічних речовин розроблено багато схем які включають імунологічні показники різного рівня. Останнім часом збільшується кількість показників які дозволяють різносторонньо оцінити функціональну активність імунної системи. Вибір показників стану імунної системи залежить від поставлених задач імуномоделюючих властивостей речовин та інше. При регламентуванні пестицидів в токсиколого-гігієнічних лабораторіях використовують досить інформативні і легко відтворювані тести які дозволяють отримати мінімум інтегративних характеристик діяльності головних ланок імунної системи. 1 Показники неспецифічної резистентності організму: - формула крові; - фагоцитарна активність макрофагів і нейтрофілів; 12 - кількість NК-клітин і їх активність; - активність комплемента сироватки крові; - активність лізоцима сироватки крові. 2 Клітинні реакції клітинний імунітет : - реакція гіперчутливості повільного типу; - реакція трансплантат проти хазяїна; - кількість Т- і В-лімфоцитів та їх популяцій; - бласттрансформація лімфоцитів з ФГА Кон А ЛПС. 3 Гуморальні реакції гуморальний імунітет : - рівень гетерофільних агглютининів; - рівень гемаглютининів та гемолізинів до еритроцитів барана; - кількість антитілоутворюючих клітин в селезінці; - рівень Іg G Іg М Іg А; - рівень циркулюючих імунних комплексів. 4 Інші показники стану імунної системи: - маса тимуса селезінки лімфовузлів; - клітинність лімфоїдних органів; - морфологічні дослідження. Використання наведених вище показників дає можливість оцінити імунотоксичні властивості препарату та встановити на яку саме ланку імунної системи він впливає - гуморальний чи клітинний імунітет або фактори неспецифічної резистентності організму. Які саме методи досліджень будуть використані в токсикологічному експерименті вирішує дослідник але вибір методів повинен бути адекватний поставленим задачам і дозволяти дати об‘єктивну оцінку щодо дії препарату на імунну систему. Доцільніше використовувати два та більше методів які дають можливість характеризувати стан кожної ланки імунітету. При необходності в спеціальних дослідженнях використовують складніші показники які дозволяють дати оцінку не тільки стану ІС але і визначити механізм імунотоксичної дії. 13 3.2. Оцінка отриманих результатів При оцінці зміни показників стану імунної реактивності основним критерієм є ступінь відхилення від паралельного контролю а також тривалість виявлених змін. Фізіологічні показники і норми для інтактних тварин надані в рекомендованих імунологічних методах дослідження. Крім того рекомендується орієнтуватись на фізіологічні показники і норми прийняті в токсикології /9/. У комплексі показників що застосовуються для виявлення токсичного ефекту при хронічній дії імунологічні показники розглядаються як інтегральні. У той же час їх гігієнічне значення суттєве оскільки зміна функціональної активності імунної системи визначає рівень резистентності організму по відношенню до шкідливих факторів фізичних хімічних мікробіологічних . При оцінці порогових доз і концентрацій необхідно враховувати спрямованість і стійкість змін досліджених показників які характеризують стан ІС і віддиференціювати адаптацію організму від пошкоджень. Провести таку диференціацію допомагають дослідження резервних можливостей організму за здатністю ІС відповідати на додатковий антигенний стимул еритроцити барана або бактеріальні антигени . Недіючою дозою препарата вважають ту при дії якої не спостерігається змін імунної реактивності організму на додаткову дію антигену. Пороговою дозою препарата є та доза при дії якої не спостерігається змін в реактивності ІС але виявляються порушення імунної відповіді на додатковий антигенний стимул. В деяких випадках об‘єктивна оцінка шкідливої дії ускладнена в зв‘язку з фазними змінами виявлених ефектів а також неадекватністю реагування різних видів тварин. При неоднозначній відповіді ІС стимуляція з подальшим пригніченням і т.і. на дію ксенобіотика для оцінки значимості отриманих змін і визначення порогових доз доцільним є визначення величини і гармонійності ефекта по узагальненому критерію І який являє собою суму показників величини індекса змін і гармонійності /10/. 14 Запропонований метод дозволяє провести порівняльну оцінку реакції біоефектів у піддослідних і інтактних тварин на основі загальних положень теорії подібності виявити фактор який викликає мінімальний по величині і максимальний по гармонійності біоефект наприклад визначення мінімальної діючої дози або виявити фактор який викликає біоефект максимальний по величині і гармонійності наприклад при оцінці стимуляторів або імунодепресантів . 4. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 4.1. Показники неспецифічної резистентності організму 4.1.1. Формула крові Оскільки клітини крові безпосередньо беруть участь у специфічній і неспецифічній імунній відповіді то перш за все необхідно визначити загальну кількість лейкоцитів та лейкограму крові. Це сприяє прогнозуванню сенсибілізуючих і імунотоксичних властивостей речовини та використанню даних гематологічних досліджень для розрахунку абсолютної кількості окремих популяцій імунокомпетентних клітин визначених у відносних одиницях за імунологічними показниками поданими нижче. Визначення загальної кількості лейкоцитів периферичної крові та лейкоцитарної формули проводять загальноприйнятим методом в гематології /11/. 4.1.2. Фагоцитарна активність макрофагів і нейтрофілів Принцип методу. Про фагоцитарну активність макрофагів і нейтрофілів судять по кількості клітин які вміщують мікроорганізми кількості цих мікроорганізмів у одному фагоциті і ступеню пошкодження перетравлювання мікроорганізмів у фагоциті. а Визначення фагоцитарої активності макрофагів /12/ Реактиви. 1. Гепарин 2. 0 164 М розчин хлориду натрію фізиологічний розчин рН 7 2-7 4 15 3. 0 2% розчин пептону 4. Сироватка ембріонів телят 5. Завись мікроорганізмів стафілококів або іншої культури 6. М‘ясо-пептонний бульйон 7. Метанол 8. Фарба по Романовському-Гімзе Отримання перитонеального ексудату. Для оцінки фагоцитарної активності перитонеальних макрофагів отримують клітини перитонеального ексудату. Піддослідним мишам в черевну порожнину вводять 5 мл щурам - 10-15 мл забуференого фізіологічного розчину рН 7 2-7 4 що містить 20 од/мл гепарину і 1% сироватки ембріонів телят. Протягом 1-2 хв масажують живіт тварин потім роблять розріз передньої стінки і відсмоктують рідину з різних відділів черевної порожнини. Щоб отримати більшу кількість макрофагів у черевну порожнину мишей вводять 1 5 мл 2% розчину пептону щурам - 5 мл і через 48 год відсмоктують рідину. Хід реакції. В отриманому ексудаті підраховують кількість макрофагів. Забуференим фізіологічним розчином рН 7 2-7 4 розводять макрофаги до кінцевої концентрації - 400-500 тис/мл. Отриману суспензію розливають у пробірки по 1 5 мл. Готують завись агарової культури мікробів стафілококів або іншої культури придатної для виявлення фагоцитарної активності у фізіологічному розчині з концентрацією мікробних тіл 500 млн/мл. До кожної пробірки вносять по 0 3 мл зависі мікробів струшують і ставлять у термостат на 30 хв при 37 °С. При дослідженні фагоцитарної активності in vitro до дослідних пробірок вносять препарат що вивчається. Кінцева концентрація препарарата не повинна чинити цитотоксичну дію. Після інкубації роблять мазок на предметному склі фіксують метанолом 15 хв і забарвлюють за Романовським-Гімзе. Перетравлюючу здатність макрофагів вивчають таким чином: до залишеної в пробірках суміші додають по 0 05 мл м'ясо-пептонного бульйону рН=7 3 перемішують і ставлять у термостат 37°С . Проби для мазків беруть через 1 год та 6 год. 16 Облік реакції. У світловому мікроскопі підраховують відсоток клітин які фагоцитують мікроби фагоцитарний індекс кількість мікробів поглинених одним макрофагом фагоцитарне число та фагоцитарну активність яка визначається діленням кількості поглинутих мікробів на сто підрахованих клітин. Перетравлюючу здатність характеризують за індексом завершеності фагоцитозу ІЗ який обчислюють за формулою: ФІ1-ФІ6 ІЗ = ----------------х100% ФІ1 де ФІ1 та ФІ6 - фагоцитарні індекси через 1 та 6 год відповідно. В нормі індекс завершеності фагоцитозу повинен бути > 0. б Визначення фагоцитарої активності нейтрофілів /13/ Реактиви. 1. Гепарин 2. 0 164 М розчин хлориду натрію фізіологічний розчин 3. Завись мікроорганізмів Candida albicans або іншої культури 4. Фіксатор крові 5. Фарба по Романовському-Гімзе Приготування зависі Candida albicans. Завись Candida albicans готують в 0 164 М розчині хлориду натрію 109 клітин/мл . Candida albicans вирощують у бульйоні протягом 48 годин при температурі 37 0С щоб запобігти утворенню міцелію . Потім тричі відмивають у стерильному фізіологічному розчині центрифугуванням при 1 5 тис. об./хв. навпродовж 10 хв.; визначають концентрацію мікробних клітин в камері Горяєва. Клітини мікроорганізмів розводять стерильним фізрозчином до концентрації 109 клітин/мл. Отримана суспензія придатна до застосування впродовж 2-3 тижнів при умові зберігання під резиновою пробкою при 4 0С. 17 Хід реакції. В пробірку або лунку пластикової планшетки вносять 0 02 мл фізрозчину який вміщує 200 од/мл гепарина додають 0 1 мл крові забраної в стерильних умовах 0 02 мл суспензії Candida albicans співвідношення мікроби/фагоцити приблизно 40:1 і старанно перемішують. Після 30 хвилинної інкубації при 37 0С готують мазки висушують на повітрі не менше 1 години фіксують і забарвлюють. Облік реакції. Під світловим мікроскопом по периферії мазка підраховують 100 нейтрофілів визначають відсоток клітин які вміщують мікроорганізми фагоцитарний показник середнє число мікроорганізмів у 1 фагоциті фагоцитарний індекс відносну кількість пошкоджених слабкозабарвлених або нерівномірно забарвлених мікробних клітин фагоцитованих нейтрофілами відсоток перетравлених клітин . Для об‘єктивного висновку про стан фагоцитарної функції в цілому слід визначити і абсолютну кількість фагоцитуючих нейтрофілів для цього використовують дані загального аналіза крові - кількість лейкоцитів і нейтрофілів . Результат виражають у Гіга/л. Для щурів масою тіла 180-200 г фагоцитарний показник за даною методикою складає 40-60% фагоцитарний індекс - 1 8 - 2 5 відсоток перетравлювання - 40-55%. 4.1.3. Оцінка функціональної активності нейтрофілів в реакції віднов- лення нітросинього тетразолію НСТ-тест /14/ Принцип методу. Метод грунтується на здатності нітросинього тетразолію під впливом активних продуктів метаболізму перетворюватися в нерозчинний блакитний формазан. Реактиви. 1. 0 1 М ізотонічний фосфатний буфер рН 7 2 : Розчин А - 13 509 г КН2РО4 розчиняють в 1 л ізотонічного розчину хлористого натрію для кроликів - 0 15 М для щурів і мишей - 0 164 М . Розчин В - 17 8 г Na2НРО4.2Н2О або 35 82 г Na2НРО4.12Н2О розчиняють в 1 л ізотонічного розчину хлористого натрію. 18 Розчини А і В змішують у співвідношенні 13 : 37 рН 7 2 . 2. Гепарин. Розчин гепарину - 800 од/мл. Зберігають при температурі +40С. 3. 0 2 % розчин нітросинього тетразолію. Розчин НСТ готують перед використанням. До 2 мг порошка НСТ додають краплю 960 етилового спирту 0 5 мл дестильованої води і 0 5 мл ізотонічного фосфатного буфера розчиняють фільтрують через паперовий фільтр. 4. Суспензія латексу 0 8 мкм - 1.106 в 1 мкл . Можна використовувати зимозан. 5. Метанол для фіксації мазків. 6. 2 % водний розчин метилового зеленого. При його відсутності можна використовувати 1 % розчин карміну 0 1 % розчин нейтрального червоного. Не можна використовувати барвники що забарвлюють ядра в темно-синій або фіолетовий колір. Хід реакції. Перед забором крові піпетки і лунки планшетки змочують розчином гепарину. В дві лунки пластикового планшету вносять по 0 05 мл крові. В першу лунку вивчення спонтанної реакції додають 0 025 мл фосфатного ізотонічного буфера з гепарином у другу вивчення реакції нейтрофілів на стимуляцію - 0 025 мл суспензії латексу. Потім у обидві пробірки додають по 0 025 мл розчину НСТ. Плавним погойдуванням кров ретельно перемішують накривають фільтрувальним папером змоченим фосфатним буфером і склом волога камера і на 30 хв. ставлять в термостат при 370С. Після інкубації знову перемішують вміст пластини готують мазки середньої густини висушують на повітрі фіксують 5 хв. у метанолі. Потім фарбують їх 5-7 хвилин метиловим зеленим. 30 сек. промивають проточною водою ополоскують дестильованою водою висушують на повітрі. Під світловим мікроскопом об‘єктив х90 визначають число формазан-позитивних клітин на 100 нейтрофілів. Облік реакції Облік реакції проводять на основі підрахунку кількості нейтрофілів що вміщують сині глибки формазана. Підрахунок реакції можна проводити двома способами: 1. Визначення відсотка формазанпозитивних активованих нейтрофілів з одночасним перерахунком на їх абсолютну кількість. Цей спосіб передбачає облік кількості позитивних і негативних клітин. Підраховують 100 нейтрофілів. Результати виражають у відсотках і в Г/л 109/л . Це так званий спонтанний НСТ-тест. Такий же підрахунок проводять у другому мазку при використанні стимулятора стимульований НСТ-тест . Абсолютну кількість формазанпозитивних нейтрофілів розраховують за формулою: АхВхСх0 001 де А - кількість лейкоцитів в Г/л; В - процент усіх нейтрофілів; С - процент формазанпозитивних нейтрофілів; 0 001 - коефіцієнт перерахунку в Г/л. 2. Визначення індексу активації нейтрофілоцитів ІАН . ІАН - середній показник активації системи фагоцитозу в перерахунку на один нейтрофіл. За ступенем активації усі нейтрофіли поділяють на 4 групи: 0 - клітини з одиничними пиловидними гранулами або без них; 1 - клітини з відкладаннями що не займають більше 1/3 площини ядра; 2 - відкладання формазана які займають більше 1/3 площини ядра але не більше ніж розміри цілого ядра; 3 - нейтрофіли з відкладаннями формазана що перевищують розміри ядра. Для одержання ІАН застосовують формулу Астальді і Верга що використовують в цитохімії для перерахунку середнього цитохімічного коефіціенту СЦК : СЦК = ах0 + бх1 + вх2 + гх3 + дх4 де 100 цифри - ступінь інтенсивності реакцій букви - число клітин з тим чи іншим ступенем активації 100 - число підрахованих клітин. 20 В нормі відносна кількість формазанпозитивних нейтрофілів у дорослих щурів складає 9-11 %. 4.1.4. Визначення кількості природних клітин-кілерів ВГЛ - великих гранульованих лімфоцитів /15/ Принцип методу Природні клітини-кілери NK-клітини мають характерну морфологічну будову. Це великі лімфоцити в цитоплазмі яких при фарбуванні по Паппенгейму-Крюкову Романовському-Гімзе або по Нохту виявляються азурофільні гранули. Реактиви 1.Метанол або фіксатор по Май-Грюнвальду 2. Водний розчин барвника Романовського. Розчин готують перед дослідом - 1 частина фарби на 10 частин нейтральної дистильованої або водопроводної води. Хід реакції Висушені на повітрі мазки крові фіксують в метанолі або фарбнику-фіксаторі Май-Грюнвальда протягом 5-7 хвилин промивають водопроводною водою та висушують на повітрі. Потім на висушений мазок наливають водний розчин барвника Романовського на 8-15 хвилин в залежності від температури в приміщенні змивають фарбу і мазки висушують на повітрі. Облік результатів Під світловим мікроскопом підраховують лейкоцитарну формулу і диференціюють лейкоцити. Підраховують 100-200 лейкоцитів. При підрахунку лімфоцитів ідентифікують великі гранульовані лімфоцити ВГЛ які характеризуються більшим розміром в порівнянні з іншими лімфоцитами округлим або бобовидним ядром рясною блідо-блакитною цитоплазмою яка містить в собі три та більше еозинофільних гранул які забарвлюються в яскраво-червоний або вишнево-фіолетовий колір. Абсолютну кількість ВГЛ в 1 л крові Г/л обчислюють із їх процентного вмісту і загального числа лейкоцитів. 21 4.1.5. Визначення активності природних кілерів /16/ Принцип методу Метод базується на здатності природних кілерів лізувати клітини мішені мічені Nа 51Сг Оз. Реактиви 1. Середовище RРМІ-1640 2. Сироватка ембріонів корів 3. Nа 51Сr Оз 4. 0 5% розчин Тритону Х-100 Хід реакції Як клітини-мішені використовують лінію клітин УАС-1 ріст яких підтримують у середовищі RРМІ-1640 з додаванням 10% сироватки ембріонів корів. Клітини-мішені мітять інкубуючи їх протягом 1 год з 100 мкКюрі Nа 51Сr Оз. Активність природних кілерів оцінюють у 18-годинному тесті за вивільненням радіоактивного хрому 51Сг а саме: до 104 мічених клітин-мішеней які знаходились в 0 1 мл середовища RРМІ-1640 із сироваткою ембріонів корів 10% додають такий же об'єм ефекторних клітин виділених із селезінки дослідних тварин так щоб у кінцевому підсумку отримати співвідношення ефекторних клітин до клітин-мішеней 25:1. Усі дослідження проводять у трьох паралелях у мікропанелях кінцевий об'єм інкубаційної зависі - 0 2 мл . Пластикові мікропанелі інкубують 18 год при 37 оС в атмосфері що містить 5% СО2. Для оцінки результатів панелі центрифугують 5 хв при 450g і 0 1 мл супернатанту відбирають для підрахунку радіоактивності СРМ - кількість імпульсів за хв/лунку . Спонтанне виділення радіоактивної мітки визначають у контрольних лунках клітини-мішені без додавання ефекторних клітин а максимальне вивільнення - інкубуючи клітини-мішені з 0 5% розчином Тритону Х-100 0 1 мл . Відсоток цитотоксичності ЦТ підраховують за формулою: СРМ в досліді - СРМ в контролі ЦТ == х 100% СРМ максимальне - СРМ в контролі 22 4.1.6. Активність комплементу сироватки крові за 50% гемолізом /17/ Принцип методу Метод грунтується на властивості комплементу викликати лізис сенсибілізованих еритроцитів барана ЕБ . Використовуючи ряд розведень досліджуваної сироватки з наростаючою кількістю комплементу визначають об`єм сироватки необхідний для гемолізу 50 % оптимально сенсибілізованих ЕБ. Ця величина позначається ІСН50 і є одиницею гемолітичної активності комплементу. Реактиви 1. Розчин № 1: 0 164 М хлористого натрію 9 587 г NaCl на 1 л дистильованої води - для титрування сироватки щурів та мишей або 0 15 М розчин NaCl 8 777 г на 1 л дистильованої води - для титрування сироватки кролів. 2. Розчин № 2: 1/15 М розчин однозаміщеного фосфорнокислого калію 9 073 г КН2РО4 на 1 л дистильованої води . 3. Розчин № 3: 1/15 М розчин двозаміщеного фосфорнокислого натрію Na2HPO4 .2H2O - 11 87 г на 1 л дистильованої води . 4. Розчин № 4 фосфатний буфер : до 29 6 мл розчину № 2 доливають до 100 мл розчин № 3 та перевіряють рН розчину який має бути 7 2. 5. Забуферений фосфатами ізотонічний розчин хлориду натрію рН 7 2 готують змішуючи 9 частин розчину № 1 та 1 частину розчину № 4. 6. Приготування розчину Алсвера - до 2 5 г глюкози додають 0 3 г лимоннокислого натрію 0 55 г лимонної кислоти доводять дистильованою водою до 100 мл. Розчин стерилизують кип`ятінням. 7. Еритроцити барана ЕБ витримують не менше 2 - 3 тижднів в розчині Алсвера. Готують 3 % суспензію ЕБ тричі відмиваючи їх розчином № 5 центрифугують 10 хвилин при 2000 об/хв. Для спектрофотометричної стандартизації цієї суспензії - 0 2 мл підготовленої суспензії лізують в 4 8 мл дистильованої води та визначають оптичну густину лізату при допомозі спектрофотометра при довжині хвилі - 541 нм. Правильно підготовлена суспензія ЕБ повинна мати оптичну густину рівну 0 375 нм. У випадку невідповідності кінцевий об`єм суспензії Vк розраховують за формулою: 23 Vk = Vп х ОГ/0 375 де : Vп - початковий об`єм суспензії ЕБ; ОГ - оптична густина лізату. 8. Робочий розчин гемолітичної сироватки готують змішуючи рівні об`єми розведеного розчину № 5 по трохкратному титру гемолітичної сироватки до ЕБ при титрі сироватки 1:1200 готують робоче розведення 1:400 та 3 % суспензії ЕБ. При змішуванні гемолітичну сироватку приливають до суспензії ЕБ а не навпаки. Суміш витримують при 370С 30 хвилин для сенсибілізації еритроцитів. 9. 2 % розчин сапоніна 2 г сапоніна розчиняють в 98 мл дистильованої води . Підготовка біосубстратів Сироватку отримують із крові яку беруть без коагулянтів відстоюють при кімнатній температурі протягом 1 години для зсідання еритроцитів. Потім центрифугують 10 хвилин при 3000 об/хв. та +4 0С. Комплемент титрують одразу після одержання сироватки при цьому всі операції по титруванні комплементу проводять в льодяній бані. Хід реакції Досліджувану сироватку крові розводять 1:30 в розчині № 5 та розливають в 10 пробірок в кількості від 0 1 до 1 0 мл. Далі в кожній пробірці об`єм сироватки доводять розчином № 5 до 1 0 мл. Після чого в кожну пробірку додають 2 0 мл сенсибілізованих ЕБ. Додатково готують ще 3 контрольні проби: №1 - контроль на 100 % гемоліз до 2 0 мл гемолітичної системи приливають 1 0 дистильованої води та 1 краплю 2 % розчину сапоніна ; №2 - контроль на спонтанний гемоліз сенсибілізованих еритроцитів беруть 2 0 мл гемолітичної системи та 1 0 мл розчину № 5 ; №3 - контроль гемолізу досліджуваної сироватки беруть 1 0 мл сироватки в розведенні 1:30 та 2 0 мл розчину № 5 . Вміст пробірок добре перемішують і розміщують в термостаті при температурі +370С на 30 хв. Після цього пробірки переносять на 10 хв. в холодильник при +40С для зупинки імунного гемолізу а потім центрифугують 10 хв. при 2000 об/хв. Після центрифугування дослідних пробірок вимірюють оптичну густину їх надосадкової рідини на спектрофотометрі при довжині хвилі 541 нм проти проби надосадкової рідини в пробірці №2 контроль спонтанного гемолізу сенсибілізованих еритроцитів контроль гемолізу 24 досліджуваної сироватки знімають проти кювети з розчином № 5. Істинну оптичну густину кожної дослідної пробірки отримують віднімаючи від показника одержаної оптичної густини контролю гемолізу досліджуваної сироватки. Облік результатів Варіант 1. Для кожного розведення сироваток дослідних пробірок розраховують ступінь гемолізу У та величину У/ 1-У : У = істинна ОГ зразку / ОГ відповідна 100 % гемолізу . На логарифмічному папері будують графік залежності У/ 1-У по осі абсцис від об`єму досліджуваної сироватки в мл вісь ординат . Для більшої точності беруть “У” між 0 20 та 0 80. Беручи до уваги що величина І СН50 - це об`єм досліджуваної сироватки який викликає лізис 50 % сенсибілізованих еритроцитів то в даних умовах постановки досліду на графіку знаходять той об`єм досліджуваної сироватки те значення “Х” при якому “У” = 1 0 х 0 5/1 0-0 5 . Варіант 2. На півлогарифмічному папері будують графік залежності між величинами Ух100 по осі абсцис та об`ємом сироватки в мл по осі ординат. Величина мл сироватки по осі ординат яка відповідає величині 100.У=50 по осі абсцис і буде величиною СН50. Після отримання значення СН50 вираховують кількість одиниць СН50 в 1 0 мл досліджуваної сироватки виходячи з формули: СН50 мл = А/Х де Х - об`єм сироватки в мл який містить І СН50; А - ступінь первинного розведення сироватки. Наприклад при первинному розведенні сироватки 1:30 та величині СН50 - 0 2 мл 1 мл досліджуваної сироватки вміщує: 30/0 2 = 150 СН50. Активність комплементу виражають в гемолітичних одиницях. 4.1.7. Визначення активності лізоциму у сироватці крові турбідимет-ричним методом /18 19/ Принцип методу. Метод грунтується на властивості лізоциму гідролізувати р-1 4-зв`язки між N-ацетилмурамовою кислотою та N-ацетилглюкозаміном у полісахаридному 25 компоненті клітинних стінок бактерій в результаті чого настає лізис бактерій і зміна щільності досліджуваного субстрату що визначається спектрофотометрично. Реактиви. 1. 0 9 % ізотонічний розчин хлориду натрію. 2. 0 06 М фосфатний буфер рН - 6 2 3. Лізоцим кристалічний 4. Ацетоновий порошок Мicrococcus lysodeicticus. Приготування ацетонового порошка Мicrococcus lysodeicticus. Вирощену на м`ясопептонному агарі 24-годинну культуру мікрококка суспендують у розчині хлориду натрію 0 15 М фільтрують через двошаровий марльовий фільтр і відмивають на холоді центрифугуванням при 5000 об/хв протягом 20 хвилин – двічі - розчином хлориду натрія та 1 раз дистильованою водою. Осад що складається з мікробної маси переносять невеликими порціями постійно розмішуючи в десятикратний об`єм ацетону інкубують у холодильнику 1-2 години при 2 - 4 0С потім фільтрують через два беззольних фільтри змочені дистильованою водою у воронці Бюхнера. Осад на фільтрі промивають холодним ацетоном двічі ефіром і висушують на повітрі при кімнатній температурі. Після розмелення в фарфоровій ступці порошок фасують у пеніцилінові флакони і тримають закупореними при 3-40С. Стандартну суспензію тест-культури готують extempore таким чином: 50 мг ацетонового порошка M.lysodeicticus суспендують в 100 мл фосфатного буфера. Випробування тест-культури на здатність лізоциму спричиняти лізис тест-культури Перед виконанням дослідів тест-культуру необхідно перевірити на здатність лізоциму спричиняти лізис тест-культури. Для цього у пробірці змішують рівні об`єми по 1 мл суспензії тест-культури 1.106 клітин в 1 мл виготовленої по бактеріальному стандарту каламутності і розчину лізоцима з концентрацією 8 мкг/мл. У контрольну пробірку до тест-культури додають розчин хлориду натрію. Культуру вважають придатною до роботи якщо у пробірці з лізоцимом повний лізис клітин пройшов через 30 хвилин при кімнатній температурі . Побудова калібровочної кривої 26 Приготувати робочі розчини лізоциму. Розчинити 100 мг кристалічного лізоциму у 100 мл 0 06 М фосфатного буфера рН 6 2 а потім з цього розчину який вміщує 100 мкг лізоциму в 1 мл приготувати робочі розведення необхідні для побудови калібровочної кривої. Таблиця. Схема приготування робочих розчинів лізоциму Вихідний розчин лізоциму 100 мкг/мл Фосфатний буферний розчин мл Концентрація лізоциму в робочому розчині мкг/мл 1 00 7 00 12 50 0 50 7 50 6 25 0 25 7 75 3 13 0 25 15 75 1 56 В кювету внести 1 5 мл щойно виготовленої суспензії мікрокока 0 5 мл розчину хлориду натрія 0 3 М і 1 мл розчину лізоциму визначеної концентрації. Вміст кювети швидко перемішати скляною паличкою та на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм визначити екстинцію через 15 сек. Ео та 180 сек. Еs . Контролем служить буферний розчин вміщений в кювету в об`ємі 3 мл. Для побудови калібровочної кривої результати вимірювань відображають графічно відкладаючи по осі абсцис концентрацію лізоцима в мкг а по осі ординат - різницю величини екстинції Еs - Ео . Підготовка біологічного матеріалу Кров збирають у сухі пробірки відстоюють протягом 15 хвилин при температурі 37 0С. Центрифугують при 3000 об/хв 10 хвилин. Сироватку відбирають у чисті пробірки. Хід реакції Готують розведення досліджуваних субстратів. До розчину хлориду натрію додають сироватку крові людини у співвідношенні 1:2 або 1:10. Вносять в кювету 1 5 мл свіжовиготовленої суспензії мікрокока 0 5 мл розчину хлориду натрію 0 3 М 1 мл сироватки крові у відповідному розведенні і вимірюють величину екстинції при 540 нм через 15 сек і 180 сек. 27 Вираховують різницю екстинції і по калібровочній кривій визначають концентрацію лізоциму в мкг/мл. 4.2. Клітинні реакції клітинний імунітет 4.2.1 Реакція гіперчутливості повільного типу РГПТ /10 20/ Ця реакція є моделлю для визначення спроможності сенсибілізованих лімфоцитів виділяти лімфокіни зокрема фактор який пригнічує міграцію макрофагів і тестування функції макрофагів як ефекторів клітинного імунінету. Принцип методу Інтенсивність РГПТ визначають по величині набряку у місці повторного введення антигену. Реактиви 1. Фізіологічний розчин натрію хлориду 2. Еритроцити барана Хід реакції Експериментальних тварин сенсибілізують одноразовим внутрішньочеревним введенням еритроцитів барана ЕБ . Мишам вводять 106 щурам 107 ЕБ в об‘ємі 0 5 мл фізіологічного розчину натрію хлориду. Дослідний препарат вводять після сенсибілізації. Через 5 діб після сенсибілізації тваринам в підошву задньої лівої лапи дослідної вводять 108 еритроцитів барана в 0 02-0 05 мл фізиологічного розчину завершальна ін'єкція а в праву контрольну лапу вводять фізиологічний розчин натрію хлориду в такому ж об'ємі. Облік реакції Оцінку реакції проводять через 24 або 48 годин. Визначають величину набряку вимірюють товщину лап за допомогою мікрометра та визначають різницю мас дослідної Д і контрольної К лап. Для цього обидві лапи відрізають вище п'яточного суглоба після евтаназії тварин. Індекс реакції ІР обчислюють для кожної тварини за формулою: ІР= Д – К х100% 28 К Контрольні групи : - тварини які отримували тільки еритроцити барана; - інтактні тварини які не були імунізовані але отримали завершальну дозу еритроцитарного антигену. 4.2.2. Реакція трансплантат проти хазяїна РТПХ /10 21/ РТПХ дозволяє оцінити цитотоксичну функцію лімфоцитів Т-кіллерів NК-клітин які забезпечують протипухлинний і противірусний імунітет. Принцип методу Інтенсивність РТПХ оцінюють по величині регіональних лімфовузлів в ділянці введення ефекторних лімфоцитів. Реагенти 1. Миші лінійні СВА або С57Вl/6 2.Миші-гібриди 1-го покоління СВА х С57Вl/6 F1 Постановка реакції Мишам-гібридам F1 в подушечку задньої лапи туберкуліновим шприцем вводять 1х106 - 25х106 клітин селезінки або лімфовузлів батьківського генотипу наприклад С57Вl/6 . В контрлатеральну лапу вводять такуж кількість сингенних лімфоцитів отриманих від тварин генотипу СВА х С57Вl/6 . На 8 добу тварин забивають і визначають масу підколінних лімфовузлів в дослідній і контрольній кінцівках. Облік реакції Для кількісної оцінки реакції визначають індекс збільшення лімфоузлів ІЗЛ по формулі: ІЗЛ= Маса лімфовузлів дослідної кінцівки 29 Маса лімфовузлів контрольної кінцівки Для мишей СВА х С57Вl/6 ІЗЛ становить 3 4 - 15 9 в залежності від дози імплантованих клітин. 4.2.3. Визначення кількості лімфоцитів та іх субпопуляцій. Для визначення кількості Т- В-лімфоцитів та їх субпопуляцій в імунології використовують широкий асортимент методів різної складності. Для визначення Т- і В- лімфоцитів застосовують метод розеткоутворення. Феномен розеткоутворення був вперше описаний Nota і Zaalberg в 1964 році який обумовлений взаємодією мембранних рецепторів лімфоцитів з індикаторними клітинами найчастіше з еритроцитами барана . По кількості еритроцитів адсорбованим одним лімфоцитом судять про ступінь активності Т- і В-клітин оскільки феномен розеткоутворення обумовлений густиною рецепторів на їх поверхні. Визначення Т-лімфоцитів проводять в реакції Е-РОК В-лімфоцитів - ЕАС-РОК /10 19/. Стабільність отриманих результатів методом розеткоутворення залежить від ряду умов: використання силіконових або пластикових пробірок стандартних реактивів точного дотримання умов постановки реакції обережного перемішування дотримання вказаної температури та часу інкубації а також швидкості центрифугування. Для визначення кількості лімфоцитів та їх популяцій широко використовують імунофлуоресцентний метод результати якого можна оцінювати за допомогою мікроскопа візуально або проточного цитофлуориметра /22/. Принцип ІФМ пов‘язаний з утворенням специфічного сполучення антитіл з мембранними антигенами живих клітин які є в суспензії. В прямих методах ІФМ використовують специфічні до клітинних антигенів антитіла які кон'юговані з флуоресцентною міткою. В непрямих методах ІФМ використовують спочатку немічені антитіла до клітинних антигенів а потім мічені флуорохромом антитіла до імуноглобулінів. Непрямі методи чутливіші ніж прямі. 30 Для того щоб запобігти кеппінгу та шедингу злущування антигенів після взаємодії з антитілами до суспензії додають 0 2% розчин азиду натрію. Дослідження проводять на лімфоцитах периферичної крові або клітинах лімфоїдних органів. Лімфоцити крові та клітини лімфоїдних органів вилучають загальноприйнятими методами /23/. В рутинних токсикологічних дослідження рекомендується використовувати цитохімічні методи визначення кількості Т- В- і “нульових” лімфоцитів та популяцій Т-лімфоцитів за допомогою методів наведених нижче. 4.2.4. Визначення активності кислої фосфатази методом азосполучення /24/ Кисла фосфатаза локалізується в лізосомах переважно в нейтрофілах і лімфоцитах крові. Підвищення фермента у лімфоцитах спостерігається при сенсибілізації й алергічних захворюваннях. Даний метод дає можливість визначити не тільки активність фермента але дозволяє судити про функціональний стан лізосомального апарата в лейкоцитах і проникливість мембран й провести ідентифікацію Т- В- і “нульових” лімфоцитів. Принцип методу Кисла фосфатаза розщеплює нафтол-фосфат при цьому утворюється вільний альфа-нафтол який вступає в реакцію азосполучення з солями діазонію або парарозаніліном при рН 5 2. В результаті утворюються яскравочервоні гранули або дифузне забарвлення в лімфоцитах та нейрофілах. Реактиви 1. 10 % розчин нейтрального формаліну. 2. Нафтол-AS-Bi-фосфат або нафтол-AS-MX-фосфат. 3. Диметилформамід. 4. 0 1 М розчин оцтовокислого натрію 1 36 г оцтовокислого натрію на 100 мл дистильованої води . 5. 2 М розчин соляної кислоти 20 64 мл концентрованої соляної кислоти додають до 79 36 мл дистильованої води . 31 6. Реактив парарозаніліну 4 % розчин фуксину або фуксинсірчанистої кислоти в гарячому 2 М розчині соляної кислоти . 7. 4 % водний розчин азотнокислого натрію. 8. 1 % розчин метиленового зеленого. Фарба Романовського-Гімзе або 1 % розчин метиленового синього. 9. Інкубаційне середовище готують перед застосуванням таким чином: Готують розчин А 20 мг нафтол-AS-Bi-фосфату або нафтол-AS-MX-фосфату розчиняють в 0 5 мл диметилформаміда та 40 мл 0 1 М розчину оцтовокислого натрію . Розчин Б діазотований парарозанілін готують змішуванням 8 крапель парарозаніліна і 8 крапель 4 % розчину азотнокислого натрію. Розчин А змішують з розчином Б фільтрують. рН розчину повинен бути в межах 5 2-5 4. При рН більше 5 4 розчин можна підкислити декількома краплями 1 М розчину соляної кислоти. Хід реакції Мазки крові висушують на повітрі та фіксують в парах 10 % розчину нейтрального формаліну 3 хв. Промивають у проточній воді висушують. Сухі мазки крові розміщують в інкубаційному середовищі і витримують в термостаті при 37оС протягом 3-х годин. Потім мазки промивають в дистильованій воді. Ядра клітин дофарбовують одним з фарбників ядер реактив №8 . Після дофарбування ядер мазки промивають дистильованою водою і висушують. Облік реакції Активність ферменту виявляється у вигляді яскравочервоних гранул або дифузного забарвлення в нейтрофілах і лімфоцитах. Облік реакції проводять за формулою Астальді і Верга: ах0 + бх1 + вх2 + гх3 + дх4 СЦК = --------------------------------------------------- де 100 СЦК - середній цитохімічний коефіцієнт цифри - ступінь інтенсивності реакції букви - число клітин з тою чи іншою інтенсивністю забарвлення 100 - число підрахованих клітин. 32 В цих же мазках проводять цитохімічну ідентифікацію Т- В- та “нульових” лімфоцитів. При цьому виділяють 3 типи реакції в лімфоцитах: 1. Відсутність продукту реакції на кислу фосфатазу ферментонегативні клітини або В-лімфоцити ; 2. Поодинокі 1-4 рідше більше яскраві чітко окреслені великі або середніх розмірів гранули Т-лімфоцити ; 3. Множинні дрібні нечітко окреслені гранули часто на фоні дифузного забарвлення “нульові” лімфоцити . Визначення типів реакції проводять в 100 лімфоцитах. Результати виражають у відсотках або абсолютних величинах Г/л . Абсолютну кількість Т- В- і “нульових” лімфоцитів можна розрахувати за формулою: АхВхСх0 001 де А - кількість лейкоцитів в Г/л; В - процент усіх лімфоцитів; С - процент популяцій лімфоцитів Т- В- або “нульових” ; 0 001 - коефіцієнт перерахунку в Г/л. 4.2.5. Визначення активності кислої неспецифічної естерази /25/ Фермент кисла неспецифічна естераза локалізується головним чином у лізосомах лімфоцитів і гідролізує ефіри карбонових кислот. Метод дозволяє за інтенсивністю і характером реакції ідентифікувати субпопуляції Т-лімфоцитів: Т-хелпери і Т-супресори. Принцип методу Із сполуки альфа-нафтилацетату при кислому рН під впливом кислої неспецифічної естерази утворюється вільний нафтол який дає кольорове забарвлення з парарозаніліном. Реактиви 1. 10 % розчин нейтрального формаліну. 2. Альфа-нафтилацетат натрію. 33 3. Ацетон х.ч. 4. 4 % водний розчин нітриту натрію готують перед використанням . 5. 4 % розчин парарозаніліну фуксин для фуксинсірчанистої кислоти на 1 М розчині соляної кислоти . 6. 0 067 М фосфатний буфер 9 51 г натрію фосфорнокислого двозаміщеного та 7 035 г натрію фосфорнокислого однозаміщеного розчинити в дистильованій воді і довести об`єм до 1 л . 7. 2 М розчин їдкого натру. 8. Інкубаційне середовище готують перед застосуванням : Розчин А: 10 мг альфа-нафтил ацетату натрію розчиняють у декількох краплях ацетону і змішують з 40 мл 0 067 М фосфатного буферу. Розчин Б: 1 мл 4 % розчину нітриту натрію змішують з 1 мл 4 % розчину парарозаніліну проводять гексазотування у пробірці . Розчини А та Б зливають фільтрують та доводять рН інкубаційного середовища до 5 8 за допомогою 2 М розчину їдкого натру. 10. 1 % розчин метиленового зеленого. Хід реакції Свіжовиготовлені і висушені на повітрі мазки крові або відбитки тимуса і селезінки фіксують в парах 10 % розчину нейтрального формаліну 3 хв. Зафіксовані мазки інкубують при кімнатній температурі в інкубаційному середовищі № 8 впродовж 5 годин. Після інкубації мазки промивають дистильованою водою і фарбують 1 % розчином метиленового зеленого. Облік реакції Активність кислої неспецифічної естерази виявляється тільки в лімфоцитах у вигляді гранул. Локалізована великогранулярна реакція - Т-лімфоцити супресори; реакція слабка дифузна дрібногранулярна - Т-хелпери. Визначення реакції проводять в 100 лімфоцитах. Результати реакції виражають у процентах або в абсолютних величинах Г/л . Розрахунок проводять за формулою: АхВ X = ---------------- де 34 100 X - абсолютна кількість окремих субпопуляцій Т-лімфоцитів Т-хелперів або Т-супресорів А - кількість Т-лімфоцитів в Г/л В - процент Т-хелперів або Т-супресорів 100 - кількість підрахованих лімфоцитів. 4.2.6. Реакція бласттрансформації лімфоцитів РБТЛ під впливом Т- та В-клітинних мітогенів /20 26 27/. Принцип методу Метод грунтується на здатності лімфоцитів до диференційного клітинного ділення під впливом антигенного стимулу in vitro. Інтенсивність реакції визначають за кількістю бластних форм клітин які діляться в культурі. Метод перший /26/ Реактиви 1. Гепарин сухий без консерванта “Спофа” Чехія 2. Сироватка без консерванта великої рогатої худоби або ембріональна теляча 3. Середовище Ігла з глютаміном 4. Стандартні мітогени ФГА КонА ЛПС та інші 5. Пеніцилін стрептоміцин 6. Метанол 7. Льодяна оцтова кислота 8. Фарба Романовського Хід реакції Стерильно готують культуральне середовище яке містить 80 мл середовища Ігла 20 мл сироватки 200 ЕД/мл пеніциліна і 100 ЕД/мл стрептоміцина. Середовище ділять на 2 рівні частини. До одної з них додають мітоген 20 мкг мітогену на 1 мл середовища друга потрібна для контролю. 35 В стерильні дослідні пробірки асептично розливають по 4 мл середовища з мітогеном в контрольні - по 4 мл середовища яке не містить мітоген. В умовах асептики стерильною піпеткою змоченою розчином гепарину 500 ЕД/мл або 1 г сухого перпарата на 6 мл дистильованої води беруть кров і вносять по 0 2 мл в контрольну і дослідну пробірки. Культуру витримують 72 години в термостаті при 370С бажано в атмосфері 5% СО2 . Після 72-годинної культивації надосадову рідину видаляють осад гомогенізують вносять 5 мл фіксатора 3 частини метанола + 1 частина льодяної оцтової кислоти . Через 10 хвилин вміст пробірок переносять в центрифужні пробірки і центрифугують 15 хвилин при 1000 об/хв. Фіксатор видаляють осад переносять на предметне скло роблять мазок. Мазок висушують на повітрі а потім фарбують 1 частину фарби змішують з 10 частинами дистильованої води по Романовському протягом 40 хвилин. Потім промивають проточною водою. Облік реакції Підраховують в мазку не менше 200 лімфоїдних клітин. Визначають відсоток бластних та перехідних до них форм клітини діаметром 8 - 14 мкм враховують також кількість мітозів. У пробах без мітогену відсоток бластоутворення не перевищує 5 %. Статистично вірогідне збільшення відсотка бласт-трансформації в контрольних пробах тварин які отримували ксенобіотик в порівнянні з інтактними тваринами свідчить про мітогенні властивості ксенобіотика. У дорослої людини через 72 год. після інкубації з ФГА 70 - 90 % лімфоцитів трансформуються в бласти. У дітей до 1 року та у людей похилого віку кількість трансформованих лімфоцитів знижується до 50 - 60 %. Метод другий /20 27/ Реактиви 1 Сироватки ембріонів корів 2. Середовище RРМІ-1640 3. НЕРЕS 4. 2-меркаптоетанол 5. Стандартні мітогени ФГА КонА ЛПС 36 6. 3H-тимідин. 7. Фарба по Романовському-Гімзе Для постановки РБТЛ під впливом мітогенів іп vitro стерильно виділяють спленоцити. Спленоцити у концентрації 2•106/мл культивують у середовищі RРМІ-1640 яке містить 10% інактивованої сироватки ембріонів корів 10 мМ 2-меркаптоетанолу 20 мМ НЕРЕS ФГА 10 мкг/мл або Кон-А 5 мкг/мл або ЛПС 50-100 мкг/мл . Культуру інкубують 72 год при 37 0С. За 4 год до закінчення інкубації до кожної проби вносять по 1 мкКюри 3H-тимідину. Підготовку проб для виміру рівня радіоактивності проводять за загальноприйнятою методикою. Результати подають у вигляді СРМ кількість імпульсів за 1 хв на 106 клітин або індексу стимуляції відношення кількості імпульсів в досліді до кількості імпульсів у контролі /19/. Для визначення функціональної активності Т-клітин можна також використовувати РБТЛ у постановці за методом U.Junge еt а1. /27/ за яким реєстрація результатів реакції проводиться візуально під мікроскопом. Для цього клітини інкубують як і у першому випадку. Потім роблять мазки клітин на предметних скельцях підсушують фіксують 10 хв метиловим або абсолютним етиловим спиртом фарбують за методом Романовського-Гімзе. Під мікроскопом при збільшенні 7х10 8х90 визначають відсоток нестимульованих стимульованих та типових бластних форм лімфоцитів підраховуючи 200-500 клітин лімфоїдного ряду. 4.3. Гуморальні реакції гуморальний імунітет 4.3.1. Визначення титру гетерофільних аглютинінів /26/ Гетерофільні агглютиніни відносяться до нормальних антитіл і є одним із факторів захисту організму - первинного неспецифічного імунітету. Утворюються ці антитіла в результаті спонтанної імунізації антигенами які широко розповсюджені у природі. кількість гетерофільних аглютинінів визначають за допомогою реакції Пауля-Буннеля. Принцип методу 37 Реакція аглютинації базується на здатності антитіл аглютинінів що знаходяться в сироватці крові зклеювати у фізіологічному розчині еритроцити барана. Реагенти 1. Фізіологічний розчин натрію хлориду 2. Еритроцити барана Хід реакції Кров збирають у сухі пробірки відстоюють протягом 15 хв. при температурі 370С. Центрифугують при 3000 об/хв. 10 хвилин. Сироватку вібирають у чисті пробірки. 0 25 мл сироватки після інактивації на водяній бані при температурі 560С протягом 30 хв розводять таким чином: 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128. До кожного розведення додають по 0 5 мл 3 % суспензії еритроцитів барана. Після цього пробірки з розведеннями вміщують на 2 години в термостат при 370С а потім на 24 год. в холодильник. Визначеним титром вважають те розведення при якому ще спостерігається аглютинація еритроцитів. В нормі у здорових дорослих людей кількість гетерофільних аглютинінів зустрічається в середньому у розведенні сироватки 1:16 з коливаннями титру від 1:8 до 1:32. У лабораторних тварин титри гетерофільних аглютинінів нижчі чим у людини - від 1:2 до 1:8. 4.3.2. Визначення титру гемаглютинінів і гемолізинів /28 29/ Для визначення імуномоделюючої дії препарату проводять дослідження гемагглютинінів і гемолізинів після імунізації тварин еритроцитами барана або бактеріальним антигеном. Досліди проводять на нелінійних мишах або мишах ліній СВА С57ВL ВАLВ/с з масою тіла 18-22 г. Імунізацію проводять оптимальною дозою антигену еритроцити барана відмивають фізіологічним розчином і готують 3% завись внутрішньочеревинно одноразово в об'ємі 0 2 мл/20 г маси. 38 Дослідний препарат вводять тваринам у 2-3 дозах токсичній пороговій і недіючій за загальнотоксичними показниками одночасно з імунізацією. На 4-7-й день після імунізації у дослідних тварин збирають кров з орбітального синусу центрифугують 10 хв 1500 об./хв і готують сироватку крові. Принцип методу Реакція аглютинації базується на здатності антитіл аглютининів які знаходяться в сироватці крові імунізованих тварин склеювати у фізіологічному розчині еритроцити барана. а Визначення титру гемаглютинінів /28/ Реагенти 1. Фізіологічний розчин хлориду натрію 2. Еритроцити барана Хід реакції Для того щоб уникнути імунного гемолізу сироватку крові декомплементують підігріванням 30 хв при 56°С. Потім готують ряд послідовних розведень 1:10 1:20 1:40 1:80 і т.д. у пластикових панелях в об'ємі 0 2 мл і додають 0 1 мл 1% зависі еритроцитів барана та залишають при кімнатній температурі. Оцінку реакції проводять через 2-4 год. При позитивній реакції еритроцити що аглютинували вистеляють дно лунки рівномірним шаром мають вигляд парасольки . При негативній реакції усі еритроцити збираються разом і утворюють компактне суцільне коло з рівноокресленими краями. Результати реакції виражають титром антитіл - величиною зворотньою останньому розведенню сироватки яка ще аглютинує еритроцити. Зниження титрів аглютинінів у сироватці дослідних тварин свідчить про пригнічуючу дію препарату на гуморальну ланку імунної відповіді підвищення титру - про стимулюючу дію. 39 В нормі в середньому log2 титру аглютинінів у мишей лінії СВА на 7-й день після імунізації оптимальною дозою еритроцитів барана становить 8 9±0 1 на 15 день - 9 4±0 2; у мишей лінії С57ВL - 7 2±0 2 на 15 день - 7 7±0 2 /16/. б Визначення титру гемолізинів /29/ Реагенти 1. Фізіологічний розчин хлориду натрію 2. Еритроцити барана 3. Комплемент морської свинки Хід реакції Сироватку тварин як і при визначенні гемаглютинінів декомплементують шляхом нагрівання 30 хв при 56°С. Потім готують ряд послідовних розведень 1:10 1:20 1:40 1:80 і т.д. у пластикових панелях в об'ємі 0 2 мл додають 0 1 мл 1% зависі еритроцитів барана і 30 хв інкубують при 37°С. До суміші додають комплемент морської свинки який розводять фізіологічним розчином 1:10. Суміш перемішують і інкубують при 37°С 1 год. Найбільше розведення сироватки яке спричиняє гемоліз еритроцитів визначається як титр гемолізинів. 4.3.3. Виявлення кількості антитілоутворюючих клітин АУК в се- лезінці метод Єрне і Нордіна /19 30/ Принцип методу Метод базується на здатості антиеритроцитарних антитіл гемолізинів які секретуються антитілоутворюючими клітинами імунізованих тварин лізувати в присутності комплемента еритроцити барана поміщені разом з клітинами селезінки в агарозний або агаровий гель. Реагенти 1. Еритроцити барана 2. Агар Дифко 40 3. Середовище 199 4. Комплемент морської свинки 5. Ізотонічний розчин хлориду натрію 6. Розчин Хенкса 7. Карбонат натрію Підготовка реагентів При використанні агара Дифко необхідно видалити домішки промиванням. Для цього 7 г сухого агара вносять в колбу додають 0 5 л дистильованої води і розплавляють агар на кип‘ячій бані до просвітління розчину. Агар виливають у лотки товщина шару - 0 5 см охолоджують розрізають на кубики 0 5х2 см поміщають в ексикатор і заливають дистильованою водою. Відмивають впродовж 10 днів змінюючи воду 2-3 рази в день. В день дослідження готують 0 7% розчин із промитого і попередньо розплавленого агара до 10 мл розплавленого агара додають 8 мл дистильованої води 2 мл десятикратного розчину Хенкса і 2 краплі 7 5% розчину карбоната натрію рН 7 0-7 2 . Розчин агара розливають по 2 мл в пробірки і ставлять у водяну баню 45 оС . Перед застосуванням еритроцити барана тричі відмивають в ізотонічному розчині хлориду натрію центрифугують при 3000 об/хв протягом 5 хв . Із осаду готують 20% суспензію еритроцитів. Хід реакції За 4-5 днів до постановки експерименту проводять імунізацію мишей лінії СВА С57ВL еритроцитами барана внутрішньоочеревинно одноразово в оптимальній дозі 108 в 0 2 мл ізотонічного розчину хлориду натрію. Препарат вводять в різних дозах разом з антигеном. Тварин усипляють ефірним наркозом. Видаляють селезінку готують гомогенат за допомогою гемогенізатора у 5 мл середовища 199. Суспензію клітин фільтрують через капроновий фільтр. Визначають число ядровміщуючих клітин в 1 мл суспензії і у всій селезінці. В пробірки з агаром що знаходяться на водяній бані 45 оС додають 20% суспензії еритроцитів барана із розрахунку 0 027 мл суспензії на 1 мл розчину. 41 Ретельно перемішують і суміш розливають в пробірки по 2 25 мл які попередньо розміщують у водяній бані при 45 оС. Інкубують не більше 20-30 хв. Потім в пробірки добавляють 0 1 мл спленоцитів обережно перемішують щоб уникнути пухирців повітря і швидко виливають у теплі 37 оС чашки Петрі рівномірним шаром. Витримують 10-15 хв. при кімнатній температурі потім ставлять в термостат при 37 оС на 60-90 хв. Після інкубації в кожну чашку вносять по 3 мл комплемента морської свинки. Сухий комплемент розводять ізотонічним розчином хлориду натрію до 1:4 свіжозаморожений – до 1:10 розподіляючи по всій поверхні агара і клітин інкубують чашки в термостаті при 37 оС ще 30-40 хв. Після інкубації комплемент зливають. Визначають кількість макроскопічних зон гемолізу еритроцитів навколо окремих АУК і підраховують число продуцентів антитіл в розрахунку на певну кількість клітин наприклад - 106 або цілий орган. У нормі середнє число АУК в селезінці мишей СВА на 5 добу після імунізації еритроцитами барана складає 160 0?7 0 з розрахунку на 106 спленоцитів мишей С57ВL - 72 0?4 0. 4.3.4. Визначення концентрації імуноглобулінів класів IgG IgА IgМ у сироватці крові за методом Мапсіпі /26 31/ Концентрацію різних класів імуноглобулінів у сироватці крові визначають методом радіальної імунодифузії в гелі. Принцип методу Імуноглобуліни дифундують в агар який містить специфічну сироватку і утворюють кільце преципітації ширина якого прямопропорційна кількості імуноглобулінів. Реагенти 1. Агар Дифко 2. Моноспецифічні антисироватки до імуноглобулінів IgG IgА IgМ Хід реакції 42 Агар відмивають від домішок див. п. 4.3.3 . В цукровій склянці змішують агар з відповідною антисироваткою в співвідношенні 3:1 при 55-56 оС. Швидко виливають агар на пластинки рівним шаром охолоджують. В шарі агару пробойником вирізують лунки діаметром 2 мм який містить відповідну моноспецифічну антисироватку. В кожну лунку вносять по 5 мкл досліджуваної сироватки. В перші 3 лунки вносять стандарти також по 5 мкл у зростаючій концентрації. Пластинку кладуть в ексикатор волога камера в горизонтальному положенні на 24-48 годин при 4 оС або при кімнатній температурі для IgG IgА - 24 год. для IgМ - 48 год. після чого вимірюють діаметр кілець преципітації. Рівень імуноглобулінів визначають за калібрувальною кривою яка виражає залежність між рівнем імуноглобулінів та діаметром кілець преципітації. Підрахунок проводять за формулою І.І.Жури /32/. 4.3.5. Скринінг-тест для оцінки патогенних властивостей циркулюю- чих імунних комплексів ЦІК /33/ Принцип методу Метод грунтується на властивості різних за розміром ЦІК вибірково преципітиюватися 3 % або 4 % розчином поліетиленгліколя ПЕГ . Непрямим показником розміру ЦІК є коефіціент “К” - співвідношення концентрацій ЦІК які осаджує 4 % розчин ПЕГ до концентрації ЦІК які осаджує 3 % розчин. Реактиви 1. 0 1 М боратний буфер рН=8 4 2. 10 % розчин поліетиленглюколю ПЕГ М.м. 6000 в 0 1 М боратному буфері рН 8 4. 3. 0 1 М розчин їдкого натру 0 1 М боратний буфер рН=8 4 готують змішуванням 4 5 об`ємів 0 05 М розчину бури Na2B4O7.10H2О - 19 0 г/л з 5 5 об`ємами 0 2 М розчину борної кислоти Н3ВО3 - 12 37 г/л . Підготовка біологічного матеріалу 43 Кров збирають у сухі пробірки відстоюють протягом 15 хв. при температурі 370С. Центрифугують при 3000 об/хв. 10 хвилин. Сироватку відбирають у чисті пробірки. Хід реакції Сироватку крові розливають по 0 2 мл у дві пробірки № 1 № 2 . Потім у пробірку № 1 приливають 3 3 мл боратного буфера і 1 5 мл розчину ПЕГ а у пробірку № 2 приливають 2 8 мл боратного буфера і 2 мл розчину ПЕГ кінцева концентрація ПЕГ у пробірці № 1 - 3 % № 2 - 4 % . Вміст пробірок ретельно перемішують і вміщують пробірки в холодильник при +40С на 16 годин. Після інкубації пробірки центрифугують при 2000 g та +40С протягом 20 хвилин. Видаляють супернатант до осаду приливають 2 0 мл розчину NaOH та спектрофотометрують при довжині хвилі 280 нм. Кількість ЦІК виражають величиною оптичної густини досліджуваних розчинів. Визначивши рівень ЦІК при 2-х концентраціях ПЕГ вираховують їх співвідношення - коефіціент “К”: К = Е2/Е1 де К - коефіціент співвідношення Е1 - величина оптичної густини при концентрації ПЕГ 3 % Е2 - величина оптичної густини при концентрації ПЕГ 4 %. При “К” < 1 1 - ЦІК вважають великими при “К” >1 5 - малими а при 1 1 < “K” < 1 5 - ЦІК вважають середніми за молекулярною масою. 4.4. Інші показники стану імунної системи 4.4.1. Визначення маси та клітинності лімфоїдних органів Лімфоїдні органи селезінку і тимус виділяють після завершення введення препарату зважують і визначають коефіцієнт маси лімфоїдних органів КМ за формулою: Маса лімфоїдного органу КМ = х 100% Маса тіла тварини 44 Для визначення клітинності роблять певну наважку того чи іншого лімфоїдного органу і гомогенізують у 3% розчині оцтової кислоти. Після гомогенізації тканини органу підраховують кількість каріоцитів у камері Горяєва млн/1 мг тканини . Клітини кісткового мозку отримують з кісток стегна мишей чи щурів. Вилучають кістки стегна відокремлюють їх від м'яких тканин ножицями зрізають епіфізи. Кістковий мозок вимивають шприцем з тонкими голками для внутрішньошкірних ін'єкцій. Клітинну завись пропускають крізь голки різного діаметру. Підраховують кількість клітин у камері Горяєва визначають їх кількість в зависі та загальний вміст у вилученій тканині. 4.4.2. Морфологічні дослідження При вивченні імунотоксичної дії пестицидів в субхронічних та хронічних експериментах проводять морфологічні дослідження лімфоїдних органів селезінки тимуса лімфатичних вузлів з використанням гістологічних гістохімічних та імуногістохімічних методів. Важливим є також дослідження морфологічних змін лімфоїдних органів в дослідах на антигенну стимуляцію еритроцитами барана . Для контролю використовують тварин без імунізації та на тлі імунізації антигеном. В останньому випадку морфологічні дослідження проводять на 7-й день після імунізації еритроцитами барана. Спочатку визначають абсолютну та відносну масу лімфоїдних органів як вказано в п. 4.4.1. Після цього для приготування парафінових зрізів шматочки органів фіксують у 10% розчині нейтрального формаліну та рідині Карнуа. Для приготування напівтонких та ультратонких зрізів фіксацію проводять у 2 5% розчині глутаральдегіду і вподальшому проби занурюють в аралдитепон /34 35/. Обробку експериментального матеріалу проводять у відповідності з загальноприйнятими методами в гістології. При морфологічному дослідженні увагу звертають на розмір органів збереженість їх структури розподіл клітинних популяцій. У лімфовузлах 45 підраховують кількість та визначають розмір гермінативних центрів інтенсивність забарвлення Т-залежних ділянок. Для дослідження морфології органів забарвлення парафінових зрізів проводять гематоксиліном та еозином а аралдитепонових напівтонких зрізів толуїдиновим блакитним /35 36/. Ультратонкі зрізи досліджують за допомогою електронної мікроскопії що дозволяє виявити ультраструктурні зміни на субклітинному рівні. При морфологічних дослідженнях лімфоїдних органів також широко застосовують гістохімічні методи які дозволяють виявити ДНК та РНК у лімфобластних та плазматичних клітинах активність ряду ферментів естерази фосфатази що дає можливість виявити порушення в розподілі клітинних популяцій /35 37/. Використовують також складніші імуноморфологічні імунофлуоресцентні і імуноферментні методи з використанням моноклональних антитіл та мічених антигенів для детального аналізу розподілу клітин в лімфоїдних органах /38/. СПИСОК ДЖЕРЕЛ 1. Петров Р.В. Иммунология / Издание второе стереотипное.- М.: Медицина.- 1987.- 415 с. / 2. Бабаева А.Г. Традиционные и нетрадиционные представления о роли системы иммуногенеза в организме // Вестник АМН СССР.- 1986.- №1.- С.22-28. 3. Вершигора А.Е. Основы иммунологии.- Киев: Вища школа.- 1980.- С. 227-241. 4. Алексеева О.Г. Дуева Л.А. Аллергия к промышленным химическим соединениям.- М.- Медицина.- 1978.- 272 с. 5. Дуева Л.А. Коган В.Ю. Суворов С.В. Штеренгарц Р.Я. Промышленные аллергены. М.- Центр международных проектов госкомприроды СССР- 1989- 203 с. 6. Определение состояния иммунологической реактивности организма при воздействии факторов окружающей среды / Методические рекомендации.- Киев.- 1976. 7. Методы лабораторной специфической диагностики профессиональных аллергических заболеваний химической этиологии. Методические рекомендации.- М.- 1980. 8. Методические указания к постановке исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздушной 46 среде рабочей зоны и атмосферы.- М.-1991. 9. Трахтенберг И.М. Сова Р.Е. Шефтель В.О. Оникиенко Ф.А. Проблемы нормы в токсикологии современные представления и методические подходы основные параметры и константы / Под ред. И.М.Трахтенберга. Издание 2 перераб. и дополн.- М.- Медицина.- 1999.- 204 с. 10. Биохимические иммунологические и биофизические методы в токсикологическом эксперименте Методическое руководство .- Киев.- МЗ СССР ВНИИГИНТОКС.- 1989.- 184 с. 11. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. В.В.Меньшикова.-М.- Медицина.- 1982.- 576 с. 12. Методические рекомендации.- Новосибирск.- 1980.- 15 с. 13. Stelzner A. Иммунологические методы.- М.- Медицина.- 1987.- с. 14. Бумагина Т.К. Шмелев Е.И. // Лаб. дело.- 1981.- N 4.- С.200-202. 15. Киндзельский Л.П. Бутенко А.К. Афанасьева В.В. и др. // Вопросы онкологии.- 1986.- №6.- С.86-87. 16. Goodman H.S. A general method for quantitation of immune cytolys // Nature.- 1961.- V.190.- P.269-272. 17. Зейфарт М. Титрование комплемента // Иммунологические методы / Перевод с немец. под ред. Г.Фримеля.- М.- Мир.- 1979.- С.133-135. 18. Функциональная диагностика в урологии и нефрологии /Киев- Здоров‘я- 1977- С-83-85/. 19. Иммунология: Практикум / Е.У.Пастер В.О.Овод В.Н.Позур Н.Е.Вихоть.- К.- Вища школа.- Изд-во при Киев. ун-те.- 1989.- 304 с. 20. Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля.- М.- Мир.- 1987.- 472 с. 21. Тесепов В. Реакция «трансплантат против хозяина» на мышах гибридах первого поколения /Иммунологические методы/ Под ред. Г.Фримеля-М-Мир-1979-С 182-187. 22. Иммунологические методы исследования / Под ред. И.Лефковитса Б.Перниса.- М.- Мир.- 1988. - 528 с. 23. Лимфоциты. Методы / Под ред. Дж. Клауса; пер. с англ.- М.- Медицина- 1990- 395 с. 24. Кисляк Н.С. Ленская Р.В. Клетки крови у детей в норме и патологии.- М.- Медицина.- 1978.- 176 с. 47 25. Mueller J.et.all. // Europ.J.Immunol.- 1975.- V.5.- №4.- P.270 - 274. 26. Чернушенко Е.Ф. Когосова Л.С. Иммунологические исследования в клинике.- Киев.- Здоров`я.- 1978.- 160 с. 27. Junge U. Hoekstra V. Wolfe L. Dienhardt F. Microtechnique for quantitative evaluation of in vitro lymphocyte transformation // Clin. Exp. Inununol.- 1970.- V.7.- №3.- Р.431-437. 28. Мальберг К. Реакция гемагглютинации // Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля.- М.- Мир.- 1987- 472 с. 29. McGregor D.D. Gowas J.I. The antibody response of rats depleted of lympho-cytes by chronic drainage from the thoracic duct // J. Exp. Med.- 1963.-V.118.- №2.- P.303-320. 30. 30 Jerne N.K. Nordin A.A. Henry C. Cell - bound antibodies.- Wistar Institute Press.- 1963.- 109 p. 31. Методические материалы по экспериментальному фармакологичес-кому и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств. Издание официальное. М.- 1984.- 37 с. 32. Жура И.И. Охримович Л.М. Михайлишин М.С. Бакалюк О.И. Применение математического анализа при количественном определении иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии // Лаб. дело.- 1985.- №2.- С. 123-124. 33. П.В.Стручков Н.А.Константинова В.В.Лаврентьев А.Г.Чугалин // Лаб. дело.- 1985.- N 7.- С.410-412. 34. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники.- Л.- 1969.- 422с. 35. Пирс Е. Гистохимия теоретическая и прикладная. Пер. 2 англ. изд. М.- 1962.- 962 с. 36. Immunotoxicology and immunopharmacology. Editors J.H.Dean M.J. Luster A.E.Munson HarryAmos.- 1985 by Raven Press Books 1185 Avenue of the Amerias New York- 551 p. 37. Гайер Г. Электронная гистохимия / Пер. с нем. И.Б.Бухвалова под ред. и с предисловием проф. Н.Т.Райхлина.- М.- 1974.- 488 с. 38. Diagnostic Immunopathology. 2nd Ed. // Eds R.B.Colvin A.K.Bhan R.T.McCluskey- New York.- 1995.- 820 p. 48